微藻脂肪酸生物合成的研究進(jìn)展?

米鐵柱， 張 梅， 甄 毓??

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

微藻是十分重要的生物資源，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具有很高的生態(tài)價(jià)值。同時(shí)，微藻種質(zhì)資源豐富，且具有分布廣泛、種類眾多、數(shù)量龐大、繁殖迅速等特點(diǎn)，因而，其可觀的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值和巨大的開發(fā)潛力受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。目前對(duì)微藻的開發(fā)利用主要包括生物活性物質(zhì)、生物柴油、功能性飼料、抗腫瘤藥物以及藻類處理污水等幾個(gè)方面[1-5]。其中，生物柴油以及生物活性物質(zhì)中的多不飽和脂肪酸的開發(fā)利用都與微藻的脂肪酸生物合成密切相關(guān)。

脂肪酸生物合成是生物的基本生理過(guò)程之一，在生命過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。作為細(xì)胞的重要組分之一，生物體中的脂肪酸大部分以結(jié)合態(tài)存在，少量游離在細(xì)胞中。脂肪酸不僅可以作為重要的儲(chǔ)能物質(zhì)存在于細(xì)胞中，而且對(duì)植物的組織結(jié)構(gòu)和功能十分重要。研究表明脂肪酸在防止機(jī)械損傷、植物抗寒性、細(xì)胞識(shí)別、特異性和組織免疫等方面也起到了積極的作用[6]。綜上所述，研究微藻的脂肪酸生物合成途徑不僅具有生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，而且有助于我們更加深入地了解微藻的生理學(xué)特征。本文主要就國(guó)內(nèi)外微藻脂肪酸生物合成的研究進(jìn)展展開討論，以期為后續(xù)研究提供一定參考。

1 微藻脂肪酸生物合成途徑解析

2007年，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)基因組的成功測(cè)序首次向人們展示了微藻的基因藍(lán)圖，這一發(fā)現(xiàn)有助于對(duì)藻類代謝工程進(jìn)行更深入的研究[7]?；蚪M測(cè)序不僅能揭示物種的遺傳機(jī)制，找到功能相關(guān)的特異基因，也是分子生物學(xué)研究的前提。目前，已完成基因組測(cè)序的真核微藻至少有20種[8-11]，如表1所示。另外，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已在微藻的生理生化研究中廣泛應(yīng)用。通過(guò)對(duì)微藻的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序，利用多種數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)微藻的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行注釋，能在沒(méi)有微藻基因組信息的情況下對(duì)其基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的解析，得到參與不同代謝途徑的編碼基因，在此基礎(chǔ)上，可以對(duì)微藻的多種代謝途徑進(jìn)行解析，其中，包括微藻脂肪酸的生物合成途徑。

基于基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)微藻脂肪酸的生物合成途徑包括3個(gè)方面：脂肪酸的從頭合成、碳鏈的延伸以及不飽和脂肪酸的生成。脂肪酸的從頭合成發(fā)生在葉綠體中，其起始于乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACCase)催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，這一步被認(rèn)為是微藻脂肪酸生物合成的限速步驟[12]。正因?yàn)槿绱耍珹CCase 已成為致力于提高微藻脂肪酸產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。接下來(lái)，丙二酰-CoA在丙二酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)酰酶(malonyl-CoA:ACP transacylase, MCAT)的作用下被加載到酰基載體蛋白(acyl carrier protein, ACP)上。隨后，β-酮酰-ACP合酶III(beta-ketoacyl-ACP synthase III, KASIII)催化丙二酰-ACP與乙酰-CoA 發(fā)生縮合反應(yīng)生成乙酰乙酰-ACP。之后，其在β-酮酰-ACP還原酶(beta-ketoacyl-ACP reductase, KAR)、β-酮酰-ACP脫水酶(beta-hydroxyacyl-ACP dehydratase, HAD)以及烯酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, EAR)的作用下被充分還原成丁酰-ACP。在之后的反應(yīng)中，丁酰-ACP和另1分子的丙二酰-ACP作為新的底物，進(jìn)行新一輪的縮合、還原反應(yīng)，如此循環(huán)6次或7次，最終生成C16:0-ACP或 C18:0-ACP。其中，與第一輪反應(yīng)不同的是，KASI催化C6至C16產(chǎn)物的生成，KASII催化C18產(chǎn)物的生成。

表1 已完成基因組測(cè)序的微藻

基于基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)微藻脂肪酸的生物合成途徑包括3個(gè)方面：脂肪酸的從頭合成、碳鏈的延伸以及不飽和脂肪酸的生成。脂肪酸的從頭合成發(fā)生在葉綠體中，其起始于乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACCase)催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，這一步被認(rèn)為是微藻脂肪酸生物合成的限速步驟[12]。正因?yàn)槿绱?，ACCase 已成為致力于提高微藻脂肪酸產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。接下來(lái)，丙二酰-CoA在丙二酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)酰酶(malonyl-CoA:ACP transacylase, MCAT)的作用下被加載到?；d體蛋白(acyl carrier protein, ACP)上。隨后，β-酮酰-ACP合酶III(beta-ketoacyl-ACP synthase III, KASIII)催化丙二酰-ACP與乙酰-CoA 發(fā)生縮合反應(yīng)生成乙酰乙酰-ACP。之后，其在β-酮酰-ACP還原酶(beta-ketoacyl-ACP reductase, KAR)、β-酮酰-ACP脫水酶(beta-hydroxyacyl-ACP dehydratase, HAD)以及烯酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, EAR)的作用下被充分還原成丁酰-ACP。在之后的反應(yīng)中，丁酰-ACP和另1分子的丙二酰-ACP作為新的底物，進(jìn)行新一輪的縮合、還原反應(yīng)，如此循環(huán)6次或7次，最終生成C16:0-ACP或 C18:0-ACP。其中，與第一輪反應(yīng)不同的是，KASI催化C6至C16產(chǎn)物的生成，KASII催化C18產(chǎn)物的生成。

當(dāng)一個(gè)成熟的脂肪酸到達(dá)自己特定的長(zhǎng)度時(shí)，它可以通過(guò)原核途徑保留在質(zhì)體中，質(zhì)體中的脂酰-ACP與甘油-3-磷酸在?；D(zhuǎn)移酶的作用下生成磷脂酸及其相應(yīng)的衍生物。脂肪酸也可以通過(guò)真核途徑輸送到細(xì)胞溶質(zhì)中，脂酰-ACP在硫脂酶(thioesterase, TEs)的水解作用下釋放出游離的脂肪酸。隨后，游離脂肪酸會(huì)擴(kuò)散到質(zhì)體內(nèi)膜上并在脂酰-CoA合成酶(acyl-CoA synthetase, ACS)的作用下轉(zhuǎn)換成脂酰-CoA，接著脂酰-CoA從質(zhì)體內(nèi)膜上釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的脂酰-CoA延長(zhǎng)酶(acyl-CoA elongase, ACE)可以催化脂酰-CoA產(chǎn)生更長(zhǎng)碳鏈的脂肪酸，其延長(zhǎng)機(jī)制與脂肪酸的從頭合成相似，但碳鏈延伸的供體為丙二酰-CoA。與葉綠體相對(duì)應(yīng)的是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在另外一種?；D(zhuǎn)移酶，該酶以脂酰-CoA為原料，通過(guò)真核途徑合成磷脂酸以及相應(yīng)的衍生物。脂肪酸與甘油-3-磷酸結(jié)合形成甘油酯后，脂肪酸仍可進(jìn)一步進(jìn)行加工，葉綠體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在一系列的脂肪酸去飽和酶，每個(gè)去飽和酶在脂肪酸的特定部位產(chǎn)生雙鍵，在這些酶的作用下，最終產(chǎn)生不飽和脂肪酸(見圖1)。

(該圖為本文作者繪制，實(shí)線箭頭表示單次反應(yīng)，虛線箭頭表示多次反應(yīng)，圖中×6和×7表示反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。The Figure is drawn by the author, Solid arrows indicate a single reaction, and dotted arrows indicate many reactions. In the Figure, ×6 and ×7 are the cycle times.)

圖1 微藻脂肪酸合成示意圖

Fig.1 The sketch map of fatty acid biosynthesis in microalgae

2 影響微藻脂肪酸生物合成的因素

研究發(fā)現(xiàn)，微藻脂肪酸的含量和組成因物種以及環(huán)境因子的不同而不同(見表2)。影響脂肪酸含量和成分的環(huán)境因子主要有化學(xué)因素和物理因素兩種?；瘜W(xué)因素主要指的是微藻生長(zhǎng)時(shí)的營(yíng)養(yǎng)條件，目前相關(guān)的研究主要集中在碳、氮、磷、硅以及鐵5種元素上。物理因素則主要包括光照強(qiáng)度、溫度、pH以及鹽度等。

2.1 化學(xué)因素對(duì)微藻脂肪酸合成的影響

表2 部分微藻的產(chǎn)油情況以及優(yōu)化的培養(yǎng)方式

微藻具有多種不同的營(yíng)養(yǎng)方式，大多數(shù)是以光合自養(yǎng)的方式生長(zhǎng)，也有部分微藻具有利用外加有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)的能力。能被微藻利用的有機(jī)物種類較多，目前研究最多的主要包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類以及醇類等。劉平懷等[17]利用4種不同有機(jī)碳源對(duì)單針藻(Monoraphidiumsp.)進(jìn)行混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和蔗糖對(duì)Monoraphidiumsp.總脂的積累具有明顯的促進(jìn)作用，而甘氨酸和乙酸鈉則表現(xiàn)為抑制作用。這說(shuō)明碳源種類不同，微藻所作出的生理響應(yīng)也會(huì)相應(yīng)不同，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞總脂積累的差異。

2.1.2 氮元素 氮元素是微藻進(jìn)行正常的生命活動(dòng)所必需的化學(xué)元素，不同種類的氮源以及氮源濃度都會(huì)影響微藻的生長(zhǎng)情況、脂肪酸的含量和組成。Ruangsomboon[18]利用相同濃度的4種氮源(KNO3、NaNO3、CH4N2O以及NH4HCO3)對(duì)布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，以KNO3為氮源的培養(yǎng)體系的生物量以及脂肪酸含量明顯高于其它3種，并且4種不同氮源條件下脂肪酸的組成也顯示出較大差異。對(duì)于4種小球藻Chlorellazofingiensis、C.vulgaris、Chlorellasorokiniana、Chlorellaprotothecoides以及微擬球藻(Nannochloropsissp. F&M-M24)在內(nèi)的一些微藻而言，如果處于氮限制培養(yǎng)條件時(shí)，微藻會(huì)表現(xiàn)出脂肪酸過(guò)量積累的現(xiàn)象[19-23]，但是對(duì)四鞭片藻(TetraselmissuecicaF&M-M33)等一些微藻來(lái)說(shuō)，氮限制只會(huì)小幅度提高脂肪酸生產(chǎn)量，甚至造成脂肪酸含量的顯著降低[20]。氮限制可以促進(jìn)脂肪酸積累，但會(huì)影響微藻細(xì)胞正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖。因此，僅靠氮限制來(lái)獲取足夠的脂肪酸生產(chǎn)這個(gè)方法并不可行。研究者試圖用兩步培養(yǎng)法來(lái)獲取足夠的脂肪酸生產(chǎn)。首先將微藻在最適的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)至指數(shù)后期，之后將微藻置于氮限制或無(wú)氮源的體系中培養(yǎng)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，上述培養(yǎng)方式可以促進(jìn)脂肪酸生產(chǎn)量的增加[18,24-25]。

現(xiàn)有理論認(rèn)為，當(dāng)?shù)闯渥銜r(shí)，微藻細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，能夠正常合成蛋白、核酸以及脂肪酸等有機(jī)質(zhì)。而在氮限制培養(yǎng)的初期，微藻尚能進(jìn)行正常的光合作用，細(xì)胞內(nèi)的碳源比較充足，但由于氮元素的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法合成相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸，脂肪酸的合成過(guò)程不受氮元素的限制，促使主要的碳代謝流轉(zhuǎn)向脂肪酸的生物合成[26]。

2.1.3 磷元素 磷元素在微藻生長(zhǎng)過(guò)程起著重要的作用，對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性、發(fā)揮細(xì)胞機(jī)能具有重要意義。同時(shí)，磷元素還參與細(xì)胞體內(nèi)DNA、RNA、ATP、NADP及磷脂等物質(zhì)的生成[27-28]。Li等[29]利用不同濃度梯度的正磷酸鹽對(duì)月形藻(Scenedesmussp.)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷的濃度在0.2～2 mg/L的范圍時(shí)，油脂含量占微藻干重的25%左右。但當(dāng)磷的濃度處于限制(0.1 mg/L)時(shí)，微藻細(xì)胞的油脂積累能力大幅度提高，油脂含量高達(dá)細(xì)胞干重的53%。Feng等[30]利用兩種培養(yǎng)基對(duì)小球藻(C.zofingiensis)進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，缺磷培養(yǎng)基中微藻的油脂積累能力明顯高于富磷培養(yǎng)基。研究者利用富氮(缺氮)—富磷(磷限制或缺磷)6種不同營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基對(duì)斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)為缺氮—富磷時(shí)，S.obliquus的油脂積累能力達(dá)到最大[31]。Pistocchi等[32]發(fā)現(xiàn)曲殼藻(Achnanthesbrevipes)、細(xì)柱藻(Cylindrothecafusiformis)、擬菱形藻(Pseudonitzschiasp.)以及中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)在磷限制條件下，多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例下降，而單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸所占比例則有所提高。尹遜棟等[33]對(duì)4種海洋微藻的研究表明，氮限制和磷限制均會(huì)促進(jìn)微藻總脂含量的增加，但磷限制比氮限制的影響更為顯著。因?yàn)槲⒃宸N類、實(shí)驗(yàn)條件以及操作方法的不同，不同研究之間微藻脂肪酸的生產(chǎn)率存在很大的變化。在之前的報(bào)道中，主要將精力集中在氮元素對(duì)微藻脂肪酸積累的研究上，而忽略了對(duì)磷元素的研究。因此，后續(xù)應(yīng)該加強(qiáng)磷元素對(duì)微藻脂肪酸積累的研究。

2.1.4 鐵元素 對(duì)光合生物而言，鐵元素是葉綠體電子傳遞系統(tǒng)一個(gè)重要的輔助因子[34]，它會(huì)影響光合器官碳固定、電子傳遞以及光利用的能力[35-37]。鐵元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致植物光合活性、耗氧量以及生長(zhǎng)速率的降低[38-40]。Liu等[41]利用不同濃度梯度的FeCl3對(duì)C.vulgaris進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，其在在高鐵培養(yǎng)基中的油脂積累能力明顯高于低鐵培養(yǎng)基。研究發(fā)現(xiàn)C.sorokiniana[42]、Monoraphidiumsp. FXY-10[43]、S.obliquus[44]等微藻在高鐵培養(yǎng)基中的油脂積累能力也明顯高于低鐵培養(yǎng)基。與上述結(jié)果相反的是，鐵濃度增加會(huì)提高C.reinhardtii的細(xì)胞密度和生長(zhǎng)速率，但卻抑制了其油脂的積累，這表明鐵元素對(duì)不同種類微藻碳源流向的調(diào)控存在一定差異[45]。通過(guò)不同濃度的FeSO4對(duì)三角褐指藻(Phacodactylumtricornutum)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，不同鐵濃度對(duì)其脂肪酸的含量影響顯著，隨著鐵濃度的升高，P.tricornutum的脂肪酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)[46]。這說(shuō)明鐵濃度過(guò)高并不能繼續(xù)促進(jìn)微藻油脂的積累，反而會(huì)抑制脂肪酸的合成。

2.1.5 硅元素 硅元素是硅藻生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，其不但參與硅藻細(xì)胞壁的構(gòu)成，還參與蛋白質(zhì)、DNA、光合色素等的生物合成以及細(xì)胞分裂等多種代謝途徑和生長(zhǎng)過(guò)程[47]。研究發(fā)現(xiàn)，硅缺乏會(huì)引起脂肪酸生物合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的乙酰-CoA羧化酶活性的增強(qiáng)，促使主要的碳代謝流轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的生物合成，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)之前合成的非脂化合物也可以逐漸轉(zhuǎn)化為脂類，在上述過(guò)程的雙重作用下，促使微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量的增加[48-49]。程軍等人[50]通過(guò)研究纖細(xì)角毛藻(Chaetocerosgracilis)和新月細(xì)柱藻(Cylindrothecaclosterium)兩種硅藻發(fā)現(xiàn)，在缺氮缺硅條件下適當(dāng)延長(zhǎng)收獲時(shí)間能夠顯著提高兩種微藻的油脂含量，造成上述現(xiàn)象的原因可能是硅藻光合作用生成的有機(jī)物更多的轉(zhuǎn)向了脂肪酸合成，而在缺氮情況下生成的蛋白質(zhì)的量相對(duì)的減少。

2.2 物理因素對(duì)微藻脂肪酸合成的影響

2.2.1 光照強(qiáng)度 光照是微藻生長(zhǎng)、發(fā)育以及繁殖的能量來(lái)源，當(dāng)光照強(qiáng)度適宜時(shí)，能促進(jìn)微藻進(jìn)行光合作用，從而使更多的碳代謝流轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)以及脂肪酸等物質(zhì)的生物合成。Ra等[51]利用紅、藍(lán)、紫、綠4種不同顏色的發(fā)光二極管(LEDs)以及日光燈作為光源對(duì)綠藻Picochlorumatomus進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光源為L(zhǎng)EDs時(shí)，微藻的生物量以及脂肪酸含量明顯高于日光燈。其中，當(dāng)光源為紅色LEDs時(shí)，微藻的生物量最大，而當(dāng)光源為綠色LEDs時(shí)，微藻的脂肪酸積累能力最強(qiáng)。因此，研究者決定通過(guò)兩步光照培養(yǎng)法來(lái)提高P.atomus脂肪酸的收獲量，首先使用紅色LEDs作為光源來(lái)獲得微藻的最大生物量，其次利用綠色LEDs作為光源來(lái)促進(jìn)微藻的脂肪酸積累。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藍(lán)色LEDs作為光源時(shí)，Chlorellasp.的脂肪酸積累能力最強(qiáng)[52]。這說(shuō)明微藻種類不同，促進(jìn)微藻脂肪酸進(jìn)行最大積累的光源種類也可能有區(qū)別。Goold等[53]發(fā)現(xiàn)C.reinhardtii在持續(xù)光照條件下三酰甘油的生產(chǎn)率明顯高于氮限制培養(yǎng)條件，這表明持續(xù)光照有可能是促進(jìn)微藻脂肪酸大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵要素。

大量研究表明，在一定的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，微藻脂肪酸的積累能力隨著光照強(qiáng)度的升高而增強(qiáng)；而當(dāng)光照強(qiáng)度過(guò)飽和時(shí)，細(xì)胞內(nèi)參與光合作用的細(xì)胞器受到光氧化損傷，繼而影響對(duì)光的吸收能力和利用效率，造成微藻脂肪酸合成率的降低。Ra等[54]利用綠色發(fā)光二極管作為光源培養(yǎng)3種微擬球藻NannochloropsisOculata、NannochloropsisOceanica以及Nannochloropsissalina后發(fā)現(xiàn)，這3種微擬球藻脂肪酸的積累能力都隨著光照強(qiáng)度的升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)，上述3種微藻進(jìn)行油脂最大積累的最適光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1。但對(duì)于月形藻(Scenedesmussp. 11-1)而言，利于其脂肪酸積累的最適光強(qiáng)大約為250 μmol·m-2·s-1[55]。這說(shuō)明微藻種類不同，促進(jìn)微藻脂肪酸進(jìn)行最大積累的光照強(qiáng)度也可能會(huì)有區(qū)別。

2.2.2 溫度 溫度是影響酶活的重要因素之一，酶活性的變化會(huì)對(duì)微藻生物質(zhì)產(chǎn)量、脂肪酸積累等生理過(guò)程產(chǎn)生一定的影響。溫度脅迫能夠強(qiáng)烈影響微藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的利用以及對(duì)CO2的固定作用，進(jìn)而導(dǎo)致藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率、脂肪酸含量和組成發(fā)生變化[56]。研究表明，在一定的溫度范圍內(nèi)，微藻的脂肪酸積累能力隨著溫度的升高而加強(qiáng)，當(dāng)超過(guò)最適溫度時(shí)，脂肪酸的積累能力隨之減弱。然而，溫度對(duì)微藻脂肪酸積累的影響因種而異，四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)和C.vulgaris的脂肪酸積累最適溫度為30℃，小型黃絲藻(Tribonemaminus)在25和35 ℃下的油脂積累能力相當(dāng)，而月形藻(Scenedesmussp. LX1)在20℃下的脂肪酸積累能力最強(qiáng)[57-59]。溫度是影響微藻脂肪酸組成的重要因素之一，Vince等[60]發(fā)現(xiàn)不同的溫度條件下3種小球藻的脂肪酸組成和含量都有所差別。通常情況下，溫度降低可以促進(jìn)微藻不飽和脂肪酸的生成，而溫度升高則有助于提高飽和脂肪酸的含量，但研究者發(fā)現(xiàn)改變溫度對(duì)小球藻Chlorellasp. MACC-728的脂質(zhì)產(chǎn)量和脂肪酸甲酯的組成并沒(méi)有顯著的影響[60-62]。研究發(fā)現(xiàn)，一些微藻生長(zhǎng)和脂肪酸積累的最適溫度并不一致，為了解決上述矛盾，可以利用微藻在最適生長(zhǎng)溫度下積累生物量而在最適脂肪酸積累溫度下積累脂肪酸的特點(diǎn)，采用兩步溫度培養(yǎng)法促使微藻的脂肪酸積累達(dá)到最大，即微藻先在最適生長(zhǎng)溫度條件下積累生物量，培養(yǎng)一定時(shí)期后再轉(zhuǎn)移至最適脂肪酸積累溫度條件下積累脂肪酸。

2.2.3 鹽度 能生存于較大鹽度范圍的生物稱為廣鹽性生物，反之為狹鹽性生物。鹽度較大幅度變化時(shí)，因?yàn)闈B透作用的關(guān)系，細(xì)胞可能萎縮或漲破。生活在不同水體環(huán)境中的微藻都能產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物(多糖、油脂、小分子蛋白等)來(lái)維持與外界環(huán)境的滲透壓平衡[59]。因此，培養(yǎng)體系中鹽度的改變可能會(huì)造成微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量和組成發(fā)生變化。小球藻C.sorokinianaHS1能夠在高鹽度的環(huán)境中生存，當(dāng)培養(yǎng)液中NaCl濃度從0 g/L上升到60 g/L(鹽度為60)時(shí)，微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的含量隨NaCl濃度的升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，其中，當(dāng)NaCl的濃度為30 g/L時(shí)，微藻油脂的積累能力最強(qiáng)[63]。對(duì)雙眉藻(Amphorasubtropica)和杜氏藻(Dunaliellasp.)的研究表明，當(dāng)培養(yǎng)液中NaCl的濃度從0.5 mol/L上升至2 mol/L時(shí)，2種微藻飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的含量均有所增加，而多不飽和脂肪酸所占比例則相應(yīng)減小[64]。研究表明，部分微藻在較低鹽度下生長(zhǎng)較好，而在較高鹽度則有利于微藻脂肪酸的積累。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的鹽度可以促進(jìn)微藻脂肪酸積累。

2.3 其他因素

除上訴因素外，維生素、植物生長(zhǎng)激素、微量元素、接種密度、溶解氧、通氣速率以及生物反應(yīng)器的類型等也是微藻培養(yǎng)過(guò)程中要考慮的關(guān)鍵因素，其對(duì)微藻生物質(zhì)生產(chǎn)和脂肪酸積累具有重要的影響[68]。

3 微藻脂肪酸生物合成基因工程研究進(jìn)展

微藻通常在生長(zhǎng)繁殖速率受限的條件下才能促進(jìn)脂肪酸的最大積累，所以，很難實(shí)現(xiàn)微藻生長(zhǎng)繁殖和脂肪酸大量積累的同步提高。因此，微藻脂肪酸的產(chǎn)業(yè)開發(fā)仍需尋找新的途徑去解決。隨著測(cè)序技術(shù)的逐漸發(fā)展，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)的相繼出現(xiàn)使得我們對(duì)微藻脂肪酸生物合成的機(jī)理有了一定的認(rèn)識(shí)，在此基礎(chǔ)上，可以對(duì)已經(jīng)進(jìn)行基因測(cè)序的微藻進(jìn)行基因操縱，從而改變微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量和組成(表3為微藻脂肪酸生物合成基因工程的部分實(shí)例)。

3.1 藍(lán)藻脂肪酸合成的基因工程

藍(lán)藻是可以進(jìn)行光合作用的原核生物，又叫藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌。在藻類生物中，藍(lán)藻是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、最原始的單細(xì)胞生物。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，藍(lán)藻比真核藻類更容易進(jìn)行基因操作，并可以操控游離脂肪酸分泌到培養(yǎng)基中，這個(gè)培養(yǎng)體系可以減少微藻脂肪酸收獲、脫水以及提取的經(jīng)濟(jì)成本。正因?yàn)槿绱耍{(lán)藻脂肪酸合成工程以及游離脂肪酸分泌的研究逐漸成為科學(xué)界研究的熱點(diǎn)[69]。2009年，研究者首次利用基因插入技術(shù)將植物的脂肪酸合成酶成功轉(zhuǎn)入五代突變?cè)逯昙?Synechocystissp. PCC 6803)中，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藻細(xì)胞密度為1.5×108cells/mL時(shí)，其能以每天(133±12) mg/L的產(chǎn)量分泌脂肪酸[70]。Liu等[71]在五代突變菌株Synechocystissp. PCC 6803的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行第六代改良后發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞密度增加到1.0×109cells/mL的情況下，其脂肪酸的分泌速率增加到(197±14) mg/L。然而，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻的脂肪酸含量較低，從經(jīng)濟(jì)可行性出發(fā)，如若進(jìn)行大規(guī)模的脂肪酸生產(chǎn)以及使用，目前還存在一定的困難。

表3 微藻脂肪酸生物合成基因工程的部分實(shí)例

3.2 真核微藻脂肪酸合成的基因工程

與藍(lán)藻相比，真核微藻的油脂含量較高，一般情況下，富油微藻的油脂含量可達(dá)其干重的30%～50%，美國(guó)水生物種項(xiàng)目(Aquatic Species Program, ASP)篩選的富油藻種中，多為硅藻和綠藻。為了有效促進(jìn)微藻的脂肪酸生物合成，我們必須對(duì)微藻的脂肪酸合成途徑進(jìn)行詳細(xì)的生化研究并闡明其固有的調(diào)控模式。目前，國(guó)內(nèi)外研究的內(nèi)容主要包括ACCase基因和TEs基因兩個(gè)方面。在植物的脂肪酸合成步驟中，ACCase被認(rèn)為是第一個(gè)關(guān)鍵限速酶。研究發(fā)現(xiàn)從小環(huán)藻(Cyclotellacryptica)和球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中純化得到的ACCase的動(dòng)力學(xué)特征與其他植物的ACCase相似[72-73]；研究者利用基因槍技術(shù)將C.cryptica的ACCase基因在C.cryptica和舟形藻(Naviculasaprophila)中過(guò)量表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ACCase基因的過(guò)量表達(dá)沒(méi)有造成兩種微藻脂肪酸生產(chǎn)量的增加[74]。上述現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與脂肪酸生物合成途徑的反饋抑制有關(guān)，ACCase活性雖然增強(qiáng)但是被其他代謝途徑所抵消，導(dǎo)致脂肪酸的含量沒(méi)有明顯提高。研究已經(jīng)證實(shí)甘藍(lán)型油菜中的ACCase對(duì)聚山梨酸酯的生成具有抑制作用[75]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在不同的生長(zhǎng)周期和營(yíng)養(yǎng)條件下，Chromeravelia和Isochrysisaff.galbana兩種微藻細(xì)胞中ACCase表達(dá)量的變化并不一定會(huì)引起脂肪酸積累的變化[76]，這說(shuō)明ACCase酶并不是影響微藻脂肪酸生物合成的唯一調(diào)控因素。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將TEs轉(zhuǎn)入到微藻細(xì)胞是一個(gè)可以改變脂肪酸成分的有效方法，因?yàn)門Es的作用是使脂肪酸碳鏈的延伸得以終止，它從功能上決定了脂肪酸生物合成的最終產(chǎn)物。高等植物的TEs具有高度的特異性和底物選擇性，例如，F(xiàn)atA TEs作用于C18:1-ACP，而FatB TEs則作用于一系列飽和的?；?ACP(C8-C14)[77]。與植物TEs相比，微藻TEs沒(méi)有顯示出高度的特異性和底物選擇性。例如，C.reinhardtii的基因組測(cè)序顯示CrTE是其基因組中發(fā)現(xiàn)的唯一的脂肪酸TEs，而研究卻發(fā)現(xiàn)C.reinhardtii生產(chǎn)的脂肪酸則是由多種不同長(zhǎng)度以及不同飽和度的脂肪酸組成，這證明CrTE可以作用于一系列的脂?；?ACP碳鏈[78]。在綠藻C.reinhardtii葉綠體中過(guò)量表達(dá)內(nèi)源性CrTE基因后發(fā)現(xiàn)脂肪酸的碳鏈變短，同時(shí)肉豆蔻酸(C14:0)的生產(chǎn)量也有所增加，研究者認(rèn)為肉豆蔻酸生產(chǎn)量增加的原因可能是葉綠體中CrTE和脂?；?ACP之間化學(xué)計(jì)量的平衡被打破，從而使脂?；?ACP過(guò)早的發(fā)生了水解[79]。與之相反的是，在P.tricornutum中過(guò)量表達(dá)內(nèi)源性PtTE基因并沒(méi)有改變脂肪酸的組成[80]。最近的一些研究也嘗試將高等植物的TEs利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入到真核藻類中去改變微藻的脂肪酸組成。通過(guò)基因工程的方法將加州月桂的FatB TEs(C12:0)基因和香樟的FatB TEs(C14:0)基因轉(zhuǎn)入到P.tricornutum中發(fā)現(xiàn)，脂肪酸的合成向理想的短鏈表型方向轉(zhuǎn)變，其中，C12:0的含量增加了6.2%，而C14:0增加了15%[81]，而將加州月桂和萼距花的TEs轉(zhuǎn)入到C.reinhardtii的葉綠體中并沒(méi)有觀察到脂肪酸組成的改變[79,82]。上述研究表明改變微藻的脂肪酸組成并不簡(jiǎn)單，我們有必要進(jìn)一步發(fā)掘微藻脂肪酸生物合成的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，從而有效改變微藻細(xì)胞脂肪酸的組成。

4 總結(jié)與展望

通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)，提高微藻的脂肪酸含量可以通過(guò)環(huán)境因素調(diào)控和基因工程兩種方式來(lái)進(jìn)行。環(huán)境因素調(diào)控雖然會(huì)促進(jìn)微藻脂肪酸的積累，但大多是以犧牲細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖為代價(jià)的，因此需要對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化以保證微藻可以正常生長(zhǎng)繁殖。目前，科學(xué)界已經(jīng)對(duì)微藻的脂肪酸合成機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，在此基礎(chǔ)上，我們可以對(duì)微藻進(jìn)行基因工程操作。但脂肪酸的合成機(jī)制非常復(fù)雜，簡(jiǎn)單的操縱一個(gè)基因或者幾個(gè)基因很難達(dá)到理想的效果，因而需要全面了解微藻脂肪酸的內(nèi)在合成機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的快速發(fā)展，為全面了解微藻脂肪酸的內(nèi)在合成機(jī)制提供了可能。前期研究中，筆者對(duì)瑪氏骨條藻Skeletonemamarinoi不同生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建了S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑，其與微藻脂肪酸合成示意圖(見圖1)基本一致；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些與脂肪酸生物合成相關(guān)的編碼基因，如乙酰-CoA羧化酶基因、丙二酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)酰酶基因以及硫脂酶基因等。通過(guò)分析S.marinoi不同生長(zhǎng)時(shí)期脂肪酸合成途徑中的基因表達(dá)后推測(cè)，S.marinoi在穩(wěn)定期和衰亡期的脂肪酸合成能力高于指數(shù)期。造成上述結(jié)果的可能原因是微藻生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中N和P等營(yíng)養(yǎng)元素逐漸被耗盡，使微藻的生長(zhǎng)處于營(yíng)養(yǎng)限制條件下，從而導(dǎo)致S.marinoi脂肪酸的積累能力加強(qiáng)。后續(xù)研究可以從兩個(gè)方面對(duì)S.marinoi脂肪酸合成的分子機(jī)制進(jìn)行探索。首先可通過(guò)測(cè)定S.marinoi不同生長(zhǎng)時(shí)期脂肪酸含量和組成來(lái)對(duì)前期研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，其次可利用相對(duì)定量的方法對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行分析，研究其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控途徑，進(jìn)而對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下的S.marinoi進(jìn)行蛋白組分析，以期從多個(gè)層次來(lái)解釋S.marinoi脂肪酸合成的內(nèi)在分子機(jī)制。

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展使了解和改造微藻的脂肪酸合成途徑成為可能，但要實(shí)現(xiàn)微藻脂肪酸的工業(yè)化生產(chǎn)，目前還存在很多困難。值得關(guān)注的是，高等植物的脂肪酸生物合成相關(guān)研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，為微藻的脂肪酸合成研究提供了很好的借鑒，相信未來(lái)微藻脂肪酸生物合成研究一定會(huì)取得更大進(jìn)步。