CTLA-4基因多態(tài)性與乙肝相關(guān)性肝硬化患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)性分析

顏 敏， 瞿 新

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院檢驗科，湖北 十堰 442000

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球嚴峻公共衛(wèi)生問題，調(diào)查顯示，我國乙肝表面抗原(HBsAg)陽性率超過5%，且HBV感染是導(dǎo)致肝炎、肝硬化及肝癌的主要原因，約75%的肝硬化均與HBV感染有關(guān)[1]。肝移植術(shù)是目前治療乙肝相關(guān)性終末期肝病的主要方案，但術(shù)后移植成功率較低，復(fù)發(fā)風(fēng)險大，且HBV復(fù)發(fā)及再感染是引起乙肝相關(guān)性肝硬化患者肝移植術(shù)后死亡的主要原因[2]。但目前尚未明確乙肝相關(guān)性肝硬化肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的確切機制，既往研究[3]多認為與抗病毒治療有關(guān)，近年來發(fā)現(xiàn)免疫機制與肝病復(fù)發(fā)有相關(guān)性[4]。細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)系免疫球蛋白超基因家族成員，與CD28同源性較高，常以二聚體形式表達于T細胞表面，對T細胞增殖及免疫反應(yīng)均有負向調(diào)節(jié)作用。B7-CTLA-4通路共刺激信號的變化與自身免疫相關(guān)性疾病發(fā)病存在緊密聯(lián)系，CTLA-4與B7結(jié)合可抑制T細胞活化，降低機體對惡性腫瘤的免疫能力，導(dǎo)致疾病進展。CTLA-4基因存在多個遺傳多態(tài)性位點，決定了個體免疫強度的差異性，早期已有研究[5]證實，CTLA-4基因多態(tài)性與糖尿病、甲狀腺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病發(fā)病有關(guān)，但對乙肝相關(guān)性肝硬化患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)與CTLA-4基因多態(tài)性的關(guān)系尚少見報道?；诖?，為探討CTLA-4基因多態(tài)性與乙肝相關(guān)性肝硬化患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，現(xiàn)對收治的46例患者的臨床資料進行回顧性分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2007年1月至2014年2月于我院接受肝移植術(shù)治療的46例乙肝相關(guān)性肝硬化患者的臨床資料。男29例，女17例，年齡(51.6±5.7)歲(20～76歲)。納入標準：均符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會慢性乙型肝炎防治指南中乙肝相關(guān)性肝硬化診斷標準[6]；乙肝五項中HBsAg陽性，或HBsAg陰性但HBV-DNA陽性或有明確乙型肝炎病史；伴明顯肝功能損傷表現(xiàn)；影像學(xué)證實存在肝硬化征象；完成肝移植治療，術(shù)前均留取外周血標本，術(shù)中留取肝臟組織標本，且臨床及隨訪資料完整。排除標準：其他原因所致肝硬化者；習(xí)慣性飲酒史者；血吸蟲感染病史者；合并嚴重心腦血管疾病者；合并精神疾病者；合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；臨床及隨訪資料不完善者。本組所有患者在肝移植前后均接受拉夫米定+乙肝免疫球蛋白治療，術(shù)后均采用免疫抑制劑治療，術(shù)后確診乙肝復(fù)發(fā)患者均接受高效價乙肝免疫球蛋白治療方案。

1.2乙肝復(fù)發(fā)診斷標準(1)術(shù)后HBsAg陽性；(2)術(shù)后血清HBV DNA陽性；(3)術(shù)后肝組織活檢HBsAg陽性；(4)術(shù)后肝組織活檢HBV DNA陽性；滿足上述之一均可確診。

1.3主要儀器與試劑DNA抽提試劑盒(德國凱杰公司)，Taq酶系統(tǒng)(北京天根公司)，CTLA-4引物設(shè)計及合成(上海生工生物有限公司)，限制性內(nèi)切酶、10×緩沖液(美國MBI公司)，F(xiàn)icoll分離液(上海生工生物有限公司)，DNA Marker(大連Takara公司)，瓊脂糖(上海Promega公司)，dNTP(上海Sangon公司)。全自動377型DNA測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Mastercycler gradient DNA擴增儀、微量加樣器(德國Eppendorf公司)，PT 200DNA自動擴增儀(美國MJ Research公司)，紫外分光光度計(美國Amersham Pharmacia Biotech公司)，臺式高速冷凍離心機(上海離心機械研究所)，電子天平(日本SHIMADZU公司)，微波爐(廣東格蘭仕公司)，超低溫冰箱(日本SANYO公司)，恒溫循環(huán)水浴箱(丹麥Heto公司)。

1.4方法CTLA-4基因多態(tài)性檢測：采用DNA抽提試劑盒提取外周血DNA，200 μl緩沖液洗滌，重懸全血，分離單個核細胞，加蛋白酶K(質(zhì)量濃度為200 g/L)20 μl，加入Buffer AL 200 μl，震蕩15 s，56 ℃水浴10 min，室溫冷卻，加無水乙醇200 μl，振蕩15 s，移至過濾柱，離心(14 000 r/min)60 s，離心半徑(r)=10 cm，棄濾過液。取凍存肝組織標本20 mg，碾成粉末，溶解，加入蛋白酶K 15 μl消化，十二烷基硫酸鈉(SDS，質(zhì)量濃度為100 g/L)75 μl，攪拌均勻，呈黏稠狀，50 ℃水浴保溫，過夜，充分裂解，消化蛋白，室溫冷卻，加入等體積酚/氯混合溶液，混合均勻，直至呈乳狀，4 ℃離心10 min，吸取上清，加入750 μl異丙醇，室溫搖動均勻，DNA沉淀后，離心10 min，棄上清，加乙醇漂洗2次，離心，棄上清，加水重新溶解DNA，沉淀量少時加乙酸鈉溶液，測定樣本DNA濃度，滿足要求后進行聚合酶聯(lián)(PCR)反應(yīng)，引物設(shè)計參照文獻[7]，上游：5′-ATTGGGATTTAGGAGGACC-3′，下游：5′-AATACAGAGCCAGCCAAGCC-3′。反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μl+鎂離子25 mmol/L 4 μl+脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)10 mmol/L 2 μl+上下游引物各2 μl+基因組DNA 4 μl+Taq聚合酶0.6 μl+雙蒸水30.4 μl，總反應(yīng)體積50 μl，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 5 s，72 ℃ 45 s，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，擴增DNA。采用限制性片段長度多態(tài)性分析法(RELP)檢測CLTA-4基因型，先進行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，總體積20 μl，37 ℃水浴3 h，65 ℃酶滅活20 min，聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)電泳，DNA銀染，采用直接測序法應(yīng)用全自動DNA測序儀測定CTLA-4基因型。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有樣本均進行Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗，單個基因型與組間等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗，計量資料采用t檢驗，基因多態(tài)性與乙肝復(fù)發(fā)風(fēng)險采用Logistic回歸模型進行分析，記錄OR與95%CI，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1乙肝相關(guān)性肝硬化患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)情況乙肝相關(guān)性肝硬化46例，肝移植術(shù)后均隨訪(24.12±2.47)個月；其中9例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為19.57%，復(fù)發(fā)時間(8.41±1.6)個月。

2.2復(fù)發(fā)患者與未復(fù)發(fā)患者基線情況比較復(fù)發(fā)患者性別、年齡、免疫抑制治療方案對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但復(fù)發(fā)患者術(shù)前HBV DNA濃度及術(shù)后HBsAb滴度均低于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 復(fù)發(fā)患者與未復(fù)發(fā)患者基線情況比較Tab 1 Comparison of baseline conditions between recurrence and non-recurrent patients

注：HBsAb為乙型肝炎表面抗體。

2.3復(fù)發(fā)患者與未復(fù)發(fā)患者CTLA-4外顯子49G/A基因型分布各樣本經(jīng)檢驗均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，數(shù)據(jù)有其代表性，肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)患者其CTLA-4+49位點攜帶AA型、C、A型基因頻率(75.00%)高于未復(fù)發(fā)患者(50.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.555，P<0.05)，復(fù)發(fā)患者G、A等位基因出現(xiàn)頻率低于未復(fù)發(fā)患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表2 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者CTLA-4外顯子49 G/A基因型分布Tab 2 Distribution of CTLA-4 exon 49 G/A genotype in recurrence and non-recurrent patients 比例/%

2.4復(fù)發(fā)患者與未復(fù)發(fā)患者CTLA-4啟動子1661A/G基因型分布復(fù)發(fā)患者攜帶AG+GG基因頻率(55.56%)高于未復(fù)發(fā)患者(13.51%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.5乙肝相關(guān)性肝硬化肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)因素分析術(shù)后HBsAb滴度、攜帶GA基因型、攜帶AG+GG基因型均與乙肝相關(guān)性肝硬化肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)，CTLA-4+49位點攜帶GA基因型患者其復(fù)發(fā)風(fēng)險為攜帶其他分型患者的3.041倍，CTLA-4啟動子1661位點攜帶AG+GG基因型患者其復(fù)發(fā)風(fēng)險為攜帶AA分型患者的2.126倍，術(shù)后HBsAb滴度較低的患者其復(fù)發(fā)風(fēng)險為高滴度患者的2.178倍(見表4)。

3 討論

CTLA-4基因為T細胞表面的重要激活分子，常表達于激活T細胞表面，以二聚體形式存在，可與抗原遞呈細胞(APC)表面B7分子相結(jié)合，協(xié)同產(chǎn)生作用，抑制T細胞活化及增生。原始T細胞活化主要依靠CD28、CD80、CD86 B7家族分子相結(jié)合發(fā)揮共刺激作用，而CTLA-4基因?qū)7家族親和力較CD28高，為其關(guān)鍵競爭性拮抗劑，其可通過與B7分子結(jié)合，抑制白介素-2(IL-2)產(chǎn)生，改變T淋巴細胞活化周期。周雙男等[8]表示，B7-CTLA-4通路共刺激信號的變化與自身免疫性疾病的發(fā)病存在重要關(guān)聯(lián)。CAO等[9]指出，自發(fā)性及治療誘導(dǎo)移植物耐受等均與CTLA-4信號通路存在一定的聯(lián)系。且有研究[10]發(fā)現(xiàn)，CTLA-4基因多態(tài)性可影響T細胞抗腫瘤免疫能力。CTLA-4分子基因存在多個遺傳多態(tài)性位點，在決定機體免疫強度差異上有重要作用。目前已被證實，共刺激通路CTLA-4基因遺傳多態(tài)性與自身免疫性肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白斑病、重癥肌無力、移植后排斥反應(yīng)等病理及生理過程均密切相關(guān)[11]。ZHANG等[12]從遺傳免疫學(xué)方面對乙肝發(fā)生病理過程進行研究，發(fā)現(xiàn)CTLA-4基因遺傳多態(tài)性與特定人群乙肝易感性有關(guān)。

表4 乙肝相關(guān)性肝硬化肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)因素分析Tab 4 Analysis of related factors of recurrence after liver transplantation for hepatitis B-associated cirrhosis

乙型肝炎系HBV病毒感染所誘導(dǎo)的病理性免疫損傷，體內(nèi)乙型肝炎病毒的清除主要依靠T淋巴細胞進行調(diào)節(jié)，CTLA4基因缺陷，影響機體對HBV清除能力，減弱其對免疫反應(yīng)的負向調(diào)節(jié)，可能增加肝炎的易感性。目前發(fā)現(xiàn)CTLA-4基因存在6個多態(tài)性位點，其中外顯子1第17密碼子49位點A/G二態(tài)性及啟動子-1661 A/G二態(tài)性與自身免疫性疾病關(guān)系的研究較多[13]。CTLA-4外顯子1區(qū)編碼T細胞膜表面成熟CTLA-4+49位點A等位基因為野生型，易突變形成G等位基因，外顯子第17密碼子編碼的氨基轉(zhuǎn)為丙氨酸，導(dǎo)致蛋白極性發(fā)生改變，降低T細胞對CTLA-4分子蛋白的合成能力，影響T淋巴細胞免疫功能。HUANG等[14]發(fā)現(xiàn)，攜帶CTLA-4+49位點GG基因型者HBV特異性免疫功能較強，感染HBV風(fēng)險低于攜帶該位點其他基因型者。也有研究[15]指出，攜帶CTLA-4+49位點GG基因型乙肝患者在HBV急性感染性更易恢復(fù)。此外，CTLA-4+49位點遺傳多態(tài)性對肝移植術(shù)后受體內(nèi)移植物特異性T細胞免疫強度同樣有其一定程度的影響。KENNEDY等[16]對肝移植患者移植物進行病理活檢發(fā)現(xiàn)其存在與乙肝患者HBV特異性類似的CD4+T淋巴細胞增殖表現(xiàn)，考慮到CTLA-4遺傳基因多態(tài)性可能通過改變乙肝患者HBV特異性免疫強度導(dǎo)致移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)。CTLA-4+49位點攜帶GG型乙肝相關(guān)性肝硬化患者其調(diào)節(jié)性T細胞表面CTAL-4分子表達水平低，CD4+T細胞活性上調(diào)且數(shù)量上升，可強化HBV細胞免疫，減少復(fù)發(fā)風(fēng)險。

本研究共納入46例乙肝相關(guān)性肝硬化肝移植術(shù)后患者，隨訪發(fā)現(xiàn)9例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為19.57%，與早期研究[17]報道的10%～18%相近。并對患者CTLA-4外顯子1第17密碼子49位點A/G及啟動子-1661 A/G基因多態(tài)性進行檢測發(fā)現(xiàn)，移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)患者其CTLA-4+49位點攜帶AA型基因頻率高于未復(fù)發(fā)患者，其1661位點攜帶AG+GG基因頻率高于未復(fù)發(fā)患者，而其+49位點攜帶GG基因所占比例較未復(fù)發(fā)者低，與上述結(jié)論相符，主要可能與攜帶CTLA-4+49位點AA型基因患者其體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞表面CTLA-4分子功能缺陷，影響術(shù)后機體對HBV特異性細胞免疫作用，可能增加乙肝復(fù)發(fā)風(fēng)險。同時1661位點攜帶AG+GG基因型患者其復(fù)發(fā)風(fēng)險較攜帶AA基因頻率患者低，提示CTLA-4 1661位點基因突變可能參與乙肝相關(guān)性肝硬化患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的病理過程，而+49位點GG型基因可能為受體乙肝復(fù)發(fā)的重要保護型等位基因，但對其確切機制尚待進一步證實。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)后HBsAb滴度與移植術(shù)后患者乙肝復(fù)發(fā)有關(guān)，與HALAZUN等[18]研究結(jié)論相同。但本研究納入病例數(shù)量有限，且隨訪時間尚短，后續(xù)需擴充病例，延長隨訪時間，進一步對其分子學(xué)機制進行研究。

綜上所述，乙肝相關(guān)性肝硬化患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)與術(shù)后HBsAb滴度、CTLA-4+49位點及1661位點基因多態(tài)性有關(guān)，其可能通過影響機體免疫調(diào)控參與乙肝術(shù)后復(fù)發(fā)過程，但對其確切分子學(xué)機制尚待深入研究證實。