雙酚S長期暴露對雌性斑馬魚視覺系統(tǒng)的影響?

劉文敏， 張曉娜， 魏朋浩， 汝少國

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

近年來，雙酚S(BPS)由于具有優(yōu)良的耐熱、耐光和抗氧化性能[1]，替代了雙酚A廣泛用于食品包裝材料、食品罐內(nèi)襯、奶瓶和紙制品等的生產(chǎn)中[2]，并已經(jīng)由各種途徑釋放到環(huán)境中，Yamazaki等[3]發(fā)現(xiàn)BPS在中國珠江、印度Buckingham Canal和Adyar River中的含量分別為0.135、1.08和6.84 μg/L；Liao和Kannan[4]在美國奧爾巴尼的多種食物樣品中均檢測到了BPS，BPS污染水平在逐年加重[5]。已有的研究發(fā)現(xiàn)BPS較BPA不易降解、易累積[6]，具有生殖毒性和內(nèi)分泌毒性[7-9]，且BPS發(fā)揮著雌激素效應(yīng)[7-8]。許多研究表明眼科疾病與雌激素水平變化有關(guān)[10-11]，有懷孕史或正懷孕的女性雌激素水平高于未懷孕女性，更容易產(chǎn)生視網(wǎng)膜疾病[12]。已有研究表明，多氯聯(lián)苯PCB1254[13]、苯并a芘(BaP)[14]和多溴聯(lián)苯醚DE-71[15]等具有雌激素效應(yīng)的環(huán)境污染物均能夠損傷斑馬魚的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致魚類的視覺障礙。然而，BPS是否會造成雌性動物視覺毒性目前尚未見報道。

眼睛發(fā)育在脊椎動物中比較保守[16]，斑馬魚的視覺系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人類的非常相似[17]，斑馬魚視覺系統(tǒng)比較發(fā)達，視覺發(fā)育迅速，成魚具有明顯的晝夜節(jié)律，對光反應(yīng)強烈，是研究視覺的重要模式生物[18]。眼動反應(yīng)(Optokinetic response, OKR)和視動反應(yīng)(Optomotor response, OMR)是評估視覺功能的簡單、有效指標(biāo)[19]。OKR依賴于成熟的、功能性的視網(wǎng)膜[20]。OMR與視桿細胞中的視紫紅質(zhì)視蛋白(zfrho)及視錐細胞中的紅光敏感視蛋白(zfred)和綠光敏感視蛋白(zfgr)有關(guān)[21]。因此，本文研究了BPS長期暴露對雌性斑馬魚視覺行為OKR和OMR的影響，觀察了眼睛視網(wǎng)膜組織學(xué)切片，并對視網(wǎng)膜及其各層：包括外核層(ONL)、內(nèi)核層(INL)、神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)、外叢狀層(OPL)和內(nèi)叢狀層(IPL)的厚度進行了定量統(tǒng)計分析，實時定量PCR方法檢測了雌性斑馬魚視蛋白基因(zfrho、zfblue、zfgr、zfred和zfuv)的表達變化，系統(tǒng)研究了BPS長期暴露對雌性斑馬魚視覺行為、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視蛋白基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗物質(zhì)

BPS (CAS NO:80-09-1, purity≥ 98%, 購自Sigma-Aldrich (Shanghai, China)。助溶劑為二甲基亞砜(DMSO)，BPS儲備液濃度為0.01和1 mg/mL，室溫避光保存。

1.2 斑馬魚養(yǎng)殖和BPS暴露實驗及取樣

將成年T系雌雄斑馬魚(zebrafish,Daniorerio)分開飼養(yǎng)于25 L連續(xù)曝氣24 h以上的自來水中，飼養(yǎng)條件為：水溫(27±1) ℃，光暗比為14 L∶10 D，DO=(7.0±0.1) mg/L，pH=(7.8±0.2)，每天喂食2次孵化的鹵蟲(Artemiasaline)。分開2周后，選擇懷卵雌魚和健康雄魚按1∶2的比例進行光照刺激產(chǎn)卵，次日收集受精卵，清洗后用于暴露實驗。

實驗采用半靜態(tài)毒性試驗方法。受精后2 h (hpf, hours post-fertilization)-受精后15 d (dpf, days post-fertilization)，斑馬魚仔魚飼養(yǎng)于1.5 L BPS暴露溶液的燒杯中；15～40 dpf，斑馬魚幼魚飼養(yǎng)于4.5 L暴露液的燒杯中；40～120 dpf，斑馬魚飼養(yǎng)于30 L暴露液的魚缸中；每天更新2/3的暴露液(依次為1、3和20 L)。設(shè)置1、10、100和1 000 μg/L BPS暴露組，同時設(shè)置空白對照組和溶劑對照組(DMSO, 0.002%)。BPS暴露斑馬魚胚胎(2 hpf)至性成熟(120 dpf)，具體操作和斑馬魚的喂食情況如圖1所示。

圖1 BPS長期暴露示意圖

暴露結(jié)束后，稱量體長和體重后解剖辨別雌雄，取每條雌性斑馬魚的一只眼睛置于1.5 mL離心管中，每三條魚的眼睛混為一個樣品，取6個平行樣品，迅速冷凍于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，用于基因表達水平的測定。另取7只眼睛固定于10%中性福爾馬林固定液中24 h后用于制作石蠟切片。隨機取8條魚用于視覺行為OKR和OMR的測定。

1.3 斑馬魚行為學(xué)實驗

斑馬魚視覺已被證明有明顯的生物節(jié)律性[22]。OKR和OMR實驗安排在上午10:00—12：00，15:00—18:00進行。

OKR實驗參照Cameron等[23]的方法，光柵條帶選擇12 cycles，光柵直徑為11 cm，光柵轉(zhuǎn)速設(shè)置為25 cycles/min，對應(yīng)時間頻率為150°/s，光對比度設(shè)置為0.3。麻醉并固定雌性斑馬魚于OKR行為杯子中，調(diào)整魚體使其身體背側(cè)向正上方，加水后放入刺激裝置中，調(diào)整顯微鏡使至合適視野、放大倍數(shù)并對焦使圖像清晰，待魚清醒5 min后，光強度和光柵刺激各適應(yīng)1 min后由CCD拍攝記錄眼動，通過自制軟件分析獲得OKR行為學(xué)數(shù)據(jù)。

OMR實驗參照Zou等[24]的方法，光柵直徑為12 cm，光柵密度為12個周期，刺激頻率為25 r/min，CCD視頻拍攝幀率為30幀/s。將雌性斑馬魚放進OMR行為杯子中，刺激適應(yīng)1 min后順時針(clockwise, CW)開始記錄，之后休息1 min，逆時針(Counterclockwise, CCW)方向重復(fù)上面操作。采用自制軟件統(tǒng)計追隨百分比(追隨光柵的時間除以總記錄時間再乘以100%)。

1.4 雌性斑馬魚眼睛石蠟切片的制備

固定后的雌性斑馬魚眼睛經(jīng)梯度乙醇脫水后，用二甲苯透明，浸蠟包埋，進行常規(guī)切片，厚度為5 μm，蘇木精-伊紅(H-E)染色。Nikon光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，Image J軟件測量眼睛視網(wǎng)膜及各層結(jié)構(gòu)：RPE、ONL、INL、IPL、GCL的厚度，每組選取7只魚眼，每只魚眼選取視網(wǎng)膜中央部位測5處。

1.5 實時定量PCR (qPCR)

Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)法提取眼睛總RNA，NanoDrop ND-2000c紫外分光光度計測定總RNA的質(zhì)量及濃度。等量的質(zhì)量合格(1.9< 260/280< 2.0)的總RNA(1 μg) 利用gDNA Eraser消除基因組污染，然后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa, Shiga, Japan)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)Genbank已發(fā)表序列設(shè)計各基因特異性引物(見表1)。qPCR實驗采用Eppendorf MasterCycler ep RealPlex4)定量PCR儀，按照SYBR green mix kit (TaKaRa, Dalian, China)說明書進行。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。各PCR反應(yīng)最終進行溶解曲線分析，擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，確定擴增片段的特異性。目的基因mRNA的相對豐度采用2-ΔΔCt法[25]，以β-actin和elfa為內(nèi)參(經(jīng)內(nèi)參基因的篩選β-actin和elfa為最優(yōu)雙內(nèi)參組合)，計算不同暴露組目的基因的相對表達量。

表1 熒光定量引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

柱狀圖利用Graphpad prism 5.0完成，結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey多重比較，P<0.05表示差異顯著(用*標(biāo)記)，P<0.01表示差異極顯著(用**標(biāo)記)。

2 結(jié)果

2.1 BPS長期暴露對雌性斑馬魚OKR和OMR的影響

不同濃度的BPS暴露斑馬魚胚胎至性成熟120 d，與溶劑對照組相比，10和100 μg/L暴露組雌性斑馬魚OKR的SPG值(慢速相gain值，慢速相中斑馬魚眼睛轉(zhuǎn)動的角速度與光柵轉(zhuǎn)動角速度的比值)顯著下降(見圖2)；無論順時針(CW)還是逆時針(CCW)轉(zhuǎn)動，與溶劑對照組相比，各暴露組雌性斑馬魚的光柵追隨率雖有所下降，但均無顯著性差異(見圖3)。

(n=8；表示P< 0.05。 means P< 0.05.)圖2 BPS長期暴露對雌性斑馬魚OKR的影響

(光柵轉(zhuǎn)動方向：順時針和逆時針。The striped drum was rotated CW and CCW.n=8)

圖3 BPS長期暴露對雌性斑馬魚OMR的影響
Fig.3 The optomotor response of female zebrafish exposed to BPS for 120 days

2.2 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視網(wǎng)膜厚度的影響

不同濃度的BPS暴露斑馬魚胚胎至性成熟120 d，溶劑對照組(見圖4A)、10 μg/L(見圖4C)、100 μg/L(見圖4D)和1 000 μg/L BPS暴露組(見圖4E)雌性斑馬魚的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，各層細胞排列規(guī)則整齊，密度均勻；1 μg/L BPS暴露組視網(wǎng)膜RPE層出現(xiàn)小的空隙(圖4B白色箭頭)。對視網(wǎng)膜及各層定量結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，1 000 μg/L BPS暴露組RPE、ONL、IPL、GCL和視網(wǎng)膜厚度分別顯著增加了41.9%、28.4%、20.9%、25.5%和24.9% (見圖5)。

(A.溶劑對照組；B.1 μg/L；C. 10 μg/L；D. 100 μg/L ；E 1 000 μg/L BPS暴露組，標(biāo)尺為50 μm。 A. The solvent control with normal layering; B. 1 μg/L; C. 10 μg/L; D. 100 μg/L ; E. 1 000 μg/L BPS-treated groups. Scale bar: 50 μm.)

圖4 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的影響

Fig.4 Histopathological analyses of female zebrafish retina structure between the solvent control and BPS-treated groups

(n=7，?表示P<0.05。?means P< 0.05.)圖5 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視網(wǎng)膜及各層厚度(μm)的影響

2.3 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

不同濃度的BPS暴露斑馬魚胚胎至性成熟120 d，與溶劑對照組相比，各暴露組zfred(見圖6A)表達量均顯著上調(diào)，其中1和1 000 μg/L暴露組表達量極顯著上調(diào)；zfgr(見圖6B)和zfblue(見圖6C)在1和100 μg/L暴露組的表達量出現(xiàn)顯著上調(diào)；zfuv(見圖6D)在1、10和100 μg/L暴露組的表達量出現(xiàn)極顯著上調(diào)，而zfrho(見圖6E)的表達量在各暴露組均無顯著性變化。

3 討論

本研究結(jié)果首次表明，BPS長期暴露能夠顯著降低雌性斑馬魚的視覺追蹤能力。斑馬魚是一種典型的白晝活動和具有較好視覺功能的魚類，在5 dpf和7 dpf即具有穩(wěn)健的OKR和OMR，并一直持續(xù)到成年[26]。斑馬魚的OKR和OMR都是視覺刺激誘導(dǎo)的視覺行為，無需訓(xùn)練即可誘導(dǎo)產(chǎn)生。Rinner等[27]在研究斑馬魚OKR時用SPG值(慢速相的gain值為慢速相中斑馬魚眼睛轉(zhuǎn)動的角速度與光柵轉(zhuǎn)動角速度的比值)來表征眼睛追蹤轉(zhuǎn)動光柵的能力，SPG值降低表明斑馬魚眼睛追蹤能力下降，視覺功能受損[28]。本研究中，10和100 μg/L暴露組OKR的SPG值顯著下降，表明BPS長期暴露顯著降低了雌性斑馬魚眼睛的追蹤能力。斑馬魚成魚主要依靠視覺進行捕食及逃避捕食者等活動[29-30]，雌性斑馬魚視覺追蹤能力顯著下降說明10和100 μg/L BPS長期暴露可能會影響雌性斑馬魚的攝食行為，進而影響其生長和繁殖。Neuhauss等[31]認為斑馬魚眼睛追蹤能力的變化可能與眼睛轉(zhuǎn)動發(fā)生機械障礙有關(guān)。污染物對生物體正常生理功能的影響存在一個閾值(即安全劑量)，只有當(dāng)污染物濃度達到這一閾值時才能引發(fā)效應(yīng)[32]，例如，Wang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)0.125 mg/L多氯聯(lián)苯(PCB)暴露對斑馬魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和厚度均無顯著影響，而0.25 mg/L PCB暴露顯著增加斑馬魚眼睛寬度；0.32 μg/L多溴聯(lián)苯醚(DE-71)暴露對斑馬魚視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)目無明顯影響，而濃度達3.58 μg/L時便能顯著降低其數(shù)目[15]。本研究中1 μg/L暴露組OKR慢速相值無顯著變化，可能與BPS濃度較低有關(guān)。

OMR實驗中，斑馬魚的身體沒有被固定，能跟隨感知的黑白光柵運動[33]，可通過檢測斑馬魚對黑白光柵的趨向性來研究其視覺運動能力[23]，視覺未受損傷的魚類會追隨光柵運動[34-35]，追隨百分比越高表示斑馬魚的視覺功能越好，本研究中無論CW還是CCW，雌性斑馬魚的追隨百分比均無顯著性變化，Neuhauss[36]發(fā)現(xiàn)斑馬魚同金魚[37]一樣，其OMR反應(yīng)依賴于視桿細胞和某種視錐細胞中的視蛋白，斑馬魚含有五種視蛋白，視桿細胞中的視紫紅質(zhì)視蛋白(zfrho)，視錐細胞中的綠光敏感視蛋白(zfgr)、紅光敏感視蛋白(zfred)、藍光敏感視蛋白(zfblue)和紫外敏感視蛋白(zfuv)，它們由光感受器合成，決定視色素的光譜敏感性[38]。Orger 和 Baier[39]的研究表明成年斑馬魚OMR識別視錐細胞中的zfred、zfgr和視桿細胞的zfrho。本研究中BPS長期暴露對雌性斑馬魚追隨百分比無顯著性影響可能與zfrho的表達量在各暴露組均無顯著性變化有關(guān)。另外，BPS長期暴露顯著上調(diào)了雌性斑馬魚中zfred、zfgr、zfblue和zfuv的基因轉(zhuǎn)錄水平，Xu等[40]也發(fā)現(xiàn)斑馬魚經(jīng)PBDEs暴露后，其五種視蛋白基因的表達也都出現(xiàn)了顯著性上調(diào)，推測可能是視色素的另一組成成分生色團視黃醛減少后的代償性反應(yīng)，以增強斑馬魚對紅光、綠光、藍光和紫外的敏感性。

(n=3；表示P< 0.05，表示P< 0.01。means P< 0.05, means P<0.01.)

BPS暴露不僅影響斑馬魚的視覺行為，還會對其視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。視網(wǎng)膜組織切片結(jié)果顯示BPS長期暴露并未對雌性斑馬魚的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)分層等造成嚴(yán)重損傷，雌激素通過與雌激素受體(ERs)結(jié)合對視網(wǎng)膜發(fā)揮保護作用[41-42]。ERs在視網(wǎng)膜中分布廣泛，且存在年齡和性別差異，ERα主要分布在年輕女性的視網(wǎng)膜上[41,43]，已有的研究表明BPS具有雌激素效應(yīng)[7-8, 44]，BPS長期暴露能顯著上調(diào)雌激素E2的水平[9]，因此，我們推測上調(diào)的E2對視網(wǎng)膜的保護作用可能是雌性斑馬魚視網(wǎng)膜分層及細胞排列無明顯變化的原因。斑馬魚的視網(wǎng)膜在損傷后具有很強的再生能力，能自我修復(fù)多種因損傷導(dǎo)致的視覺功能缺失[45]。因此我們推測1 000 μg/L BPS暴露促進了雌性斑馬魚視網(wǎng)膜細胞再生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜及其各層厚度增加，進而使得最高濃度組OKR慢速相值無顯著變化。另外，許多眼科疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變[46]、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變[47]等均與視網(wǎng)膜厚度異常增加有關(guān)，高濃度BPS導(dǎo)致的視網(wǎng)膜厚度異常增加雖然對雌性斑馬魚視覺追蹤能力沒有造成明顯影響，但可能會升高上述一些眼科疾病的發(fā)病率。

綜上，本研究首次從分子、組織學(xué)和個體等不同水平探究了BPS長期暴露對雌性斑馬魚的視覺毒性及潛在機制，證實了BPS長期暴露顯著降低了雌性斑馬魚的視覺追蹤能力，而高濃度BPS增加了視網(wǎng)膜及其各層的厚度，可能會導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的風(fēng)險升高。環(huán)境中BPS可能長期存在且較難降解，因此，BPS長期暴露可能對人的視覺健康造成潛在威脅，需引起研究者廣泛關(guān)注。