門靜脈血Angiopoietin-2 mRNA定量檢測與結(jié)直腸癌異時性肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系

劉少平， 胡亞華， 張 海， 何仁勝， 張惠芳

鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)消化內(nèi)科，湖北 黃石 435000

血行播散是結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的主要轉(zhuǎn)移途徑之一，肝臟是其血行轉(zhuǎn)移的重要靶器官；癌細胞主要通過門靜脈系統(tǒng)回流至肝臟，然后再進入全身擴散。30%～50%的CRC患者在根治術(shù)后出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，稱為異時性肝轉(zhuǎn)移,其已經(jīng)成為CRC主要的死亡原因之一[1]。因此，CRC異時性肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測和早期診斷有重要臨床意義。血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2) 是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要特征性分子， 其通過促進腫瘤新生血管形成和腫瘤淋巴管生成作用，促進腫瘤生長發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移。近年研究[1-2]發(fā)現(xiàn),Ang-2還可通過激活腫瘤細胞中MMP-2及α5β1整合素 /整合素相關(guān)激酶/ Akt，GSK-3β/Snail/ E-cad信號通路直接促進腫瘤細胞的遷徙和侵襲，這在腫瘤轉(zhuǎn)移的起始階段就發(fā)揮作用；Ang-2高表達也減少腫瘤細胞的凋亡和導(dǎo)致Vimentin、E-cadherin、Bcl-2、Bax、Cyclin等腫瘤形成相關(guān)蛋白表達量的變化[3]。近年研究[4-9]顯示，外周血Ang-2水平與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。本研究定量檢測CRC患者術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA的表達量，并與術(shù)前外周血中Ang-2 mRNA的表達量進行比較，探討其與CRC異時性肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇黃石市中心醫(yī)院2013年1月至2014年8月經(jīng)病理組織學(xué)確診并行根治性手術(shù)治療的原發(fā)性CRC患者89例，為CRC組，所有患者術(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療，無遠處轉(zhuǎn)移病灶，無其他系統(tǒng)惡性疾病，男46例，女43例，年齡(57.9±12.1)歲。結(jié)腸癌58例，直腸癌31例，高、中分化者63例，低、未分化者26例，侵及T1+T2者32例，侵及T3+T4者57例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者57例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例。黏液腺癌、印戒細胞癌納入低分化腺癌中。所有患者術(shù)后治療按2010版衛(wèi)生部結(jié)直腸癌診療規(guī)范進行[10]。

1.2術(shù)后隨訪所有患者術(shù)后隨訪3年，方法為門診復(fù)診和電話隨訪，每3～6個月隨訪1次；無隨訪丟失病例；術(shù)后定期復(fù)查電子結(jié)腸鏡、肝臟MRI等檢查；術(shù)后隨訪3年中診斷CRC異時性肝轉(zhuǎn)移患者15例，CRC復(fù)發(fā)患者26例，未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者63例；記錄術(shù)后生存時間，術(shù)后生存期<3年者24例，≥3年者65例。

1.3標本的處理和RNA的抽提抽取CRC患者手術(shù)前1 d清晨空腹肘靜脈血5 ml，手術(shù)治療中經(jīng)胃網(wǎng)膜或腸系膜下靜脈插管10～15 cm至門靜脈，抽取血液5 ml，均肝素抗凝，用淋巴細胞分層液(Amersham Biosciences公司的Ficoll-Paque PLUS)分離外周血單個核細胞，加入Trizol 1 ml (Invitrogen公司)后，用經(jīng)典的方法抽提總RNA。

1.4逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用RNA電泳證實RNA未降解，測定所抽提RNA濃度。Oligo dT18(10 pmol)1 μl加入RNA 2 μg，混勻后置65 ℃水浴5 min；迅速取出轉(zhuǎn)置冰上，順序加入5×緩沖液5.0 μl、10 mmol/L dNTPs 2.5 μl、200 U/ μl逆轉(zhuǎn)酶(MMLV)1.0 μl、400 U/μl RNA酶抑制劑0.5 μl，最后加DEPC水至總體積25 μl。反應(yīng)條件為：37 ℃ l h，95 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.5Ang-2mRNA熒光定量RT-PCR檢測以管家基因GAPDH為內(nèi)參照。應(yīng)用Universal PCR Mater Mix試劑盒(ABI 公司產(chǎn)品)在ABI Prism 7300型實時熒光定量PCR儀上檢測，以cDNA為模板擴增Ang-2 mRNA和GAPDH基因。用ABI 公司的引物設(shè)計軟件Primer Express 設(shè)計引物。Ang-2上游引物為5′-CAGAGGGCTGCAAGTGCTGGAGAACA-3′，下游引物5′-GAGGGAGTGTTCCAAGAGCTGAAGT-3′；GAPDH上游引物為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。實時熒光定量PCR儀采集hTERT mRNA及內(nèi)參照GAPDH擴增各循環(huán)熒光信號，以SDS 1.4軟件分析其△△Ct值及相對表達量(relative quantity, RQ)，RQ= 2-△△Ct。以GAPDH為內(nèi)對照，計算Ang-2 mRNA的表達量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，兩樣本比較用t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析，多因素分析采用Cox回歸模型。Log-Rank法比較生存率的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CRC患者的Ang-2mRNA表達水平術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移組術(shù)前外周血術(shù)及中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量均明顯高于術(shù)后無異時性肝轉(zhuǎn)移組 (t=3.390，5.352,P均<0.01)；術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移組術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量顯著高于其術(shù)前外周血中Ang-2 mRNA表達量(t=2.418，P<0.05)；術(shù)后無異時性肝轉(zhuǎn)移組術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量與其術(shù)前外周血中Ang-2 mRNA表達量比較，無明顯升高(t=1.311，P>0.05)(見表1)。

注：與術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移組比較，aP<0.01；與術(shù)前外周血比較，bP<0.01，cP>0.05。

2.2CRC患者術(shù)中門靜脈血Ang-2mRNA表達量與其臨床病理特征的關(guān)系CRC患者術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA的表達在腫瘤分化程度、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有術(shù)后復(fù)發(fā)、術(shù)后生存期長短中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，在不同腫瘤部位差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.3CRC患者異時性肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險的單因素分析以CRC患者術(shù)中門靜脈血和術(shù)前外周血Ang-2 mRNA相對表達量的均值5.85和4.56為界值，將其分為Ang-2 mRNA的高表達組和低表達組。單因素分析顯示，腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前外周血Ang-2 mRNA表達、術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達均與異時性肝轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)(見表3)。

注：結(jié)直腸多發(fā)腫瘤病灶時，直徑取各病灶最大徑之和。

表3 89例CRC患者異時性肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險的單因素分析Tab 3 Univariate analysis of the risk of heterochronous liver metastasis in 89 patients with CRC

續(xù)表3

2.4CRC患者異時性肝轉(zhuǎn)移的多因素分析Cox多因素回歸分析顯示，腫瘤浸潤深度、術(shù)前外周血Ang-2 mRNA表達量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量均與異時性肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，是其獨立危險因素。且術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量的危險度高于術(shù)前外周血Ang-2 mRNA表達量(見表4)。

表4 CRC患者異時性肝轉(zhuǎn)移的Cox多因素回歸分析Tab 4 Cox multivariate regression analysis of heterotopic liver metastasis in CRC patients

2.5術(shù)中門靜脈血Ang-2mRNA表達量與CRC患者術(shù)后生存期的關(guān)系以CRC患者門靜脈血Ang-2 mRNA表達量的均值5.85為界值，將89例患者分為高表達組(32例)和低表達組(57例)。高表達組術(shù)后1年、2年、3年的生存率分別為93.7%、71.9%、53.1%，低表達組術(shù)后1年、2年、3年的生存率分別為96.4%、91.2%、84.2%；兩組術(shù)后1年生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.359，P>0.05)；兩組術(shù)后2年和3年的生存率分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.467，P<0.05；χ2=10.056，P<0.01，見圖1)。

圖1 Ang-2 mRNA高表達組與低表達組CRC患者術(shù)后生存曲線比較Fig 1 Comparison of postoperative survival curves between high and low Ang-2 mRNA expression groups

3 討論

目前對CRC患者異時性肝轉(zhuǎn)移的早期診斷尚缺乏明確的生物化學(xué)、免疫學(xué)指標[1]，尋找敏感性和特異性均較高的CRC肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測診斷指標具有重要的臨床價值。近期研究[1]發(fā)現(xiàn)，血清中一些特殊的生長因子水平的升高可成為CRC肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標。

與腫瘤組織和細胞中Ang-2表達一樣，外周血Ang-2水平升高也與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。WANG等[5]采用ELSIA方法檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血清Ang-2顯著高于正常對照組，且與TNM分期、淋巴結(jié)侵犯、遠處轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。BARRON等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者外周血中Ang-2水平明顯升高，并促進癌細胞的生長與轉(zhuǎn)移。HACKER等[7]應(yīng)用ELISA方法檢測進展期胃癌患者血漿中Ang-2水平，發(fā)現(xiàn)其顯著升高，且與肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。GüVELI等[8]研究顯示，鼻咽和喉癌患者血清Ang-2水平顯著升高，促進腫瘤發(fā)展。COELHO等[9]研究證實血清Ang-2水平升高與非小細胞性肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。我們的研究[4]也發(fā)現(xiàn)即使在早期胃癌，血清Angiopoietin-2 水平升高參與促進了淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，CRC異時性肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)中門靜脈血與術(shù)前外周血的Ang-2 mRNA表達量分別高于無異時性肝轉(zhuǎn)移患者。這提示術(shù)中門靜脈血與術(shù)前外周血中Ang-2 mRNA高表達均與CRC異時性肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。異時性肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量明顯高于其術(shù)前外周血Ang-2 mRNA表達量，而無異時性肝轉(zhuǎn)移患者兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量升高與CRC異時性肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系，較術(shù)前外周血Ang-2 mRNA表達量更密切；術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量越高，CRC異時性肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險也越高，術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA可能較術(shù)前外周血Ang-2 mRNA更敏感地反映CRC患者異時性肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險程度。本研究結(jié)果還顯示，CRC患者術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量與腫瘤分化程度、腫瘤大小、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，這表明門靜脈血Ang-2 mRNA表達量越高，腫瘤惡性程度越高，體積也越大，更易出現(xiàn)侵襲、轉(zhuǎn)移，這與WANG等[5]以血清Ang-2為檢測對象的研究結(jié)果相似。CRC異時性肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險的單因素和多因素分析均顯示，術(shù)前外周血與術(shù)中門脈血Ang-2 mRNA表達量均是CRC患者異時性肝轉(zhuǎn)移的獨立危險因素；術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA的危險度明顯高于術(shù)前外周血Ang-2 mRNA，這表明前者比后者能更準確、敏感地預(yù)測術(shù)后CRC異時性肝轉(zhuǎn)移。

近年研究顯示，腫瘤組織中和外周血中Ang-2表達量變化與預(yù)后密切相關(guān)。KIM等[11]和HONG等[12]均應(yīng)用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)CRC患者腫瘤組織中Ang-2表達量明顯升高，是預(yù)后的獨立評價指標。CAADAS等[13]研究顯示，血清Ang-2含量是小細胞性肺癌不良預(yù)后的評價指標。HACKER等[7]采用Cox回歸模型多因素分析顯示，血漿Ang-2水平是進展期胃癌預(yù)后評價的一種獨立新型指標。COELHO等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血清Ang-2是非小細胞性肺癌預(yù)后的獨立評價指標，而血清VEGF不是。本研究顯示，術(shù)后生存期<3年和術(shù)后復(fù)發(fā)的CRC患者術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量分別顯著高于術(shù)后生存期≥3年和無術(shù)后復(fù)發(fā)的患者；同時，術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA高表達患者與低表達患者比較，其術(shù)后2、3年生存率明顯降低，術(shù)后生存期更短，這表明術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量與CRC術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)，可成為其評價指標。

綜上，術(shù)中門靜脈血Ang-2 mRNA表達量與CRC患者的重要臨床病理特征及其異時性肝轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，對CRC異時性肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值比外周血Ang-2 mRNA更高，可成為CRC術(shù)后預(yù)后的評價指標。