FMR1基因CGG重復(fù)序列頻度與反復(fù)生育失敗或卵巢早衰婦女的相關(guān)性研究

陳蔚琳，金力*，武淑英，張軍，臘曉琳，米鑫，童英，楊悅

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730；2.北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京 100191；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029；4.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054；5.北京兒童醫(yī)院順義婦兒醫(yī)院，北京 101300；6.空軍總醫(yī)院，北京 100142；7.民航總醫(yī)院，北京 100123)

脆性X智力低下1號基因(Fragile X Mental Retardation 1，F(xiàn)MR1)位于性染色體X的末端Xq23.7，其啟動子區(qū)存在著以CGG為單位的動態(tài)三聯(lián)重復(fù)。根據(jù)不同的擴增概率，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)將CGG重復(fù)序列分為四大類[1]：CGG重復(fù)數(shù)在5～44之間定義為“正常型”；45～54之為“中間型”或者“灰區(qū)”；55～199之間為“前突變”(premutation，PM)；200以上為“全突變”(full mutation，F(xiàn)M)。全突變的臨床表型即為脆性X綜合征(Fragile-X Syndrome，F(xiàn)XS)，在臨床上有典型的遺傳性智力低下或自閉癥等表現(xiàn)，常見于男性。女性因為有兩條X染色體，所以常表現(xiàn)為一條X染色體的隨機失活，故智力低下表型較少，但可遺傳至子代。女性PM攜帶者也可以在遺傳至子代時發(fā)生全突變，分娩FXS兒，而自身表型正常。此外由于CGG重復(fù)序列翻譯所形成的物質(zhì)可能以某種方式干擾了胎兒卵巢FMR1基因的轉(zhuǎn)錄，引起該突變基因的攜帶者在出生時即存在卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的下降，其卵巢功能的臨床表型具有高度的異質(zhì)性[2]，可發(fā)生脆性X相關(guān)的卵巢儲備能力下降(Fragile X Associated Diminished ovarian reserve，F(xiàn)XDOR)，表現(xiàn)為不明原因不孕癥或生育力下降，如反復(fù)不明原因流產(chǎn)或IVF失敗等。也可能表現(xiàn)為脆性X相關(guān)的原發(fā)性卵巢早衰(Fragile X Associated Premature Ovarian Insufficiency，F(xiàn)XPOI)[3]，即出現(xiàn)小于40歲的閉經(jīng)。所以目前認(rèn)為FMR1是導(dǎo)致卵巢儲備功能下降甚至卵巢早衰的重要突變基因之一。灰區(qū)主要指那些在遺傳中基因表達(dá)的CGG重復(fù)缺乏穩(wěn)定性的類型，而關(guān)于灰區(qū)的臨床意義目前的數(shù)據(jù)缺乏統(tǒng)一性，有研究發(fā)現(xiàn)“灰區(qū)”與正常核型的患者比較，前者的預(yù)期絕經(jīng)年齡早(約7年)，不孕癥及月經(jīng)周期異常的發(fā)生率高，卵巢早衰發(fā)生率高，而且非整倍體妊娠流產(chǎn)的發(fā)生率高[4]。但也有研究認(rèn)為它并不能用來預(yù)測卵巢儲備功能[5-6]。

我國大陸關(guān)于FMR1基因的研究起于1986年的家系報道[7]，之后由于篩查手段的限制一直沒有開展大規(guī)模的篩查研究。2015年Huang等[8]報道了我國的第一個較大人群的FMR1基因篩查結(jié)果，1 113例漢族人群(534男性和579女性)中有1例女性PM攜帶者。2014年我國學(xué)者也針對卵巢功能低下女性進行了FMR1基因的分布研究，但因為樣本量較小，僅在117名卵巢功能低下的女性中，發(fā)現(xiàn)了一名患有不孕癥的FMR1基因PM攜帶者，未發(fā)現(xiàn)“灰區(qū)”[9]。以上為數(shù)不多的來自中國的報道提示，F(xiàn)MR1基因的中國人群的篩查資料目前仍是空白，而關(guān)于其在卵巢功能低下女性的分布更是貧乏。因此本次研究通過FMR1基因CGG重復(fù)序列的檢測，對首次從基因水平探究中國大陸反復(fù)生育失敗婦女和卵巢功能異常的原因具有非常重要意義，在此特殊人群中進行的一次較大樣本量的篩查，為進一步獲得FMR1基因在我國的正常人群的分布數(shù)據(jù)，提供先期研究數(shù)據(jù)和研究路徑。

資料與材料

一、研究人群

2016年8月至2017年12月開展了全國多中心的橫斷面研究，入選人員為18～45歲的育齡婦女。

入選者根據(jù)異常生育史和卵巢功能分為3組，分別為：A.不明原因反復(fù)生育失敗婦女，包括反復(fù)妊娠失敗或IVF反復(fù)失敗者(2次以上)，不孕癥；B.卵巢早衰患者(40歲之前絕經(jīng))，除外手術(shù)或藥物性原因；C.家族中有自閉癥、不明原因智力低下兒出生史的婦女。

本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意(倫理證書編號HS-856)；入選患者均簽署知情同意書。

二、試驗方法

DNA提?。好课皇茉囌卟扇? ml靜脈全血，外地單位凍存統(tǒng)一快遞，北京市單位當(dāng)日快遞送至北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科進行DNA提取，使用QIAamp全血DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

CGG重復(fù)數(shù)的測定：使用AmplideX試劑盒(Asuragen，美國)，采用熒光PCR技術(shù)，并用毛細(xì)管電泳儀進行擴增產(chǎn)物的分析。PCR體系包含11.45 μl的高GC擴增緩沖液、1.5 μl的FAMM標(biāo)記FMR1引物(包含F(xiàn)引物、R引物和CGG第三引物，其中R引物是唯一的熒光標(biāo)記引物，引物序列見表1)、0.05 μl的高GC聚合酶溶液。PCR體系在分裝進96孔PCR板之前進行混勻和離心。每個PCR孔加入20 ng/μl的DNA模板2 μl，用膜封裝后混勻并離心。將PCR板放入ABI 7500擴增儀進行擴增。樣本擴增條件：98℃熱變性5 min；25個循環(huán)(97℃ 35 s，62℃ 35 s，72℃ 4 min)；72℃最后延伸 10 min。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物在進行瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳前避光保存于-15℃到-30℃之間。擴增產(chǎn)物分析采用ABI的3730XL毛細(xì)管電泳儀和Genemapper4.0分析軟件(3730XL Genetic Analyzers，Life Technology，日本)。

表1 FMR1引物序列

三、統(tǒng)計方法

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0進行處理。在同一個體中FMR1的兩個等位基因(CGG)重復(fù)次數(shù)相對少者定義為allele-1，相對多者定義為allele-2。按照國際慣例[5]，本研究取allele-2的重復(fù)數(shù)進行統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

一、CGG重復(fù)序列分布情況

本研究共入組2 334例反復(fù)生育失敗及卵巢功能異常婦女。其中，A組2 216例，年齡(31.17±4.76)歲(18～47歲)；B組70例，年齡(31.54±6.60)歲(18～46歲)；C組48例，年齡(33.70±4.72)歲(25～45歲)。

共發(fā)現(xiàn)39種不同的CGG重復(fù)數(shù)，最小20，最大200。最常見的CGG重復(fù)次數(shù)是30(718例，占33.8%)和29(669例，占28.7%)，占總的等位基因中62.5%；第三個常見的CGG重復(fù)次數(shù)是36(357例，占15.3%)。CGG重復(fù)次數(shù)<29者共88例(3.94%)，而>36者共130例(5.82%)。具體CGG重復(fù)序列分布見圖1。

圖1 CGG重復(fù)序列分布情況

二、研究人群前突變(PM)及灰區(qū)分布情況

總受檢人群中共發(fā)現(xiàn)16例PM和15例灰區(qū)，未發(fā)現(xiàn)全突變(FM)。PM在總?cè)巳旱陌l(fā)生率為1∶146，其中A組6例(發(fā)生率1∶369)、B組2例(發(fā)生率1∶35)、C組8例(發(fā)生率1∶6)；研究中灰區(qū)的患者均在A組，組內(nèi)發(fā)生率為1∶148。本研究中不同組的PM及灰區(qū)分布見表2。各組PM患者的CGG重復(fù)數(shù)見表3，重復(fù)數(shù)>100的兩例均分布在C組。

表2 研究人群的前突變及灰區(qū)分布情況[n(‰)]

表3 研究人群前突變核型的CGG重復(fù)數(shù)

三、FMR1基因型分析

根據(jù)兩個等位基因(CGG)重復(fù)次數(shù)的不同，F(xiàn)MR1基因分為3種基因型：兩個等位基因重復(fù)次數(shù)均在正常范圍內(nèi)稱為“野生型”；其中一等位基因在正常范圍內(nèi)，而另一個等位基因重復(fù)次數(shù)超出正常范圍的稱為“突變雜合型”(簡稱雜合型)；兩個等位基因均超出正常者稱為“突變純合型”(簡稱純合型)。本研究組的FMR1基因異常均為突變雜合型，無純合型。

討 論

一、FMR1基因在卵巢儲備功能中的分子學(xué)機制

卵巢儲備功能直接關(guān)系到婦女生育能力和妊娠結(jié)局，它是卵巢皮質(zhì)內(nèi)原始卵泡發(fā)育成可受精卵母細(xì)胞的能力。卵巢儲備能力下降是指卵巢內(nèi)存留的卵泡的質(zhì)量和數(shù)量下降。FMR1基因是導(dǎo)致卵巢儲備能力下降的重要基因，而目前關(guān)于CGG重復(fù)序列擴增對于FMR1基因表達(dá)的調(diào)控機制，以及如何影響到卵巢功能的分子機制目前尚不清楚。當(dāng)CGG重復(fù)序列小于45時，F(xiàn)MR相關(guān)蛋白和FMR mRNA的功能穩(wěn)定。而在PM和“灰區(qū)”攜帶者中，由于翻譯的錯誤而導(dǎo)致兩者的不匹配，F(xiàn)MR1相關(guān)蛋白水平下降而FMR1mRNA水平上升，從而發(fā)生細(xì)胞毒性作用，致使出生前卵泡池的卵泡數(shù)量下降。而出生后mRNA誘導(dǎo)的卵巢的顆粒細(xì)胞毒性及間質(zhì)細(xì)胞中FMR多糖甘氨酸[10]的作用，使得卵泡的成熟障礙，凋亡加速，推測可能是女性胚胎期和生后兩個時期的疊加作用，而導(dǎo)致FXDOR和FXPOI的發(fā)生[11]。不過在卵巢早衰的動物模型中發(fā)現(xiàn)PM對始基卵泡沒有作用，而是作用于后期卵泡的成熟和凋亡[12]。所以FMR1基因可能繼FSH、抑制素B及抗苗勒管激素之后，成為預(yù)測卵巢儲備功能的指標(biāo)。

二、FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)在不明原因反復(fù)生育失敗或卵巢早衰人群分布

不明原因反復(fù)生育失敗是卵巢儲備功能低下的一種表型，故本研究A組和B組涉及的人群均為卵巢功能異常人群。在該人群中最常見的CGG重復(fù)次數(shù)是30(33.8%)和29(28.7%)，占總的等位基因的62.5%；第三個常見的CGG重復(fù)次數(shù)是36(15.3%)。所以最終表現(xiàn)為CGG重復(fù)數(shù)的“雙峰現(xiàn)象”。我們的結(jié)果與亞洲人種的CGG分布狀況基本相似[13-14]。環(huán)比大多數(shù)針對西方人群的研究均顯示“單峰”聚集，30和29是最常見的CGG重復(fù)數(shù)[15-16]。而亞洲人種還有34-36的集中趨勢亞峰，而非29-30次單峰。此外CGG重復(fù)數(shù)<29和≥36的比例在亞洲人種中也顯著偏低[17]。

三、FMR1前突變和灰區(qū)在不明原因反復(fù)生育失敗或卵巢早衰人群分布情況

本研究在總受檢人群中共發(fā)現(xiàn)16例PM和15例灰區(qū)，未發(fā)現(xiàn)FM，因此，在該人群中PM的發(fā)生率為1∶146。2014年的系統(tǒng)回顧[18]中PM在女性的發(fā)生率為1∶150～300，男性發(fā)生率為1∶400～850。FMR1基因PM發(fā)生率在不同種族和地域差異較大。但是如果按照人種區(qū)分，高加索人群中表現(xiàn)了較高的PM發(fā)生率，比如西班牙1∶251[19]、法國1∶246[20]、美國1∶382[21]、伊朗1∶113[22]；而目前發(fā)現(xiàn)東亞人種的PM發(fā)生率明顯低于以上數(shù)據(jù)，如中國臺灣15年3 911例低危人群的PM發(fā)生率為1∶1 955[23],韓國5 800例女性篩查結(jié)果為1∶781[24]，而在日本的946例篩查中竟沒有發(fā)現(xiàn)一例PM攜帶者[25]；而在中國大陸漢族人群(2 000例)的篩查中PM的發(fā)生率也與其他東亞人群類似，僅為1∶1 113[8]～1∶1 325[26]。相比之下，本研究在不明原因反復(fù)生育失敗或卵巢早衰的人群中篩查，發(fā)生率明顯高于正常人群的篩查，凸顯FMR1基因在該組人群中篩查意義的深遠(yuǎn)。

本研究PM發(fā)生率最高的是家族中有自閉癥、不明原因智力低下兒出生史的婦女組，高達(dá)1∶6(8/48)，提示對這樣的人群進行FMR1基因的篩查是非常有必要的，對有FXS兒出生史的婦女再次妊娠時需進行FMR1基因的產(chǎn)前診斷，避免再次FXS兒的出生。截至到目前，本研究已經(jīng)成功幫助2名曾分娩FXS患兒的孕婦進行了產(chǎn)前診斷，成功地阻斷第二胎FXS患兒的出生，并發(fā)表了相關(guān)報道[27]。來自于韓國的15年的數(shù)據(jù)[24]也顯示高危婦女組PM的發(fā)生率高達(dá)1∶7.25，而對比低危婦女發(fā)生率僅為1∶1 955，與我們的數(shù)據(jù)非常相似。本研究中卵巢早衰組的PM發(fā)生率也較高，達(dá)1∶35，而反復(fù)生育失敗組的PM發(fā)生率僅為1∶369，但后者的發(fā)生率仍高于上述文獻報道的中國婦女一般人群的PM發(fā)生率[8，26]。通過這兩組與卵巢功能下降相關(guān)的病例數(shù)據(jù)，進一步證明了FMR1基因?qū)τ诼殉补δ芗叭祟惖纳芰λ哂械挠绊憽６槍@一組存在卵巢功能異常的PM患者來說，生育計劃咨詢就顯得尤為重要，這部分患者不但存在著生育的異常，表現(xiàn)為不孕癥、反復(fù)生育失敗、IVF促排卵低反應(yīng)及較低的妊娠率，而且即便是成功妊娠后也要積極支持妊娠同時建議進行產(chǎn)前診斷，如絨毛穿刺或是羊水穿刺，以了解胎兒的FMR1基因情況，及時阻斷FXS患兒的出生。所以對于表現(xiàn)為低生育力的育齡婦女來說，F(xiàn)MR1基因的測定不僅能從基因?qū)用娼忉尶赡艿脑颍瑫r在基因水平做到的優(yōu)生優(yōu)育及計劃生育，優(yōu)化我國人口素質(zhì)，應(yīng)該推薦將其列入FMR1基因篩查人群。

本研究PM攜帶者CGG重復(fù)數(shù)>100者均出現(xiàn)在C組，即家族中可疑FXS患兒組，而卵巢早衰組和反復(fù)生育失敗組的CGG重復(fù)數(shù)均在55～100之間，這個也符合很多文獻發(fā)現(xiàn)的FXPOI的CGG重復(fù)數(shù)規(guī)律，即CGG重復(fù)次數(shù)與絕經(jīng)年齡不存在線形或曲線關(guān)系，處于中等度重復(fù)數(shù)的PM攜帶者(80～100)發(fā)生FXPOI的風(fēng)險更高，在CGG處于59～99范圍內(nèi)時FXPOI的風(fēng)險呈上升趨勢，而在CGG重復(fù)數(shù)>100后，發(fā)生風(fēng)險反而下降。同樣進行促排卵時，CGG重復(fù)數(shù)>100者的卵巢反應(yīng)率及妊娠率反而更高[28]。研究發(fā)現(xiàn)除了CGG重復(fù)數(shù)外，AGG的插入的減少也參與了卵巢功能的下降[29]。

本研究中共發(fā)現(xiàn)“灰區(qū)”患者15例，發(fā)生率為1∶148，且均出現(xiàn)在反復(fù)生育失敗的A組。但與東亞地區(qū)的正常人群“灰區(qū)”發(fā)生率相比并沒有明顯增高的趨勢，如韓國1∶143[24]、中國香港1∶88[26]，所以說“灰區(qū)”對于生育力的評估作用是值得商榷的。針對“灰區(qū)”婦女來說，不推薦進行產(chǎn)前診斷。而基于其在擴增時的不確定性，仍應(yīng)建議她們在生育年齡時盡早完成生育計劃。

綜上所述，本研究通過測定中國反復(fù)妊娠失敗和卵巢早衰婦女FMR1基因的分布情況，獲得了我國特殊人群的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為臨床從基因水平診治卵巢儲備功能下降及卵巢早衰患者打開了新的視窗，F(xiàn)MR1基因無論是作為評估卵巢儲備功能的生物學(xué)指標(biāo)，抑或是幫助醫(yī)生指導(dǎo)PM攜帶者的生育計劃及產(chǎn)前診斷方面都具有非常深遠(yuǎn)的意義，為提高人口素質(zhì)、降低出生缺陷提供切實的方法；同時也為進一步在我國多地展開更大樣本的正常人群的篩查提供了先期的經(jīng)驗。