健康人骨髓CD34+造血干/祖細胞衰老與年齡的相關(guān)性研究

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(1.重慶市第十三人民醫(yī)院神內(nèi)老年科，重慶 400053；2.重慶醫(yī)科大學(xué)干細胞與組織工程實驗室，重慶 400032)

老齡化問題日趨嚴(yán)重，成為社會科學(xué)與自然科學(xué)共同關(guān)注的熱點問題之一。干細胞衰老學(xué)說是當(dāng)今闡釋衰老理論和老年性疾病發(fā)生與發(fā)展的最新學(xué)說，該學(xué)說認為人體衰老就是其干細胞衰老所致。我課題組既往實驗證據(jù)證明[1-11]，小鼠造血干細胞隨年齡增加或者周圍環(huán)境變化及應(yīng)激中出現(xiàn)衰老，且呈現(xiàn)出一定變化規(guī)律。與小鼠類似，人類的造血作用隨年齡變化正常情況下可維持一種常態(tài)，但在周圍環(huán)境變化及應(yīng)激中可受到損傷，例如出血或癌癥化療的副作用導(dǎo)致造血干細胞被牽連,進而導(dǎo)致與骨髓發(fā)育不良和惡性腫瘤有關(guān)的血液疾病的風(fēng)險增加，說明人類造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSC)也可能隨老化而受損[12-13]。我們在此研究富含HSC和HPC的人CD34+細胞，希望通過觀察不同年齡組人類造血干細胞與年齡相關(guān)的衰老變化特點，同小鼠數(shù)據(jù)進行對比，尋求干預(yù)人類HSC衰老的最佳干預(yù)時間，達到對一系列造血疾患的預(yù)防或治療的目的。本課題組既往實驗證據(jù)證明[1-11]，一些天然藥物如人參皂苷Rg1及當(dāng)歸多糖可以通過雙向調(diào)節(jié)，抑制正常造血干細胞衰老，而對腫瘤干細胞則促進其衰老及凋亡，起到預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用。但何時為干預(yù)的最佳時機，希望通過本研究得到一點啟示。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與分組

由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科骨穿室提供正常人骨髓9例，將其分為青年組3例(女性31歲、男性26歲、男28歲)、中年組3例(男性59歲、男性57歲、女性52歲)和老年組3例(男性70歲、男性70歲、女性62歲)。

1.2 主要藥品與試劑

Human Anti-CD34 MicroBead Kit(FITC)(NO.130046703)，Mini MACS磁珠分選系統(tǒng)，MS磁珠分離柱，緩沖液(德國美天旎 Biotech公司)； 細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(C0602，碧云天生物技術(shù)有限公司)，人干細胞集落形成實驗專用混合培養(yǎng)基(Stem cell USA)，紅細胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)。Ficoll分離液(天津灝洋生物公司)。臺盼藍染液(C0011碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 免疫磁珠分離純化人骨髓CD34+HSC/HPC及流式細胞術(shù)測定純度腰椎穿刺獲取各年齡組人骨髓，置于抗凝管中，上下反復(fù)顛倒混勻，置于冰盒里，將骨髓用生理鹽水洗滌2次，移入離心管，離心后，加入5 mL紅細胞裂解液置于4 ℃冰箱5 min，生理鹽水洗滌，參照說明書，分離采集骨髓單個核細胞(BMNCs)，離心后用計數(shù)板計數(shù)細胞個數(shù)。取BMNCs 1×108個細胞加入100 μL Fcr blocking reagent、100 μL CD34 microbeads和300 μL Buffer，輕輕吹打混勻后4 ℃避光孵育30 min。將MS分選柱置于分離器磁場中，用干細胞專用buffer 沖洗MS柱2次。用一次性巴氏管將孵好抗體的細胞緩緩加到MS分選柱中，即將流盡后加1 mL buffer沖洗2次，向MS柱中加入1 mL buffer，用美天旎MS分選柱配套的活塞迅速推出柱子里的細胞，推出的細胞即為實驗需要的人骨髓CD34+HSC/HPC。分別取MACS 分選前已標(biāo)記MNCs和分選后陽性細胞1×106個，2 mL PBS 洗滌離心，使用流式細胞儀FACS Vantage SE ( 美國BD 公司) 檢測。每個樣品分析細胞數(shù)不少于2×104個細胞，用PC-LysysⅡ軟件在VAX3300 微機上進行分析。計算磁珠分選前后CD34+細胞百分比[1]。

1.4 臺盼藍染色檢測細胞的存活率

取CD34+HSC/HPC懸液每組各90 μL，加入臺盼藍染液(4 g/L)10 μL，染色后靜置3 min計數(shù)，通過顯微鏡下細胞計數(shù)板進行觀察及計數(shù)，透明不著色細胞為活細胞，著色脹大并染為淡藍色的為死細胞，按下列公式計算活細胞率=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%。

1.5 各年齡組CD34+HSC/HPC衰老相關(guān)β-半乳糖

苷酶(SA-β-gal)染色取各組人骨髓CD34+HSC/HPC 1×105個， 參照細胞衰老β半乳糖苷酶染色試劑盒說明書方法對各組細胞進行染色。倒置相差顯微鏡下觀察200個細胞，計數(shù)陽性細胞百分率。

1.6 各年齡組CD34+HSC/HPC形成造血干/祖細胞

混合集落(CFU-Mix)能力比較在離心管中收集各年齡組人CD34+造血干/祖細胞各4×104個，每組各加入1 mL干細胞混合集落專用培養(yǎng)基，用大號槍頭輕輕混勻，不能有氣泡，輕輕加到24 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔0.5 mL，每天用顯微鏡觀察細胞形態(tài)，培養(yǎng)到第7天時計數(shù)各組混合集落數(shù)并進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫磁性分選前后CD34+HSC/HPC純度比較

MACS分離純化后較分選前CD34+HSC/HPC純度明顯增加(圖1)，說明我們使用的分離純化方法安全有效[1]。

2.2 臺盼藍染色檢測細胞的存活率結(jié)果

各年齡組人骨髓CD34+造血干/祖細胞存活率均可達到99%以上，青年組(99.48±0.35)%，中年組(99.52±0.14)%，老年組(99.61±0.32)%。3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明我們分離的細胞存活率高，可用于后續(xù)的實驗研究。

2.3 各年齡組人CD34+HSC/HPC衰老變化

取各組CD34+HSC/HPC，通過SA-β-半乳糖苷酶染色后陽性細胞為藍色，細胞胞漿內(nèi)可見藍染顆粒；陰性細胞未著色青年組、中年組和老年組的陽性細胞數(shù)逐漸升高(圖2)，分別為(7.67±2.7)%、(66.3±4.7)%和(82.0±6.0)%。說明人CD34+造血干/祖細胞的SA-β-gal染色陽性率出現(xiàn)明顯的隨增齡變化趨勢。

a:磁珠分選前；b:磁珠分選后

*：與青年組比較，P<0.05

2.4 CD34+HSC/HPC混合集落形成能力比較

本實驗結(jié)果顯示，健康人類從青年到中年再到老年，CD34+HSC/HPC形成的CFU-Mix數(shù)量及其中細胞數(shù)逐漸減少，分別為(8.3±0.7)%、(6.3±0.7)%和(1.3±0.7)%，同年齡呈正相關(guān)(圖3)。說明隨年齡增加，人骨髓CD34+造血干/祖細胞增殖分化能力逐漸下降，與其衰老的結(jié)果呈正相關(guān)。

*：與青年組比較，P<0.05

3 討論

有越來越多的證據(jù)表明，衰老會誘導(dǎo)分子途徑的變化，從而加速干細胞和祖細胞突變的起始和/或克隆優(yōu)勢。老化相關(guān)的干細胞和祖細胞突變的積累與組織維持和癌癥抑制失敗之間的緊密聯(lián)系表明這些因素之間的因果關(guān)系[13-14]。除了此處討論的細胞內(nèi)在機制之外，越來越多的證據(jù)表明，細胞外的影響因素影響干細胞的維持以及可能在衰老過程中選擇突變干細胞和祖細胞。外部的影響因素包括老化相關(guān)的干細胞生態(tài)位缺陷，全身/血液循環(huán)環(huán)境改變[15-16]，干細胞與祖細胞增殖競爭變化[17]，炎癥反應(yīng)和受損細胞免疫監(jiān)視缺陷等[18-19]。細胞和分子機制的相互作用的描述促成了老齡化背景下干細胞和祖細胞突變的啟動和選擇，這無疑將有助于改善老化相關(guān)的器官功能障礙和癌癥早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)防和風(fēng)險評估。

隨著年齡變化人類造血功能通常可以維持穩(wěn)態(tài)，但環(huán)境因素及應(yīng)激反應(yīng)，如出血或癌癥化療副作用可能導(dǎo)致造血系統(tǒng)受損，并使造血干細胞被牽連[20-21]。因此普通腫瘤學(xué)通常建議減少老年人的化療劑量，但這可能影響治療效果。上述因素還會導(dǎo)致與骨髓發(fā)育不良和惡性腫瘤有關(guān)血液疾病的風(fēng)險增加，說明實際人類造血干細胞(HSC)可能隨老化而受損，類似于小鼠[22]。在小鼠中已經(jīng)廣泛研究了衰老HSC的影響，但是直到目前，針對人類的研究還是較少。在小鼠中，衰老的影響是變異依賴性的，并且增殖的HSC的數(shù)量與壽命相關(guān)[23-24]。在大多數(shù)小鼠品系中，HSC數(shù)量隨年齡增長而下降，但在長壽命的C57B1小鼠中，HSC數(shù)量，特別是邊群(SP)HSC數(shù)量增加，并且這些SP HSC在老年小鼠中具有增加的抗凋亡基因的表達。在小鼠和人類中，除了數(shù)量的變化，HSC的分化潛能朝向髓細胞(髓偏差)和遠離B淋巴細胞。T細胞庫的構(gòu)成也在數(shù)量和產(chǎn)生胸腺細胞的功能上顯著降低[10-11]。有研究顯示HSC衰老后，由于受損的DNA修復(fù)及端?？s短而出現(xiàn)衰老的損害，但是這對于人類的影響是不確定的?？赡苋祟愲S年齡增長出現(xiàn)HSC衰老，進而影響人類身體機能和造血系統(tǒng)的衰竭[25-28]。Xiao等[28]研究證實，在各種病理條件下活性氧物質(zhì)( ROS )的增加損害了HSC的自我更新，并主要通過誘導(dǎo)HSC衰老而導(dǎo)致HSC過早衰竭和BM抑制，癌基因誘導(dǎo)ROS和DNA損傷的積累以及隨后的細胞衰老，這是阻止轉(zhuǎn)化細胞生長形成腫瘤的重要障礙。

β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，隨年齡增加各組人CD34+HSC/HPC逐漸出現(xiàn)明顯的衰老，老年組陽性率明顯高于中年組及青年組。CD34+HSC/HPC混合集落形成能力研究還發(fā)現(xiàn)，健康人類從青年到中年再到老年，CD34+HSC/HPC形成的CFU-Mix數(shù)量及細胞數(shù)逐漸減少，同年齡呈正相關(guān)。這和SA-β-半乳糖苷酶染色結(jié)果一致，說明隨著年齡增加，CD34+造血干/祖細胞出現(xiàn)衰老，這導(dǎo)致其增殖分化能力降低，進而可能導(dǎo)致人體出現(xiàn)造血功能的異常。本研究結(jié)果提示，人類造血干細胞在中年時期可能就開始出現(xiàn)衰老。人參皂苷Rg1(Rg1)是人參中最活躍的成分之一，已被證明具有抗氧化和抗衰老的特性。Rg1對小鼠暴露的慢性地塞米松(5 mg/kg，28 d)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥損傷有保護作用。我課題組發(fā)現(xiàn)：Rg1通過增強BMSCs的抗氧化和抗炎能力，改善造血微環(huán)境的抗衰老能力。人參皂苷Rg1的通過抑制氧化應(yīng)激抵抗HSC/HPC對電離輻射誘導(dǎo)的衰老[10]。另外，人參皂苷Rg1能夠保護睪丸免受D-gal誘導(dǎo)的小鼠衰老，并且Rg1的保護作用可以通過抗氧化和p19/p53/p21等信號傳導(dǎo)途徑的下調(diào)來實現(xiàn)[29]。根據(jù)本實驗結(jié)果，如果使用Rg1之類抗衰老藥物進行干預(yù)，是否需要在中年時期之前或者中期時期更為合適？這也是以后我們感興趣的研究方向。