桑黃菌絲體多糖的提取及其免疫活性研究

（衡水學(xué)院，河北衡水053000）

桑黃是一種珍貴的藥用真菌，其醫(yī)療保健功能很高，桑黃多糖為其主要的活性成分[1-3]。目前常用低溫低壓法、熱水浸提法、超聲提取法和微波提取法等方法提取桑黃多糖[4-7]。低溫低壓法和熱水浸提法為提取真菌多糖的傳統(tǒng)方法，這些方法提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率比較低；超聲提取法和微波提取法相對(duì)熱水浸提法提取時(shí)間短，提取率都要高[6]，但提取率仍不夠理想。目前，將超聲提取法和微波提取法結(jié)合起來(lái)提取桑黃菌絲體多糖的報(bào)道很少見(jiàn)，本研究擬用超聲波-微波協(xié)同法提取桑黃菌絲體多糖，旨在最大限度提高其提取率，并對(duì)提取的桑黃菌絲體多糖進(jìn)行免疫活性方面的研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)桑黃提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃：衡水學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供。為液體發(fā)酵得到的桑黃菌絲體，60℃下恒溫烘干。

苯酚：成都榮成化工有限公司；濃硫酸：任丘市九環(huán)化工有限責(zé)任公司；葡萄糖：洛陽(yáng)丹城葡萄糖有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SXT-CW-2000型超聲-微波協(xié)同反應(yīng)儀：北京恒奧德儀器儀表有限公司；722型分光光度計(jì)：上海屹譜儀器制造有限公司；FA1004C型電子天平：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲-微波法提取桑黃菌絲體多糖

1.3.1.1 提取工藝[7-10]

桑黃菌絲體→粉碎（分別過(guò)不同孔徑的篩網(wǎng)來(lái)調(diào)節(jié)物料粒度）→加蒸餾水浸泡→置于超聲-微波協(xié)同反應(yīng)儀，固定超聲功率→微波輻射→離心→得上清液→濃縮為原體積的1/4→加入乙醇進(jìn)行沉淀→離心→得沉淀→冷凍干燥→桑黃菌絲體多糖

1.3.1.2 桑黃菌絲體多糖的測(cè)定[11]

采用苯酚-硫酸法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），以葡萄糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)。波長(zhǎng)490 nm下，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=6.720 5 x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。再測(cè)定桑黃菌絲體多糖樣品的吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算樣品的多糖含量。

圖1 苯酚-硫酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phenol-vitriol

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

最佳物料粒度的確定[12-13]：固定超聲波功率為250 W，微波功率550 W，微波處理時(shí)間8 min，料液比1∶20（g/mL）。最佳物料粒度依次為0.125（對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)目數(shù)：120 目）、0.150（100 目）、0.180（80 目）、0.250（60 目）、0.425（40目）mm的條件下，測(cè)定桑黃菌絲體多糖含量，并計(jì)算多糖提取率。根據(jù)測(cè)定桑黃菌絲體多糖的含量，確定最佳物料粒度。

最佳料液比的確定：采用得到的最佳物料粒度，固定超聲波功率為250 W，微波功率550 W，微波處理時(shí)間 8 min。料液比依次為 1 ∶15、1∶20、1∶25、1 ∶30、1∶35（g/mL）的條件下，測(cè)定桑黃菌絲體多糖含量，確定最佳料液比。

最佳微波功率的確定：采用得到的最佳料液比和最佳物料粒度，固定超聲波功率為250 W，微波處理時(shí)間 8 min，微波功率依次為 400、450、500、550、600 W的條件下，測(cè)定桑黃菌絲體多糖含量，確定最佳微波功率。

最佳微波處理時(shí)間的確定：采用得到的最佳物料粒度、最佳料液比和最佳微波功率，固定超聲波功率為 250 W，微波處理時(shí)間依次為 4、6、8、10、12 min 的條件下，測(cè)定桑黃菌絲體多糖含量，確定最佳微波處理時(shí)間。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在固定超聲波功率為250 W的條件下，選擇料液比、物料粒度、微波功率、微波處理時(shí)間，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。測(cè)定桑黃菌絲體多糖含量，并計(jì)算多糖提取率來(lái)確定最佳的提取工藝條件。L9（34）正交表的因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.3.2.3 免疫活性的測(cè)定[14-15]

頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌操作下取小鼠的脾臟，然后研磨成細(xì)胞懸液。在96孔酶標(biāo)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，加完全培養(yǎng)液20 μL作為陰性對(duì)照；加完全培養(yǎng)液10 μL和Con A（刀豆蛋白A）10 μL作為陽(yáng)性對(duì)照；取桑黃菌絲體多糖樣品，配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL 的溶液，陽(yáng)性試驗(yàn)孔同時(shí)加入桑黃菌絲體多糖樣品溶液10 μL和Con A 10 μL，置于5%的CO2培養(yǎng)箱中（溫度為37℃）培養(yǎng)72 h。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)時(shí)，每孔加入無(wú)菌的噻唑藍(lán)10 μL（濃度為5 mg/mL）。培養(yǎng)完成后，每孔加10%的十二烷基硫酸鈉100 μL終止其反應(yīng)，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值。免疫調(diào)節(jié)活性采用刺激指數(shù)（stimulate index，SI）表示。SI值越大，表明桑黃菌絲體多糖的免疫活性越強(qiáng)。

式中：SI為刺激指數(shù)；OD1為桑黃菌絲體多糖樣品在490 nm處的吸光度值；OD2為陽(yáng)性對(duì)照組在490 nm處的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 物料粒度對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響

物料粒度對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 物料粒度對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響Fig.2 The material size influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由圖2可知，當(dāng)物料粒度達(dá)到0.180 mm時(shí)，多糖提取率最高，桑黃菌絲體多糖提取率為4.437%。隨著物料粒度增大，微波產(chǎn)生的能量到達(dá)物料顆粒中心的距離增大，作用效果變?nèi)酰嗵翘崛÷手饾u降低；但是物料粒度過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致物料發(fā)生焦糊現(xiàn)象，不利于多糖溶出，多糖提取率也會(huì)降低。

2.1.2 料液比對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響

料液比對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響Fig.3 The ratio of material to liquid influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時(shí)，由于溶劑量偏少，桑黃菌絲體多糖未能充分溶出，多糖提取率偏低，隨著溶劑的增多，多糖提取率逐漸提高，當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最高，桑黃菌絲體多糖提取率為4.493%。當(dāng)料液比在1∶25（g/mL）以后，隨著溶劑的進(jìn)一步增多，多糖提取率逐漸降低。

2.1.3 微波功率對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響

微波功率對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 微波功率對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響Fig.4 The microwave power influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由圖4可知，當(dāng)微波功率高于400 W時(shí)，伴隨著桑黃吸收微波能量逐漸增大，多糖提取率逐漸提高，功率達(dá)到500 W時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高值，桑黃菌絲體多糖提取率為4.832%。但當(dāng)功率高于500 W后，多糖結(jié)構(gòu)部分被破壞，發(fā)生一定程度降解，多糖提取率又逐漸降低。

2.1.4 微波處理時(shí)間對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響

微波處理時(shí)間對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 微波處理時(shí)間對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率的影響Fig.5 The microwave time influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由圖5可知，當(dāng)微波處理時(shí)間為6min，多糖提取率最高，桑黃菌絲體多糖提取率為5.017%。微波處理時(shí)間較短時(shí)，物料中微波能量積累少，桑黃細(xì)胞破碎的程度小，多糖溶出少，多糖提取率就低；隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞破碎的程度在增大，多糖溶出增多，多糖提取率升高；但是當(dāng)時(shí)間超過(guò)6min后，其它雜質(zhì)也開(kāi)始溶出，多糖提取率也逐漸降低。

2.2 L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝的研究

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

由表2和表3得知，物料粒度、微波功率和微波處理時(shí)間對(duì)桑黃菌絲體多糖提取率均有顯著地影響。按對(duì)提取率影響的重要性而言：C＞B＞D＞A，即微波功率＞物料粒度＞微波處理時(shí)間＞料液比。在固定超聲波功率為250 W的條件下，確定最佳的試驗(yàn)組合為A2B1C2D2，即料液比1∶25（g/mL），物料粒度0.150 mm，微波功率500 W，微波處理時(shí)間6 min。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)多糖提取率影響分析Table 2L9（34）Orthogonal test analysis of the impact of extraction rate of polysaccharide

表3 L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)多糖提取率影響的顯著性分析Table 3L9（34）Orthogonal test of the impact of significant extraction rate of polysaccharide analysis

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用超聲波-微波協(xié)同法最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)。做3個(gè)平行樣，再取平均值，得桑黃菌絲體多糖提取率為5.316%，高于超聲波法（桑黃菌絲體多糖提取率3.02%）和微波提取法的提取率（提取率4.18%）[6]。

2.4 小鼠免疫調(diào)節(jié)活性的影響

提取的桑黃菌絲體多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞免疫活性的影響見(jiàn)圖6。

圖6 桑黃菌絲體多糖樣品對(duì)小鼠脾細(xì)胞免疫活性的影響Fig.6 Effects of Phellinus igniarius Mycelia polysaccharides on splenic lymphocyte multiplication

如圖6所示，不同濃度的桑黃菌絲體多糖的SI（刺激指數(shù)）均大于1，表明在一定劑量下，提取的桑黃菌絲體多糖可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。桑黃菌絲體樣品濃度達(dá)到0.2 mg/mL后，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的促進(jìn)作用隨多糖樣品濃度的提高逐漸增強(qiáng)；當(dāng)多糖樣品濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，SI（刺激指數(shù)）為1.67，免疫調(diào)節(jié)活性達(dá)到最強(qiáng)；但當(dāng)多糖樣品濃度在超過(guò)1.0 mg/mL后，小鼠免疫調(diào)節(jié)活性呈下降趨勢(shì)，其機(jī)理尚不清楚，有待于深一步研究。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波-微波協(xié)同法，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了桑黃菌絲體多糖的最佳提取條件為：料液比1∶25（g/mL），物料粒度0.150 mm，超聲波功率為250 W，微波功率500 W，微波處理時(shí)間6 min。此條件下桑黃菌絲體多糖提取率為5.316%。小鼠免疫調(diào)節(jié)活性試驗(yàn)表明，在一定劑量范圍內(nèi)，桑黃菌絲體多糖能明顯增強(qiáng)小鼠的免疫功能，本試驗(yàn)為進(jìn)一步大規(guī)模的開(kāi)發(fā)桑黃菌絲體多糖提供了基礎(chǔ)。