引物間隔臂修飾對液相芯片食源性致病菌檢測的影響

史贇學(xué)，劉文森，許娜，朱文赫，孫成彪，賈靜，沈明浩，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130000；2.中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春130000）

近年來食品安全受到世界各國的普遍關(guān)注，越來越多的組織和機(jī)構(gòu)參與實施和加強(qiáng)防治牲畜細(xì)菌性人畜共患病，致使食源性致病菌感染的數(shù)量逐年穩(wěn)步下降[1]。盡管加強(qiáng)了對食源性致病菌感染的防控措施，仍無法消除其在全球范圍的危害。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球每年由于食源性致病菌感染患病人數(shù)達(dá)6億，死亡約42萬人[2]。美國每年因食源性微生物致病的人數(shù)仍有7 600萬，死亡約5 000人；英國每年也有130余萬人患食源性疾病[3]。食源性疾病給衛(wèi)生系統(tǒng)帶來很大的負(fù)擔(dān)，大大降低了生產(chǎn)力，給人類帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。建立有效的食源性致病菌檢測體系，快速并且準(zhǔn)確地完成對食品中致病菌的檢測已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

鼠傷寒沙門氏菌在全球范圍內(nèi)被認(rèn)為是引起食源性疾病常見的細(xì)菌[5]，而且鼠傷寒沙門氏菌是中國第二大食源性致病菌，每年約有40%的細(xì)菌性食物中毒事件與它有關(guān)，鼠傷寒沙門氏菌易污染肉制品、海鮮、乳制品，從而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)[6－7]。志賀氏菌是引起細(xì)菌性痢疾最常見的致病菌，全球每年細(xì)菌性痢疾的病例超過2億，死亡人數(shù)超過65萬人，在中國廣大農(nóng)村地區(qū)由于醫(yī)療衛(wèi)生條件差，經(jīng)常有由于水源或者食品被志賀氏菌污染而引起的痢疾、腹瀉等疾病流行的報道[8－9]。

液相芯片是一種新型高效的檢測工具。相對于常規(guī)傳統(tǒng)檢測方法，其檢測方法更快速便捷、方便可靠，通量更高。傳統(tǒng)液相芯片檢測方法需要對微球進(jìn)行多次洗滌，微球雜交前需要提前解鏈，步驟較為繁瑣，給試驗增加了不可控性。因此，本試驗在引物與探針間引入間隔臂，減少了微球洗滌的步驟，節(jié)省時間，提高陽性信號值。本研究在建立穩(wěn)定試驗方法基礎(chǔ)上，對有無間隔臂修飾的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行對比，為液相芯片在食源性致病菌檢測的應(yīng)用中提供了探索依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門氏菌（CMCCB50115）和福氏志賀氏菌株（CMCC51573）保藏于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全控制實驗室。

1.2 試劑與儀器

Mgaplex－TAG磁性微球、Luminex200鞘液：美國Luminex有限公司；R－phycoerythrin conjugate：美國Invitrogen有限公司；EmeraldAmp2XPremix：大連TAKARA有限公司；Bacterial genomic DNA minor preparation kit：杭州Axygen有限公司；蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉：美國BD公司；其他所有化學(xué)試劑均為分析等級。

Luminex200液相芯片分析系統(tǒng)：美國Luminex有限公司；G－1000型梯度PCR儀：杭州博日科技有限公司；ND－1000型紫外分光光度計：美國Thermo Scientific有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

從基因庫（GenBank）中查找鼠傷寒沙門氏菌與志賀氏菌的全序列，通過文獻(xiàn)和比對，選擇相應(yīng)序列的保守區(qū)間，使用Primer5.0與Oligo7.0進(jìn)行引物設(shè)計。試驗設(shè)置間隔臂修飾組（S）與未修飾組（W），修飾組組上游引物5’端添加特異性標(biāo)簽序列TAG，TAG與引物間連接間隔臂（Spacer C3）進(jìn)行修飾，未修飾組上游引物5’端添加特異性標(biāo)簽序列Anti－TAG。兩組下游引物5’端均由生物素（biotin）進(jìn)行修飾。引物均由吉林庫美生物有限公司合成見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA提取

取-80℃保藏的菌株于LB平板培養(yǎng)基上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液12 000 r/min離心1 min，使用Axygen細(xì)菌組DNA提取試劑盒分別提取細(xì)菌組DNA，-20℃保存待用。使用前用ND-1000分光光度計定量至10 ng/μL。

1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系及條件確定

基因組DNA，PCR體系：取細(xì)菌基因組DNA0.5 μL為模板，EmeraldAmp 2 x Premix12.5 μL，上下游引物各0.5μL，ddH2o補(bǔ)足至25μL。PCR條件：94℃變性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，共 35個循環(huán)，72℃變性5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用3%瓊脂糖凝膠電泳對結(jié)果進(jìn)行檢查，對修飾組與未修飾組的擴(kuò)增情況進(jìn)行對比，確保兩組擴(kuò)增之間無明顯差距。

1.3.4 雜交體系及條件的確定

設(shè)置間隔臂修飾與未修飾兩組，每組加入PCR產(chǎn)物6 μL，加入每種Anti-TAG微球2 500個，使用移液器吹打混勻。37℃避光雜交30 min（普通組雜交前增加92℃3 min解鏈）。使用雜交緩沖液將藻紅蛋白稀釋到 10 μg/mL，每組雜交產(chǎn)物中加入 75 μL，40 ℃避光孵育30 min。

1.3.5 退火溫度的優(yōu)化

退火溫度分別選擇 52、54、56、58、60 ℃，對多重的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。雜交條件1.3.4所示，對最終產(chǎn)物進(jìn)行Luminex上機(jī)檢測，得到熒光值強(qiáng)度中值并進(jìn)行分析，挑選最高熒光信號值所對應(yīng)的退火溫度。

1.3.6 微球雜交溫度優(yōu)化

微球雜交溫度分別設(shè)置為35、38、40、42℃，通過上機(jī)檢測熒光值強(qiáng)度中值進(jìn)行結(jié)果判定，選擇熒光信號最高組所對應(yīng)的雜交溫度。

1.3.7 微球雜交時間優(yōu)化

使用1.3.6優(yōu)化得到額雜交溫度，微球雜交時間分別取 20、25、30、35 min，通過對比檢測結(jié)果，選擇熒光值強(qiáng)度中值最高的組所對應(yīng)的時間，并分析有無間隔臂對實驗結(jié)果的影響。

1.3.8 體系特異性

調(diào)整PCR模板進(jìn)行交叉試驗，使用優(yōu)化后的條件。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行微球雜交與藻紅蛋白孵育，然后進(jìn)行液相芯片上機(jī)檢測，對熒光值強(qiáng)度中值進(jìn)行分析處理并對比有無間隔臂對結(jié)果的影響。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗

使用所得到的最佳條件，確保在相同情況下，設(shè)計不同批次同組間的平行試驗用以驗證檢測體系穩(wěn)定性和重復(fù)性，共分批進(jìn)行3次試驗，對上機(jī)檢測熒光值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算變異系數(shù)（CV%），以驗證其穩(wěn)定性。

變異系數(shù)公式：變異系數(shù)/%=標(biāo)準(zhǔn)差/算數(shù)平均值×100

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增鑒定

按照配置的體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 PCR反應(yīng)結(jié)果Fig.1 Multiplex PCR reaction

1、2泳道131 bp處分別是C3修飾與未修飾組的鼠傷寒沙門氏菌擴(kuò)增條帶，3、4泳道72 bp處為志賀氏菌的擴(kuò)增條帶，5、6泳道為修飾與未修飾組的兩種菌的多重擴(kuò)增。

2.2 退火溫度優(yōu)化

退火溫度分別設(shè)置為 52、54、56、58、60 ℃，最終上機(jī)檢測熒光值強(qiáng)度中值結(jié)果如圖2所示。

圖2 退火溫度對熒光值強(qiáng)度中值的影響Fig.2 Effect of annealing temperature on median fluorescence intensity

C3修飾組的陽性熒光值強(qiáng)度中值均高于未修飾組2倍以上，當(dāng)退火溫度為56℃時，熒光值強(qiáng)度中值最高，故選擇56℃作為最適退火溫度。

2.3 雜交溫度的優(yōu)化

雜交溫度分別設(shè)置為35、38、40、42℃4個溫度，最終檢測熒光值結(jié)果如圖3。

圖3 微球雜交溫度對熒光值強(qiáng)度中值的影響結(jié)果Fig.3 Effect of microsphere hybridization temperature on median fluorescence intensity

修飾組的陽性值高于未修飾組2倍以上，可以看出當(dāng)雜交溫度38℃時，得到的熒光值強(qiáng)度中值最高，因此使用38℃為最終雜交溫度。

2.4 雜交時間的優(yōu)化

使用38℃作為雜交溫度，雜交時間分別選擇20、25、30、35 min，最后機(jī)檢測熒光值強(qiáng)度中值結(jié)果如圖4所示。

圖4 雜交時間對熒光值強(qiáng)度中值的影響結(jié)果Fig.4 Effect of hybridization time on median fluorescence intensity

修飾組高于未修飾組1.5倍以上其中30、35 min是熒光值強(qiáng)度中值相近較高，考慮到試驗整體的快速性，因此選用30 min為最終雜交時間。

2.5 特異性試驗

3組特異性試驗使用優(yōu)化后的各種條件，最終反應(yīng)檢測熒光信號值結(jié)果如圖5所示。

可以看出檢測體系特異性良好，并且修飾組陽性值均高于未修飾組1.5倍以上。

2.6 穩(wěn)定性試驗

圖6所示不同批次試驗之間，陽性結(jié)果沒有明顯變化。間隔臂修飾組均于普通組2倍以上，各批次間的熒光值強(qiáng)度中值變異系數(shù)（CV）均在8%以內(nèi)，表明該體系穩(wěn)定性良好。

圖5 特異性交叉試驗對熒光值強(qiáng)度中值的影響結(jié)果Fig.5 Effect of specific crossover experiments on the median fluorescence intensity

圖6 穩(wěn)定性試驗檢測熒光值強(qiáng)度中值影響結(jié)果Fig.6 Stability test results on the median value of fluorescence intensity

3 討論與結(jié)論

目前對食源性致病菌的檢測已經(jīng)趨于成熟，如Wang等[10]使用實時PCR和數(shù)字PCR檢測乳制品中鼠傷寒沙門氏菌，并比較了兩種方法的特異性、靈敏性和檢測時間，分析了兩種方法各自的優(yōu)缺點。Shao等[11]使用多重環(huán)節(jié)到等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法可以同時擴(kuò)增牛奶中沙門氏菌和志賀氏菌，通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶來檢測是否有特異性擴(kuò)增，得到較好結(jié)果。但是，傳統(tǒng)多重PCR在檢測和分析結(jié)果方面有一些局限性并且有檢測通量小，效率低等問題，需要使用瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒別條帶，因此對引物的設(shè)計需要考慮到區(qū)別目的條帶的大小等問題，這個問題可以通過液相芯片xTAG技術(shù)解決，xTAG技術(shù)通過使用特異性的寡核苷酸序列標(biāo)記微球，對不同的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析并且可以取得較好的結(jié)果[12]。

液相芯片是近年來興起的核酸和蛋白全面檢測的技術(shù)，和一般的病原分離鑒定，瓊脂擴(kuò)散試驗、血凝抑制實驗、免疫熒光實驗和酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等方法相比，具有操作簡便、試驗時間短、高通量、重復(fù)性好、靈敏度高及線性范圍寬等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用在各類病原體檢測與研究中[13-15]。試驗對引物進(jìn)行了間隔臂（Spacer C3）進(jìn)行修飾，不僅可以縮短檢測時間，穩(wěn)固了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針的連接，省卻了解鏈的步驟，簡化了試驗操作并縮短了檢測時間，陽性值較未修飾平均有1.5以上的提升，起到了良好的信號放大作用。對退火溫度、雜交溫度和時間這些條件的優(yōu)化，更加完善了檢測體系。通過混合模板進(jìn)行交叉試驗、多批次的試驗證明建立的液相芯片多重致病菌檢測方法，驗證其穩(wěn)定性和特異性均良好。

該液相芯片檢測方法的建立，不僅可以對食源性致病菌的防治和傳播起到積極作用，而且為致病菌感染的預(yù)防和趨勢起到預(yù)警，間隔臂的使用在檢測領(lǐng)域，將會具有廣闊的前景。