海南黑山羊幼畜誘導(dǎo)卵泡發(fā)育與體外胚胎移植的應(yīng)用研究

易 華 ，張家新 ，張 通 ，趙華林 ，林奕全 ，王運(yùn)俅 ，劉春潔 ，周廣悅 ，王 琛 郭志勤，史梅英，韓雪華，朱建明*

（1.海南三亞雪古麗現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司，海南 三亞 572000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.新疆畜牧科學(xué)院，烏魯木齊 830000）

幼畜體外胚胎移植（Juvenile In Vitro Embryo Transfer,JIVET)是誘導(dǎo)卵泡超數(shù)發(fā)育結(jié)合活體取卵、卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和胚胎移植等技術(shù)環(huán)節(jié)生產(chǎn)擴(kuò)繁優(yōu)秀純種后代的技術(shù)體系，該技術(shù)體系已從實(shí)驗(yàn)室逐步轉(zhuǎn)入了生產(chǎn)應(yīng)用。目前，在羊的繁殖體系中，利用JIVET技術(shù)挖掘和利用優(yōu)秀母畜的遺傳潛力，在相對較短的時(shí)間里，從一只母羊獲得更多遺傳穩(wěn)定的后代，相比傳統(tǒng)的方法快幾倍、甚至幾十倍，大大提高了優(yōu)良種羊群的繁殖效率，已成為我國肉羊良種繁育體系建設(shè)的重要繁殖生物技術(shù)之一[1-3]。

海南黑山羊是中國熱帶地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖的優(yōu)良山羊品種資源，成年羊不經(jīng)激素處理活體采卵平均每只僅能獲得2～8枚卵母細(xì)胞，經(jīng)激素處理平均每只能獲得10～20枚卵母細(xì)胞。羔羊卵巢上儲備著大量的卵源細(xì)胞，有腔卵泡的數(shù)量在出生后4～8周齡達(dá)到高峰，且對促性腺激素刺激敏感[4-5]。幼畜體外胚胎生產(chǎn)效率低，很大程度上與羔羊卵母細(xì)胞體外核質(zhì)成熟不同步有關(guān)。生理性減數(shù)分裂抑制劑C型鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）在抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂誘導(dǎo)卵母細(xì)胞體外核質(zhì)同步成熟過程中發(fā)揮了重要作用[6-7]。

目前，關(guān)于海南黑山羊JIVET技術(shù)的研究報(bào)道較少，本研究以海南黑山羊幼齡羔羊?yàn)檠芯繉ο?，采用JIVET技術(shù)快速擴(kuò)繁黑山羊后代，比較了供體羔羊激素處理方案、羔羊卵母細(xì)胞體外成熟體系并進(jìn)行了幼畜體外胚胎移植，旨在挖掘和利用優(yōu)秀母羊的早期繁殖潛力，促進(jìn)黑山羊JIVET技術(shù)的應(yīng)用推廣。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

TCM-199 培養(yǎng)液、含 Ca2+、Mg2+磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline,DPBS）、青鏈霉素合劑（Penicillin-Streptomycin,PS）均為Gibco公司產(chǎn)品；促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）購自于 Vetoquinol公司；雌二醇（E2）、胎牛血清（FBS）、透明質(zhì)酸酶（Hya）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙烯醇（PVA）均購自于Sigma公司。孕馬血清促性腺激素（PMSG）購自于寧波三生生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供體羔羊超數(shù)誘導(dǎo)卵泡發(fā)育處理

選擇35～45日齡健康無疾病的海南黑山羊供體羔羊進(jìn)行激素處理，采用間隔12 h對供體連續(xù)4次或6次進(jìn)行等劑量肌肉注射FSH，同時(shí)比較了最后一次注射FSH有無給予250 IU PMSG注射的效果。依據(jù)卵巢上卵泡發(fā)育數(shù)量、回收的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體數(shù)以及體外受精后胚胎的卵裂率和囊胚率篩選最佳海南黑山羊羔羊激素超排方案。

1.2.2 采集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體

供體羔羊肌肉注射速眠新進(jìn)行全身麻醉，按體重0.023～0.033 mL/kg注射，供體麻醉后在手術(shù)架上仰臥保定。外科手術(shù)打開腹腔，引出卵巢，采用無菌10 mL注射器12#針頭從卵巢表面抽取卵泡，采卵前需在注射器中預(yù)先抽取1～2 mL采卵液，在體視顯微鏡下挑選出含有卵丘細(xì)胞比較完整、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）用于體外成熟（In Vitro Maturation，IVM）。采卵液成分為：TCM-199+1 mg/mL BSA+0.7 mg/mL肝素鈉。

1.2.3 卵細(xì)胞體外成熟

將洗滌后的COCs進(jìn)行隨機(jī)分組，常規(guī)法：將挑選COCs轉(zhuǎn)入成熟液中進(jìn)行常規(guī)24 h、26 h、28 h體外成熟；“雙階段”法：將挑選的COCs放入200 nM CNP抑制液中孵育4 h，然后再移入成熟液中進(jìn)行體外成熟，培養(yǎng)環(huán)境為38.5℃，5%CO2：95%空氣、飽和濕度。CNP預(yù)培養(yǎng)液成分：TCM-199+CNP+0.1%BSA，成熟液成分為：TCM-199+10%(v：v)FBS+1%(v：v)PS+10 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+1 μg/mL E2+100 nM半胱胺+1%青鏈霉素合劑。

1.2.4 體外受精和體外培養(yǎng)

將新鮮精液300 μL輕輕加入已平衡 2 h以上含有 700 μL受精液中（受精液：SOF+2%發(fā)情綿羊血清（OSS）+6 IU/mL肝素鈉）的2個(gè)EP管底部，置于培養(yǎng)箱中孵育上游40 min。然后將上游液中的精液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，在1 300 r/min的條件下室溫離心4 min，棄掉上清液，再次加入1 mL受精液離心洗滌，再次棄掉上清液，留約200 μL精液沉淀，輕輕吹打混勻，將精液密度調(diào)整為約1×106個(gè)/mL。使用0.1%透明質(zhì)酸酶將成熟的卵母細(xì)胞外周的卵丘顆粒細(xì)胞部分吹打去除，并轉(zhuǎn)移到受精液培養(yǎng)滴中。將混合均勻的懸液的精液加入受精液內(nèi)與卵母細(xì)胞共同培養(yǎng)。

精子和卵子共同孵育24 h后，將假定的受精卵轉(zhuǎn)移到體外胚胎發(fā)育液中，用移液器反復(fù)抽吸吹打受精卵，去除黏附在顆粒細(xì)胞上的精子和外周顆粒細(xì)胞。將受精卵用發(fā)育液洗滌3次后，按50枚/孔的密度轉(zhuǎn)移到Nunc四孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)條件為：5%CO2、5%O2、90%N2、38.6℃飽和濕度的密封氣袋內(nèi)。受精后48 h統(tǒng)計(jì)卵裂率，在168 h統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.2.5 受體羊的選擇及處理

選擇繁殖性能良好，發(fā)情周期正常，無繁殖機(jī)能疾病，經(jīng)檢疫無傳染病，健康、膘情在七成以上，經(jīng)產(chǎn)黑山羊或當(dāng)?shù)芈檠蜃鳛槭荏w羊。受體羊同期化發(fā)情處理方法：采用陰道埋植海綿栓，撤栓24～72 h發(fā)情，采用試情公羊確認(rèn)發(fā)情移植。

1.2.6 胚胎移植

對受體羊進(jìn)行手術(shù)，根據(jù)黃體發(fā)育情況確定能否移植胚胎，使用移植管吸取胚胎，進(jìn)行輸卵管移植。將有黃體一側(cè)的輸卵管傘部拔開，找到管口后，將裝有胚胎的移植器從此插入3～4 cm，然后將胚胎輕輕推出即可，注意移植時(shí)保護(hù)黃體。

1.2.7 受體羊的飼養(yǎng)管理

對于完成移植的受體羊要由專人飼養(yǎng)和管護(hù)，每天注意觀測受體母羊健康狀況，發(fā)現(xiàn)異常情況要通知羊場負(fù)責(zé)人或獸醫(yī)及時(shí)處理。移植后一個(gè)情期時(shí)要對移植羊群進(jìn)行試情，返情羊要及時(shí)進(jìn)行人工配種或公羊自然交配，減少空懷羊的損失。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件中的ANAVO進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體羔羊激素處理方案的比較

如表1所示，采用間隔12 h對供體羔羊連續(xù)6次等劑量肌肉注射FSH，在最后一次注射FSH的同時(shí)肌肉注射250 IU PMSG，獲得的卵泡數(shù)、卵母細(xì)胞數(shù)和卵母細(xì)胞體外受精后卵裂率均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。但囊胚率在各組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。因此，后續(xù)試驗(yàn)均采用6次等量注射FSH結(jié)合肌肉注射250 IU PMSG的處理方案。

表1 供體羔羊激素處理方案的比較

2.2 羔羊卵母細(xì)胞體外成熟體系的研究

以常規(guī)卵母細(xì)胞體外成熟24 h（標(biāo)準(zhǔn)）、26 h和28 h為對照組，研究了200 nM CNP預(yù)孵育羔羊COCs 4 h，然后體外成熟24 h、26 h和28 h受精胚胎發(fā)育能力。如表2所示，200 nM CNP預(yù)孵育4 h然后體外成熟26 h的卵母細(xì)胞體外受精胚胎的卵裂率和囊胚形成顯著優(yōu)于常規(guī)成熟組和其他實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞（P＜0.05）。200 nM CNP預(yù)孵育COCs 4 h，然后體外成熟28 h后的卵裂率和囊胚率顯著降低（P ＜0.05）。

表2 CNP預(yù)處理對羔羊體外受精胚胎發(fā)育能力的影響

2.3 幼畜體外胚胎移植效果

2016-2018年通過處理共計(jì)28只海南黑山羊羔羊進(jìn)行幼畜體外胚胎移植，獲得可用胚胎1 257枚，平均每只羔羊獲得可用胚胎44枚，完成海南黑山羊幼畜體外胚胎移植81只，平均受胎率為37.66%，繁育健康后代35只，平均產(chǎn)羔率為42.9%，見表3。

表3 海南黑山羊幼畜體外胚胎移植結(jié)果

3 討 論

海南黑山羊具有耐高溫、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、肉品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，是中國熱帶地區(qū)規(guī)?；?、集約化、產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖寶貴的優(yōu)良山羊品種資源，也是我國黑山羊重要的遺傳資源[8]。隨著肉羊產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及胚胎體外繁育技術(shù)的發(fā)展，高效快繁技術(shù)是加速品種改良進(jìn)程，提高良種化種群的有效手段。幼畜體外生產(chǎn)胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系作為一種高效良種快繁技術(shù)之一，盡管在國內(nèi)外應(yīng)用該技術(shù)獲得了健康后代，但幼畜誘導(dǎo)卵泡效果不穩(wěn)定、胚胎產(chǎn)出效率低仍是一個(gè)普遍問題[9]。

本研究選擇海南黑山羊幼羔為研究對象，利用JIVET技術(shù)生產(chǎn)后代，比較了不同激素處理方案誘導(dǎo)卵泡發(fā)育效果、羔羊卵母細(xì)胞體外成熟體系并進(jìn)行了胚胎移植。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予6×40 mg FSH等量注射，總劑量為240 mg，最后一次FSH處理時(shí)同時(shí)給予250 IU PMSG處理的羔羊,獲得的卵泡數(shù)、卵母細(xì)胞數(shù)、卵母細(xì)胞體外受精后卵裂率表現(xiàn)最優(yōu)。200 nM CNP預(yù)孵育4 h然后體外成熟26 h的卵母細(xì)胞體外受精胚胎的卵裂率和囊胚形成顯著提高了羔羊卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力，通過胚胎移植獲得黑山羊健康后代35只，平均產(chǎn)羔率為42.9%?？傊狙芯繛殚_展海南黑山羊幼畜體外胚胎移植、提高黑山羊繁育效率奠定了基礎(chǔ)。

幼齡羔羊卵巢內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制并未發(fā)育完全，卵巢上儲備著大量的有腔卵泡且對外源促性腺激素刺激敏感。本研究采用間隔12 h連續(xù)4次或6次肌肉注射等量FSH的方法，同時(shí)比較了最后一次注射FSH有無給予250 IU PMSG注射的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總劑量240 mg FSH注射結(jié)合250 IU PMSG處理的羔羊，獲得的卵泡數(shù)、卵母細(xì)胞數(shù)和卵母細(xì)胞體外受精后胚胎卵裂率效果最優(yōu)。本研究結(jié)果與Kelly等[11]人在綿羊幼齡羔羊給予4×40 mg FSH等量注射，最后一針FSH同時(shí)給予PMSG處理獲結(jié)果類似。因此，推斷6次肌肉注射等量FSH的方法，能夠刺激幼畜卵巢上排卵前卵泡生長發(fā)育成熟同時(shí)給予卵母細(xì)胞在體內(nèi)卵泡微環(huán)境中足夠長的在體內(nèi)發(fā)育時(shí)間。此外，PMSG處理提高了卵泡發(fā)育數(shù)和體外受精后的卵裂率，這表明PMSG有著明顯的促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟的作用。

與成年羊體外胚胎生產(chǎn)相比，限制JIVET技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用效率主要因素是羔羊卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力遠(yuǎn)不如成年羊[12]。在我們的研究中，采用生理性減數(shù)分裂抑制劑C型利鈉肽預(yù)孵育成年羊卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，然后進(jìn)行第二階段的體外成熟，構(gòu)建了“雙階段”體外成熟培養(yǎng)體系，顯著提高了卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，200 nM CNP預(yù)孵育4 h然后體外成熟26 h的卵母細(xì)胞體外受精胚胎獲得了卵裂率和囊胚率都顯著提高。Romero等[13]人在幼鼠中也發(fā)現(xiàn)C型利鈉肽類似的作用。這些結(jié)果表明，C型利鈉肽通過暫時(shí)抑制細(xì)胞核成熟進(jìn)程，延長卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)間，促進(jìn)了核質(zhì)同步成熟以及發(fā)育潛能的獲得。

4 結(jié) 論

目前，國內(nèi)外JIVET技術(shù)研究仍停留在實(shí)驗(yàn)階段。本研究通過海南黑山羊胚胎移植獲得了35只健康后代，平均產(chǎn)羔率達(dá)42.9%。與成年羊體外胚胎移植效果相比，幼齡羔羊體外胚胎產(chǎn)出效率低仍然是一個(gè)普遍問題。海南黑山羊JIVET技術(shù)體系仍需要科研工作者不斷地摸索、改善和提高。

總之，更好地發(fā)掘、發(fā)揮海南黑山羊JIVET技術(shù)體系在繁育體系中作用，對于促進(jìn)海南黑山羊良種擴(kuò)繁具有重要的意義。