雞卡氏桿菌GZ2017株的分離與16 S rRNA序列分析

張升波，溫貴蘭*，陳紹品，李昌紅，林漢卿，徐 麗，管國丹，汪德生*，嵇幸勤，文 明，周碧君，程振濤

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025， 2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025)

雞卡氏桿菌病是由雞卡氏桿菌(Gallibacteriumanatis)引起的危害蛋雞重要的傳染病之一，臨床上常以輸卵管囊腫和卵巢炎等為主要特征[1]。1950年，Hansen首次發(fā)現(xiàn)卡氏桿菌，1960年被定為溶血性巴氏桿菌，Christensen H等[2]2003年以該細(xì)菌的微生物學(xué)和分子生物學(xué)特征將鴨巴氏桿菌、輸卵管炎放線桿菌和溶血性巴氏桿菌合并，組成巴氏桿菌科的一個(gè)新屬——卡氏桿菌屬，并且將禽卡氏桿菌定為該屬的代表種?？ㄊ蠗U菌具有條件致病菌的典型特征，受細(xì)菌和病毒的混合感染、寄生蟲感染、應(yīng)激和激素失調(diào)等易感因素的影響[3-4]。有報(bào)道認(rèn)為，卡氏桿菌是不同品種健康禽類的上呼吸道和下生殖道正常菌群之一，但有研究表明卡氏桿菌與產(chǎn)蛋雞的病理損傷有關(guān)[5]?？ㄊ蠗U菌能引起產(chǎn)蛋雞輸卵管病變和腹部膨大，使雞呈企鵝狀，造成產(chǎn)蛋量下降，嚴(yán)重感染雞群產(chǎn)蛋量可下降30%，產(chǎn)蛋雞最終因輸卵管囊腫、卵黃性腹膜炎及貧血、消瘦而導(dǎo)致死亡[6-8]。由卡氏桿菌引起的輸卵管炎、腹膜炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道該細(xì)菌的相關(guān)毒力因子[9-10]。雞卡氏桿菌能夠引起多種禽類患病，包括雞、火雞、鴨、鵝、鸚鵡、鵪鶉和珍珠雞，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。王川慶等[12]在2008年首次報(bào)道了我國雞場中普遍存在卡氏桿菌的感染的情況，相繼有報(bào)道在四川和遼寧地區(qū)也分離到了致病性卡氏桿菌[13-14]。本試驗(yàn)對貴州某白羽蛋雞養(yǎng)殖場送檢的病雞處理后進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，通過藥物敏感性試驗(yàn)篩選出了該分離菌株敏感藥物，并進(jìn)行了16 S rRNA序列分析鑒定，最終確定該送檢病雞為雞卡氏桿菌感染。該研究為該雞場對雞卡氏桿菌病的防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 本次試驗(yàn)病料來源于貴州某白羽蛋雞養(yǎng)殖場處于產(chǎn)蛋高峰期的3只發(fā)病雞。

1.1.2 主要試劑 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、瓊脂糖、革蘭染色劑、抗菌藥物藥敏紙片、微量生化反應(yīng)管，杭州微生物試劑有限責(zé)任公司產(chǎn)品；胎牛血清，海博生物有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；2×EsTaqDNA Polymerase，康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 臨床表現(xiàn)和剖檢病變 觀察病雞的臨床表現(xiàn)，并對病雞進(jìn)行剖檢，觀察解剖病理變化，記錄結(jié)果。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基的配制均參照文獻(xiàn)[15]介紹方法由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌操作從送檢雞的心臟、肝臟、脾臟、腎臟和上腭裂等組織器官進(jìn)行取樣，用接菌環(huán)接種于鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基，分別在厭氧與需氧條件下37℃培養(yǎng)24 h后，挑選形態(tài)不同的菌落在巧克力培養(yǎng)基和含50 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)菌革蘭染色鏡檢 分別挑取巧克力培養(yǎng)基和含50 mL/L胎牛血清的普通培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行革蘭染色，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.2.5 細(xì)菌生化試驗(yàn) 在無菌操作臺用齒輪將生化管鋸開，用接種環(huán)將經(jīng)過純培養(yǎng)后的細(xì)菌接種在細(xì)菌生化管內(nèi)，石蠟封頂后置于37℃培養(yǎng)24 h～48 h之后進(jìn)行觀察記錄。

1.2.6 細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 取100 μL純培養(yǎng)菌液均勻涂抹于含50 mL/L胎牛血清瓊脂平板上，用紙片法將30種藥敏片粘貼于平板上，于37℃培養(yǎng)24 h，記錄所有藥敏片的抑菌圈尺寸大小，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI 2016)抗微生物藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性判斷。

1.2.7 16 S rRNA的PCR擴(kuò)增與測序 參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取細(xì)菌DNA，提取的細(xì)菌DNA置于-20℃冰箱保存。細(xì)菌16 S rRNA引物序列為F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，預(yù)擴(kuò)增片段長度約為1500 bp，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×EsTaqDNA Polymerase 12.5 μL，DNA 2 μL，H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s；50℃ 30 s；72℃ 1.5 min,共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

1.2.8 分離株16 S rRNA序列分析 將所測分離菌株的16 S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的序列進(jìn)行比對，運(yùn)用DNA Star7.0中的MegAlign軟件將所測的16 S rRNA序列與巴氏桿菌科中15個(gè)屬和沙門菌共23株菌的16 S rRNA序列作比對，并應(yīng)用MEGA5.05軟件中的N-J方法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，參考菌株[14]的詳細(xì)信息見表1。

表1 參考菌株信息

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理變化

該養(yǎng)殖場產(chǎn)蛋率下降，發(fā)病雞精神委頓，食欲下降，臉部輕微腫脹，鼻部有黃色鼻液流出，濕啰音，拉黃白稀糞。靜脈放血致死后進(jìn)行解剖病變觀察，發(fā)現(xiàn)雞肝區(qū)體表投影處肌肉可見黃色粒狀結(jié)節(jié)干酪樣物質(zhì)，有心包積液，腹腔有充滿清亮、透明液體的囊包(圖1～圖3)。

圖1 病雞臉部水腫、流黃色鼻液

圖2 心包積液

圖3 輸卵管出現(xiàn)透明液體的囊包

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

挑取鮮血瓊脂養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于巧克力培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。由圖4可知，該分離菌在巧克力培養(yǎng)基上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、邊緣整齊的均一小菌落。

圖4 分離菌株在巧克力培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.3 革蘭染色鏡檢結(jié)果

挑取在培養(yǎng)基上經(jīng)純培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢結(jié)果顯示該細(xì)菌被染成紅色，細(xì)菌形態(tài)呈兩端鈍圓的球桿菌，菌體單個(gè)散在或成對分布，根據(jù)革蘭染色結(jié)果可判斷分離的細(xì)菌為革蘭陰性球桿菌。

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果見表2，結(jié)果顯示該分細(xì)菌能利用蔗糖、甘露糖、麥芽糖、蕈糖、葡萄糖、蜜二糖和果糖；精氨酸水解酶，硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性；不能利用木糖、乳糖、甘露醇、N-乙酰葡糖胺、山梨醇，枸緣酸鹽、V-P和尿素酶試驗(yàn)為陰性。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，該分離菌株對米諾環(huán)素和萬古霉素極度敏感，對多西環(huán)素和頭孢哌酮高度敏感，對哌拉西林、羧芐西林、頭孢曲松、氧氟沙星、頭孢拉定、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那和新霉素中度敏感，對頭孢唑林、頭孢呋辛、呋喃唑酮、多黏菌素和氯霉素低度敏感，對氨芐西林、頭孢他啶、紅霉素、苯唑西林、卡那霉素、四環(huán)素、青霉素、克林霉素、麥迪霉素和復(fù)方新若明不敏感。

2.6 16 S rRNA PCR擴(kuò)增及序列比對結(jié)果

PCR擴(kuò)增出該分離菌株的16 S rRNA基因序列后，將PCR產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行序列測定，測得該分離菌株的16 S rRNA核苷酸序列為1 464 bp，經(jīng)NCBI比對發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增出來的16 S rRNA核苷酸序列與GenBank上公布的HN-HL-2-XZQ-G(GenBank：HM241884.1)和Yu-ZK-XC-6-XZQ(GenBank：FJ841972)16 S rRNA核苷酸序列同源性高達(dá)99%以上，可以判定該分離菌株為卡氏桿菌，并將該分離菌株命名為GZ2017。

表2 分離菌株生化反應(yīng)結(jié)果

注：“十”陽性；“一”陰性。

Note：“+”Positive;“-”Negative.

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 GZ2017株16 S rRNA序列同源性分析結(jié)果

采用MegAlign軟件中的Cluster W方法對GZ2017分離株與巴氏桿菌科的22株細(xì)菌和沙門菌進(jìn)行16 S rRNA序列同源性分析。同源性分析結(jié)果顯示(圖5)，本試驗(yàn)分離的卡氏桿菌GZ2017株與巴氏桿菌科22株細(xì)菌16 S rRNA序列同源性為89.2%～99.2%；與Gallibacteriumanatis同源性為98.6%～99.2%，與中國分離株Yu-HL-huang-1-SLG(GenBank：GQ423347)同源性最高，為99.2%；與其他卡氏桿菌屬Gallibacteriumsalpingitidis、Gallibacteriummelopsittaci和Gallibacteriumtrehalosifermentans同源性分別為92.1%、94.2%、93.3%；與其他巴氏桿菌科其他屬(Pasteurella、Actinobacillus、Haemophilus等)的同源性都低于93.3%，與丹麥分離株P(guān)h13; CCUG 26828(GenBank：AF053901)同源性最低，為89.2%，而與沙門菌的同源性為86.8%。

2.8 GZ2017株16 S rRNA序列遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果

基于細(xì)菌16 S rRNA序列，采用MEGA5.05軟件中的N-J方法，將分離菌GZ2017與巴氏桿菌科的22株細(xì)菌和沙門菌共24株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖6)。結(jié)果顯示，P.phocoenarum、Chelonobacteroris和Histophilussomni這3個(gè)屬單獨(dú)成一分支，以Gallibacteriumanatis和Haemophilusaegyptius為代表的各成一大分支，分離菌GZ2017同Gallibacterium屬細(xì)菌同屬于一個(gè)分支，且與日本分離株P(guān)PQC2013-MTSKWH3(GenBank：KU060245)在同一分支上，這表明分離菌GZ2017與日本分離株P(guān)PQC2013-MTSKWH3進(jìn)化關(guān)系最近，屬于雞卡氏桿菌。

圖5 分離菌株GZ2017株16 S rRNA序列同源性比對

圖6 分離菌株GZ2017 16 S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

近年來，隨著畜禽集約化程度不斷提高、環(huán)境變化等因素的影響，雞卡氏桿菌病在我國逐漸成為危害禽類特別是產(chǎn)蛋雞的一種重要疾病。該病傳播的常見途徑是水平傳播，但也能垂直傳播[16]。該病臨床表現(xiàn)無特異性，主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量下降，這很難與其他造成雞產(chǎn)蛋量下降的疾病進(jìn)行鑒別診斷。有研究表明用副雞禽桿菌和卡氏桿菌共感染SPF雞，可引起SPF雞嚴(yán)重的上呼吸道癥狀，通過接種滅活疫苗可以減輕由兩種細(xì)菌共感染引起的臨床癥狀[17]。禽卡氏桿菌對生長營養(yǎng)要求嚴(yán)格，本結(jié)果表明該菌在血平板和巧克力培養(yǎng)基上生長良好，能在50 mL/L的胎牛血清普通培養(yǎng)基上生長。本試驗(yàn)采用細(xì)菌傳統(tǒng)的鑒定方法和16 S rRNA序列分析方法對分離菌進(jìn)行鑒定，并結(jié)合藥敏試驗(yàn)篩選出了該分離菌株的敏感藥物。試驗(yàn)結(jié)果表明該分離菌株為革蘭陰性球桿菌，生化試驗(yàn)結(jié)果與卡氏桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道基本一致[11,18]；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離細(xì)菌對米諾環(huán)素和萬古霉素極度敏感，對多西環(huán)素和頭孢哌酮高度敏感，但對對氨芐西林、頭孢他啶、紅霉素、苯唑西林、卡那霉素、四環(huán)素、青霉素、克林霉素、麥迪霉素和復(fù)方新若明不敏感，表明該細(xì)菌該菌已對多種抗生素產(chǎn)生了廣泛耐藥性，在臨床用藥時(shí)應(yīng)注意聯(lián)合用藥和穿梭用藥。

16 S rRNA基因在細(xì)菌遺傳進(jìn)化中相對保守，而它的可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異，是細(xì)菌分類的分子基礎(chǔ)，反映了物種間的親緣關(guān)系，病原菌分離之后，采用16 S rRNA序列分析確定禽卡氏桿菌感染是可行的[14,19]。本試驗(yàn)分離菌株16 S rRNA序列于NCBI上進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)該分離株擴(kuò)增出來的16 S rRNA核苷酸序列與GenBank上公布的其他卡氏桿菌的16 S rRNA核苷酸序列同源性高達(dá)99%以上，同源性分析結(jié)果顯示,分離菌株GZ2017的16 S rRNA序列與中國分離株Yu-HL-huang-1-SLG(GenBank：GQ423347)同源性最高(99.2%)，與丹麥分離株P(guān)h13 CCUG 26828(GenBank：AF053901)同源性最低(89.2%)，分離菌GZ2017與Gallibacterium屬細(xì)菌同屬于一個(gè)分支，且與日本分離株P(guān)PQC2013-MTSKWH3(GenBank：KU060245)在同一分支上，這表明分離菌GZ2017與日本分離株P(guān)PQC2013-MTSKWH3進(jìn)化關(guān)系最近，屬于雞卡氏桿菌，最終確定該雞場為雞卡氏桿菌感染。有學(xué)者研究報(bào)道，禽呼吸道和生殖道感染是雞卡氏桿菌重要的感染途徑[9]，本分離株是從患有呼吸道癥狀病雞的上腭裂分離出來的，可以認(rèn)為病雞的呼吸道癥狀是由卡氏桿菌感染引起的，這與鄭鹿平推測的結(jié)果一致[20]。研究結(jié)果可為雞卡氏桿菌病的防控與治療提供理論數(shù)據(jù)。