替諾福韋對(duì)子代大鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制

陳巧真，孫敏

（山東省濟(jì)寧市傳染病醫(yī)院肝病科，山東 濟(jì)寧 272031）

病毒性肝炎、艾滋病等病毒性疾病是嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是孕婦黃疸和妊娠并發(fā)癥的常見(jiàn)原因［1］。此外，受感染的母親可以將病毒傳染給胎兒或新生兒，這可能增加疾病負(fù)擔(dān)并且降低生活質(zhì)量。孕婦接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法可以迅速和完全抑制母體病毒的RNA水平，以防止病毒通過(guò)母嬰傳播給胎兒和新生兒，并可以維持產(chǎn)婦的健康［2-4］。

核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑替諾福韋，因其良好的有效性和安全性，多年來(lái)已成為病毒感染者最常用的抗病毒藥物之一［5］。然而到目前為止，還沒(méi)有關(guān)于孕中期大鼠應(yīng)用替諾福韋對(duì)子代鼠認(rèn)知功能影響的相關(guān)報(bào)道。認(rèn)知功能障礙的發(fā)生可能是由于神經(jīng)發(fā)生過(guò)程受到抑制。孕中期胎鼠的腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量較多，暴露于藥物下很可能引起神經(jīng)干細(xì)胞的損傷，藥物可能通過(guò)參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖來(lái)影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［6-8］。Wnt信號(hào)通路被激活后，可以抑制GSK-3β的活性，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量積累，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖［9］。因此，本研究的目的是研究替諾福韋作用孕中期大鼠后對(duì)子代鼠認(rèn)知功能以及Wnt信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物模型的建立：將24只Wistar大鼠 （山東省濟(jì)寧市傳染病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供） 按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成3組，每組8只。在大鼠妊娠12～21 d時(shí)給予處置。對(duì)照組給予生理鹽水肌注10 d，低濃度替諾福韋組按照2.25 mg·kg-1·d-1注射替諾福韋，高濃度替諾福韋組按照4.5 mg·kg-1·d-1注射替諾福韋。實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：替諾福韋 （石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司） ，戊巴比妥鈉 （上海西唐生物公司） ，生理鹽水、RIPA、Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇 （國(guó)藥制藥） 。GSK-3β、β-catenin、nestin和GAPDH抗體 （美國(guó)Santa公司） ，二抗 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司） 。引物合成于金斯瑞生物公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR試劑盒 （日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 血?dú)夥治觯喝焉锏?2天，取大鼠動(dòng)脈血做血?dú)夥治觥?/p>

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：子代鼠出生4周后，從每只孕鼠的子代鼠中隨機(jī)取出4只雄鼠，進(jìn)行水迷宮測(cè)試。測(cè)試期間需保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光昏暗、環(huán)境安靜、杜絕帶入食物及飲料，以避免氣味對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾作用。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)間均為上午8：00，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠擦干放回籠子，注意保暖。測(cè)試包括定位航行測(cè)試以及空間探索測(cè)試。

定位航行測(cè)試：分5 d進(jìn)行，每日每只大鼠進(jìn)行4輪測(cè)試，每輪測(cè)試時(shí)間設(shè)定為90 s，每輪測(cè)試間隔不小于30 min，以保證大鼠有充分的休息。每只大鼠隨機(jī)從每個(gè)象限的中點(diǎn)面壁投放入水桶，分析軟件自動(dòng)記錄大鼠自投放入水到找到平臺(tái)并逗留于平臺(tái)上的時(shí)間，即逃避潛伏期。如果大鼠在規(guī)定的90 s內(nèi)找不到平臺(tái)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)停止記錄，測(cè)試者將大鼠輕柔地引導(dǎo)至平臺(tái)，保證大鼠在平臺(tái)上停留30 s。

空間探索測(cè)試：第5天完成定位航行實(shí)驗(yàn)后，移去水下平臺(tái)，選定和原平臺(tái)區(qū)域?qū)?yīng)的象限中點(diǎn)為入水點(diǎn)，將大鼠面壁投放入水桶，分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄90 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)。

1.2.3 Western blotting：子代鼠出生4周后，頸椎脫位法處死子代鼠，取海馬組織0.1 g，加大約10倍濕重的RIPA裂解緩沖液，粉碎勻漿后，冰上裂解30 min，低溫高速離心，保留上清。定量后每個(gè)樣本取10 μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次、一抗孵育4 ℃過(guò)夜、洗膜后二抗室溫震蕩孵育2 h，TBST洗膜后ECL發(fā)光。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)：子代鼠出生4周后，頸椎脫位法處死子代鼠，取海馬組織0.1 g，加入1 mL Trizol裂解液裂解后，分別通過(guò)氯仿、異丙醇、乙醇等處理提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)，所用引物為GSK-3β，正義鏈5’-CCTTAACCTGGTGCTGGACT-3’，反義鏈 5’-AGCTCTGGTGCCCTGTAGTA-3’； β-catenin，正義鏈5’-CTACTTGTTCTGAGTGAA-3’，反義鏈5’-TG GAACCAGACAGAAAAGC-3’；nestin，正義鏈5’-GC CCTGACCACTCCAGTTTA-3’，反義鏈5’-GGAGTCC TGGATTTCCTTCC-3’；GAPDH，正義鏈5’- AGAAGG CTGGGGCTCATTTG-3’，反義鏈 5’-AGGGGCCATCC ACAGTCTTC-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替諾福韋對(duì)孕鼠及子代大鼠體質(zhì)量的影響

各組孕鼠在孕期第22天進(jìn)行頸內(nèi)動(dòng)脈抽血監(jiān)測(cè)血?dú)夥治?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組與對(duì)照組相比，pH、pO2、pCO2無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。對(duì)照組、低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組新生大鼠體質(zhì)量分別為 （23.31±2.98） 、（24.32±1.61） 、 （25.01±1.23） g，低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組與對(duì)照組相比，體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 替諾福韋對(duì)子代大鼠認(rèn)知功能的影響

定位航行測(cè)試結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低濃度替諾福韋組子代大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期時(shí)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，而高濃度替諾福韋組子代大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，到達(dá)平臺(tái)前路程明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，見(jiàn)表2。

表1 各組血?dú)夥治鼋Y(jié)果 （n = 8）Tab.1 Results of blood gas analysis in different groups （n = 8）

空間探索測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，低濃度替諾福韋組子代大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)以及停留時(shí)間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，而高濃度替諾福韋組子代大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)及時(shí)間明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，見(jiàn)表2。

表2 替諾福韋對(duì)逃避潛伏期、平臺(tái)穿越次數(shù)及停留時(shí)間的影響Tab.2 Effect of tenofovir on escape latency，platform crossing times and residence time

2.3 替諾福韋對(duì)子代大鼠Wnt通路蛋白的影響

Wnt通路可以影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，也是與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的通路。本研究應(yīng)用Western blotting和 實(shí) 時(shí)PCR檢 測(cè)GSK-3β、β-catenin及nestin蛋白和mRNA水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度替諾福韋組子代大鼠海馬組織內(nèi)GSK-3β、β-catenin及nestin含量與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，高濃度替諾福韋組子代大鼠海馬組織內(nèi)GSK-3β含量明顯高于對(duì)照組和低濃度替諾福韋組，β-catenin及nestin含量明顯低于對(duì)照組和低濃度替諾福韋組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見(jiàn)圖1。

3 討論

母嬰傳播是各種病毒性疾病 （乙型肝炎、人類免疫缺陷病毒等） 患者或者病毒攜帶狀態(tài)的母親將病毒傳播給嬰兒的傳播方式。有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)指出，我國(guó)人群中有近50%的HBsAg攜帶者可能是由母嬰傳播所致［8］。母嬰傳播分為3個(gè)階段：宮內(nèi)傳播，懷孕時(shí)母體血液中的病毒經(jīng)胎盤傳遞給嬰兒；產(chǎn)程傳播，分娩時(shí)、嬰兒出生過(guò)程中皮膚損傷或病毒通過(guò)破裂胎盤傳遞給嬰兒以及分娩后母親與胎兒親密接觸傳播；哺乳傳播。各種核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶 （西多福韋、阿德福韋、替諾福韋等） 的應(yīng)用可以在備孕期及孕期降低病毒的含量，減少病毒母嬰傳播的機(jī)會(huì)［9］。

圖1 替諾福韋作用后GSK-3β、β-catenin及nestin蛋白和mRNA的表達(dá)水平Fig.1 Protein and mRNA expressions of GSK-3β，β-catenin，and nestin after treatment with tenofovir

替諾福韋是指南推薦的備孕期及孕期的抗病毒治療的藥物。使用替諾福韋可以大大地降低體內(nèi)病毒量，使得宮內(nèi)感染的可能性下降。研究［10-12］指出，替諾福韋的生物安全性高，肝腎毒性較小，但是目前國(guó)內(nèi)針對(duì)替諾福韋在孕期應(yīng)用安全性的研究較少。

有研究指出，孕鼠長(zhǎng)期使用2.25 mg·kg-1·d-1的替諾福韋并不會(huì)影響母體及子代鼠P糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白等的表達(dá)，即其在孕期的應(yīng)用相對(duì)安全。但是也有研究［13］指出替諾福韋會(huì)增加胎盤與子代鼠體質(zhì)量的比值，可能會(huì)對(duì)子代鼠的健康情況造成影響。一項(xiàng)對(duì)17例HIV感染孕婦應(yīng)用替諾福韋進(jìn)行的調(diào)查研究［14］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用12周替諾福韋可以在一定程度上改善患者的認(rèn)知能力和神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)評(píng)估分?jǐn)?shù)。在美國(guó)，一項(xiàng)有230名參與者的雙盲研究［15］結(jié)果也指出，替諾福韋的應(yīng)用可以在不損傷患者神經(jīng)功能、不影響患者認(rèn)知能力的前提下，降低病毒的含量，減少病毒帶來(lái)的損傷。

本研究是首次在體應(yīng)用孕-胎鼠模型，觀察孕中期相關(guān)劑量的替諾福韋暴露對(duì)子代鼠學(xué)習(xí)記憶功能以及神經(jīng)干細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響。本研究結(jié)果顯示，孕中期接受低濃度替諾福韋并不會(huì)損害子代鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。但在孕中期接受高濃度替諾福韋則明顯影響子代鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，表現(xiàn)為水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛伏期延長(zhǎng)、平臺(tái)活動(dòng)時(shí)間以及穿越平臺(tái)次數(shù)減少。

許多研究［15］提示，齒狀回神經(jīng)的發(fā)生在海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶形成中至關(guān)重要。Wnt信號(hào)通路在發(fā)育期神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的核心分子，在Wnt信號(hào)通路中處于中心位置。GSK-3β在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有表達(dá)，特別在海馬表達(dá)水平更高［16］。GSK-3β可磷酸化β-catenin，介導(dǎo)β-catenin的降解。Wnt信號(hào)通路被激活后，可以抑制GSK-3β的活性，使胞內(nèi)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量積累，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。Wnt通路的激活也可以促進(jìn)nestin蛋白這一神經(jīng)干細(xì)胞特征性標(biāo)志物的表達(dá)［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度替諾福韋可以影響子代鼠的認(rèn)知功能后，對(duì)Wnt通路的相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕期高濃度的替諾福韋很可能引起了子代鼠腦內(nèi)GSK-3β水平升高，β-catenin水平降低，進(jìn)而通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路抑制了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，抑制了nestin的表達(dá)，從而損害了子代鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

雖然本研究對(duì)機(jī)制的探討較為淺顯，需要進(jìn)一步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)或者細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但是仍然在一定程度上證明高濃度的替諾福韋可以抑制子代鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，低濃度替諾福韋使用較為安全，但是高濃度的替諾福韋可以通過(guò)影響Wnt信號(hào)通路的激活抑制子代大鼠的認(rèn)知功能。