遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎中的表達(dá)及機(jī)制研究

沈?yàn)t然， 葉 峰， 黨旖旎， 張國新

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江蘇 南京 210000

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一種革蘭陰性微需氧菌，1994年WHO將H.pylori定義為Ⅰ類致癌因子[1]，H.pylori的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)及其毒力因子(CagA、VacA等)均對(duì)胃內(nèi)黏膜有損傷，有研究表明，H.pylori感染是慢性胃炎的重要病因[2]，且其在胃黏膜的炎、癌轉(zhuǎn)化中扮演著重要的角色。遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1(far upstream element-binding protein 1，F(xiàn)UBP1)是一種單鏈核酸結(jié)合蛋白[3]，作為原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[4]，與細(xì)胞的增殖、遷移能力有密切關(guān)系。目前發(fā)現(xiàn)FUBP1在多種腫瘤中表達(dá)異常，并且在胃癌中表達(dá)顯著升高[5-6]。H.pylori是Ⅰ類致癌因子，但目前暫無FUBP1在H.pylori相關(guān)疾病中的研究報(bào)道。本研究旨在探討H.pylori相關(guān)性胃炎中FUBP1表達(dá)水平及其機(jī)制初步探究。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2017年1月至2017年3月就診于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的慢性胃炎患者32例，男13例，女19例，均于內(nèi)鏡下活檢行病理檢查確診，其中H.pylori陽性17例，H.pylori陰性15例。H.pylori感染檢測(cè)采用13C呼氣試驗(yàn)及快速尿素酶試驗(yàn)，兩項(xiàng)檢查均為陽性判定為H.pylori感染陽性，兩項(xiàng)檢查均為陰性則判定為陰性。本研究得到南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者本人同意及簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞株與菌株人低分化胃癌AGS細(xì)胞株、人中分化胃癌SGC7901細(xì)胞株、國際標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序株H.pylori26695野生株由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3H.pylori感染AGS細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞將凍存的H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株22695復(fù)蘇后，接種于含質(zhì)量濃度為50 g/L的脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，于微需氧條件下培養(yǎng)72 h，用含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的培養(yǎng)基配成菌液備用，用分光度計(jì)測(cè)其OD600值(1OD=2×108CFU/ml)；AGS細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞以0.5×106ml-1鋪于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，按MOI(細(xì)菌和細(xì)胞數(shù)量比值)=100∶1的比例向培養(yǎng)皿中加入菌液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下共同培養(yǎng)24 h。

1.4H.pylori-LPS提取將H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株22695菌液通過苯酚、乙醚、RNaseA、DNaseⅠ、蛋白酶K處理提取并純化LPS，并送至廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司檢測(cè)定量(單位換算標(biāo)準(zhǔn)：1 EU=0.4 ng)。并H.pylori菌液提取純化LPS，用高壓滅菌的PBS稀釋成1 g/L備用。

1.5H.pylori-LPS刺激AGS和SGC7901細(xì)胞AGS細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞以0.25×106ml-1鋪于6孔板中，濃度為1 g/L的H.pylori-LPS以終濃度1 μg/ml、10 μg/ml刺激AGS、SGC7901細(xì)胞24 h。

1.6H.pylori、H.pylori-LPS感染小鼠模型構(gòu)建將H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株22695復(fù)蘇后培養(yǎng)72 h，以高壓滅菌的PBS配成混懸液，制成1×109CFU/ml備用，并將1×109CFU/mlH.pylori菌液提取純化LPS，用PBS稀釋成1 ml備用。選擇6周齡C57BL/6雄性小鼠，禁食禁飲24 h，灌胃前6 h以質(zhì)量濃度為20 g/L的NaHCO3溶液0.3 ml灌胃預(yù)處理，對(duì)照組0.3 ml PBS液，隔日1次，連續(xù)灌胃3次；H.pylori組0.3 mlH.pylori菌液，隔日1次，連續(xù)灌胃3次[7]；H.pylori-LPS組0.3 mlH.pylori-LPS溶液，隔日1次，連續(xù)灌胃3次。灌胃結(jié)束分別于4周、8周后用頸椎脫臼法處死小鼠，取其胃組織灌胃成功后4周采用糞便抗原檢測(cè)法證實(shí)H.pylori感染。

1.7FUBP1mRNA檢測(cè)Trizol法提取組織和細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(試劑盒：RR036A，Takara，Japan)。以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR(試劑：RR420，Takara，Japan)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用比較Ct值法，組織mRNA用2-ΔΔCt法求相對(duì)表達(dá)量，細(xì)胞mRNA用2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析(見表1)。

1.8FUBP1蛋白檢測(cè)

1.8.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)：將收集到的組織進(jìn)行甲醛固定、石蠟包埋切片，然后對(duì)切片進(jìn)行FUBP1免疫組織化學(xué)SP法染色，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡下視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[8]，首先進(jìn)行染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。其次再將陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：0分為陰性；1分為陽性細(xì)胞≤10%；2分為11%～50%；3分為51%～75%；4分為>75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積分別為0、1、2、3、4、6、8、9、12。積分<3為陰性，3～5分為弱陽性，6～8為陽性，9～12為強(qiáng)陽性。

1.8.2 Western blotting：組織用強(qiáng)效RIPA裂解液(試劑：P0013B，碧云天，中國)，細(xì)胞用中效RIPA裂解液(試劑：P0013C，碧云天，中國)裂解30 min后，4 ℃離心20 min(離心半徑為8 cm，離心率為1 200 r/min)收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，F(xiàn)UBP1一抗為Anti-FUBP1兔單克隆抗體(ab181111 Abcam，England，稀釋濃度1∶1 000)，F(xiàn)UBP1二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208，碧云天，中國，稀釋濃度1∶1 000)。

2 結(jié)果

2.1FUBP1在H.pylori陽性和H.pylori陰性胃炎組織中的表達(dá)H.pylori陽性胃炎組織中FUBP1 mRNA水平低于H.pylori陰性胃炎組織(H.pylori陽性組織：0.10±0.09，H.pylori陰性組織：0.20±0.13，P=0.25)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1A)。免疫組化結(jié)果顯示：H.pylori陽性胃炎組織中14例FUBP1表達(dá)陰性；3例呈弱陽性；在H.pylori陰性胃炎組織中，F(xiàn)UBP1陰性1例，6例弱陽性，8例陽性，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1B)。Western blotting結(jié)果顯示：H.pylori陰性組織FUBP1蛋白表達(dá)量高于H.pylori陽性組織，灰度值分別為0.51±0.47和0.17±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)(見圖1C)。

圖1 胃炎組織FUBP1表達(dá) A：FUBP1 mRNA表達(dá)水平；B：免疫組化結(jié)果(1：H.pylori陰性胃炎組織；2：H.pylori陽性胃炎組織)(40×)；C：FUBP1蛋白表達(dá)水平Fig 1 The expression of FUBP1 in gastritis tissues A: the expression of FUBP1 mRNA; B: immunohistochemical results (1: H.pylori negative gastritis tissues; 2: H.pylori positive gastritis tissues) (40×); C: the expression of FUBP1 protein

2.2H.pylori刺激對(duì)AGS、7901細(xì)胞FUBP1表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，H.pylori刺激后，F(xiàn)UBP1 mRNA表達(dá)水平在AGS和SGC7901細(xì)胞中均下降(P<0.05)(見圖2A)。Western blotting結(jié)果表明,H.pylori刺激AGS細(xì)胞6 h后，F(xiàn)UBP1蛋白表達(dá)水平開始降低，呈時(shí)間依賴性；H.pylori刺激SGC7901細(xì)胞12 h后，F(xiàn)UBP1表達(dá)水平開始逐漸降低，呈時(shí)間依賴性(見圖2B)。

圖2 H.pylori刺激AGS和SGC7901細(xì)胞FUBP1表達(dá) A：FUBP1 mRNA表達(dá)水平；B：FUBP1蛋白表達(dá)水平Fig 2 The expression of FUBP1 in AGS and SGC7901 cells stimulated by H.pylori A: the expression of FUBP1 mRNA; B: the expression of FUBP1 protein

2.3H.pylori-LPS對(duì)AGS、SGC7901細(xì)胞FUBP1表達(dá)的影響H.pylori-LPS分別以1 μg/ml和10 μg/ml的終濃度刺激AGS和SGC7901細(xì)胞，RT-qPCR結(jié)果和Western blotting結(jié)果均顯示H.pylori-LPS組FUBP1表達(dá)較對(duì)照組降低，但不同濃度間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖3A、3B)。進(jìn)一步以H.pylori-LPS 1 μg/ml終濃度刺激細(xì)胞，在AGS細(xì)胞中，刺激6 h后FUBP1下降；在SGC7901細(xì)胞中，刺激24 h后開始降低，均無時(shí)間依賴性(見圖3C)。

2.4H.pylori和H.pylori-LPS動(dòng)物模型中FUBP1的表達(dá)情況RT-qPCR分別檢測(cè)4周后對(duì)照組、H.pylori組和H.pylori-LPS組小鼠胃黏膜組織中FUBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.21±0.13、0.04±0.02、0.09±0.07(P=0.12)；8周后三組小鼠胃黏膜組織中FUBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.30±0.11、0.12±0.01、0.02±0.01(P=0.003)(見圖4A)。與對(duì)照組比較，H.pylori組和H.pylori-LPS組中FUBP1 mRNA表達(dá)水平均下降。Western blotting結(jié)果同樣顯示，H.pylori組和H.pylori-LPS組的FUBP1蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組明顯降低(見圖4B)。

圖3 H.pylori-LPS刺激AGS和SGC7901細(xì)胞FUBP1表達(dá) A：FUBP1 mRNA表達(dá)水平；B～C：FUBP1蛋白表達(dá)水平Fig 3 The expression of FUBP1 in AGS and SGC7901 cells stimulated by H.pylori-LPS A: the expression of FUBP1 mRNA; B-C: the expression of FUBP1 protein

圖4 H.pylori和H.pylori-LPS動(dòng)物模型中FUBP1表達(dá) A：FUBP1 mRNA表達(dá)水平；B：FUBP1蛋白表達(dá)水平Fig 4 The expression of FUBP1 in H.pylori infected animal models and H.pylori-LPS infected animal models A: the expression of FUBP1 mRNA; B: the expression of FUBP1 protein

3 討論

H.pylori是一種定植在人體消化道內(nèi)細(xì)菌，H.pylori感染的發(fā)病率非常高，并可能在世界一半人口中出現(xiàn)[9]。隨著對(duì)H.pylori研究的深入及積極有效的治療，H.pylori的感染率逐漸降低，但它仍是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌的高危因素[10]。且所有H.pylori感染者幾乎都存在慢性活動(dòng)性胃炎[11]。LPS是位于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的類脂多糖類物質(zhì)，有研究[12-13]表明，H.pylori-LPS具有細(xì)菌內(nèi)毒素的生物學(xué)活性。H.pylori-LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子和毒力因子破壞胃黏膜的完整性，引起炎癥反應(yīng)[14]，在H.pylori感染及H.pylori相關(guān)性疾病中扮演著重要的角色。

FUBP1是遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白家族中的一員，其定位于細(xì)胞核內(nèi)，作為一種DNA結(jié)合蛋白，可調(diào)控原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞增殖、遷移能力，影響一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在消化道疾病中，有研究[15]報(bào)道FUBP1表達(dá)在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)。但一項(xiàng)小鼠腸炎模型的研究[16]發(fā)現(xiàn)，不同于在腫瘤組織中的高表達(dá)，F(xiàn)UBP1在炎癥性腸病小鼠模型中的表達(dá)降低，認(rèn)為是由于炎癥導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，F(xiàn)UBP1從細(xì)胞核中清除導(dǎo)致的。FUBP1與胃癌的研究結(jié)果顯示，胃癌中FUBP1的表達(dá)水平升高[5]。但在胃癌的高危人群H.pylori相關(guān)性胃炎患者中FUBP1表達(dá)情況是否也增高，還是同腸炎模型研究一樣表達(dá)降低，目前并無相關(guān)研究。

本研究首先檢測(cè)了H.pylori陽性和陰性胃炎組織中FUBP1 mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，H.pylori陽性胃炎患者中FUBP1的表達(dá)量比H.pylori陰性低。進(jìn)一步通過免疫組化和Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)FUBP1表達(dá)在H.pylori相關(guān)性胃炎中降低。在H.pylori刺激細(xì)胞的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UBP1的表達(dá)降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。LPS是H.pylori常見的毒力因子，可釋放相關(guān)炎性因子引起細(xì)胞損傷，因此我們進(jìn)一步探討H.pylori感染引起的FUBP1表達(dá)降低是否通過LPS。用1 μg/ml和10 μg/ml兩個(gè)不同濃度的H.pylori-LPS刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FUBP1表達(dá)降低，但不同濃度間無明顯差異，F(xiàn)UBP1表達(dá)與H.pylori-LPS的刺激濃度并無相關(guān)性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與刺激作用的時(shí)間同樣也無明顯相關(guān)性。LPS參與H.pylori引起的FUBP1表達(dá)降低。隨后我們?cè)跇?gòu)建的H.pylori感染小鼠模型中進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染4周和8周的小鼠胃組織FUBP1表達(dá)降低。同樣，H.pylori-LPS感染小鼠模型中FUBP1的表達(dá)下降。因此推測(cè)H.pylori感染后，引起炎性反應(yīng)，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞壞死，導(dǎo)致FUBP1從細(xì)胞核中逐步被清除，表達(dá)降低。在此過程中H.pylori的毒力因子LPS參與FUBP1的下調(diào)，但是否有其他毒力因子共同作用引起FUBP1變化，有待進(jìn)一步研究。因本次研究無論細(xì)胞刺激還是動(dòng)物模型都是一個(gè)短時(shí)早期的炎癥模型，如果不斷炎癥誘導(dǎo)刺激，導(dǎo)致進(jìn)入到一個(gè)慢性感染階段，動(dòng)物建模到慢性萎縮性胃炎，甚至胃癌階段，則FUBP1的表達(dá)及作用機(jī)制可能出現(xiàn)不同的變化。

綜上所述，F(xiàn)UBP1在H.pylori相關(guān)性胃炎中表達(dá)降低，H.pylori和H.pylori毒力因子LPS均能誘導(dǎo)FUBP1表達(dá)下降，F(xiàn)UBP1可能成為評(píng)估慢性胃炎患者H.pylori感染的一個(gè)潛在指標(biāo)。但H.pylori-LPS與FUBP1的相互作用是否存在其他協(xié)同因子及FUBP1在胃黏膜的炎、癌轉(zhuǎn)化中作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。