豬流產(chǎn)衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

周丹娜，李文浩，阮 征,劉 威，郭 銳，楊克禮,段正贏,袁芳艷,劉澤文,陳文杰，孟 麗，焦祖武*，田永祥*

(1.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所,湖北武漢 430064；3.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,湖北武漢 430016)

流產(chǎn)衣原體(Chlamydophilaabortus,C.abortus)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人獸共患病病原微生物，可以導(dǎo)致宿主的結(jié)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎及腸炎等疾病，孕婦和懷孕母畜都十分容易被感染并引起流產(chǎn)或發(fā)生死胎[1]。流產(chǎn)衣原體不僅對(duì)人類的生命帶來了嚴(yán)重的威脅，而且還給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)危害[2]。對(duì)全國(guó)不同地區(qū)的豬場(chǎng)進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)豬流產(chǎn)衣原體血清抗體陽(yáng)性檢出率普遍偏高[3]。使用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行C.abortus的檢測(cè)比較繁瑣，而且極易造成污染導(dǎo)致結(jié)果無效或虛假陰陽(yáng)性，難以滿足臨床檢測(cè)需要。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的成熟，諸如RT-PCR、套式PCR、雙重PCR等多種方法被廣泛應(yīng)用于衣原體的病原檢測(cè)，提高了衣原體檢測(cè)的準(zhǔn)確性和敏感性，但難以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控及定量分析。本研究構(gòu)建C.abortusmomp基因的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，通過軟件進(jìn)行基因編碼序列分析并設(shè)計(jì)特異性引物和分子信標(biāo)探針(5′-FAM、3′-Dabycl)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，擬建立C.abortus實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株、病毒C.abortusHB1043株、E.coliDH5α、Mycoplasma、C.suis、C.pneumoniae、PRRSV基因組，均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，愛思進(jìn)(杭州)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品； MiniBEST universal genomic DNA extraction kit ver.5.0試劑盒、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ、10×T buffer、rTaq酶、dNTP Mix、DNA Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；2×Phanta EVO HS Master Mix高保真酶、2×TaqMaster Mix PCR預(yù)混液，諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒小提試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；GeneCopoeia All-in-OneTMqPCR Mix，復(fù)能基因生物科技有限公司產(chǎn)品；STEPONE plus熒光定量PCR儀、Stepone2.2軟件，美國(guó)LIFE科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的C.abortusHB1043株momp全基因序列(JN411078)，利用DNA Man 8.0和Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針(表1)，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物和探針信息

1.2 方法

1.2.1 豬流產(chǎn)衣原體陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒從C.abortusHB1043株陽(yáng)性卵黃膜液中抽提其DNA，以其為模板，利用ecp-momp和ecp-momp2引物[4]，進(jìn)行C.abortusmomp基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pMD18-T隆載體上并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，用含有氨芐青霉素抗性的LA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。提取陽(yáng)鑒定無誤的陽(yáng)性質(zhì)粒，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度和純度，計(jì)算出質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的確立 以構(gòu)建的MOMP-T陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)中將探針濃度分別設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L 7個(gè)梯度進(jìn)行優(yōu)化，確定探針最佳反應(yīng)濃度后，在引物優(yōu)化反應(yīng)中所采取的引物濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 、0.25 、0.30、0.35 μmol/L 7個(gè)濃度，確定好引物及探針的最佳反應(yīng)濃度后，進(jìn)行Tm值優(yōu)化，選取溫度梯度范圍為50.0、51.1、52.8、55.3、58.9、61.5、63.1、64.0℃共8個(gè)梯度。通過確立最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)條件以達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行8個(gè)梯度的倍比稀釋，從1×100拷貝/μL ～1×107拷貝/μL，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增，記錄Ct值和循環(huán)數(shù)，通過計(jì)算以Ct值為橫坐標(biāo)，拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R和擴(kuò)增效率，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)。選用模板分別是流產(chǎn)衣原體DNA、MOMP-T質(zhì)粒、豬瘟病毒(CSFV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及日本腦炎病毒(JEV)的核酸進(jìn)行特異性試驗(yàn)，同時(shí)各設(shè)置1孔陰性對(duì)照和空白對(duì)照。根據(jù)PCR反應(yīng)曲線和Ct值確定該檢測(cè)方法的特異性。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn) 使用分光光度計(jì)對(duì)衣原體重組質(zhì)粒的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度的測(cè)定，同時(shí)結(jié)合OD 260 nm/OD 280nm比值，計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)，其計(jì)算公式：陽(yáng)性重組質(zhì)?？截悢?shù)(拷貝/μL)=(6.02×1023×稀釋倍數(shù)×質(zhì)粒濃度×10-9)/(660 Da×質(zhì)粒堿基長(zhǎng)度)。經(jīng)計(jì)算將陽(yáng)性質(zhì)粒濃度為進(jìn)行1.0×1012拷貝/μL 10倍稀釋(1.0×1012-1.0拷貝/μL)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以Ct值<35為下限判定其靈敏度。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn) 將MOMP-T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，從1×106拷貝/μL～1×104拷貝/μL，每個(gè)梯度重復(fù)3次進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，通過計(jì)算每個(gè)稀釋度Ct值和拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)來驗(yàn)證該方法的批內(nèi)重復(fù)性。在3個(gè)不同的時(shí)間檢測(cè)保存于-20℃的3個(gè)濃度的MOMP-T質(zhì)粒樣品，來驗(yàn)證模板的穩(wěn)定性及熒光定量PCR的批間重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 采用本研究建立的方法對(duì)2個(gè)豬場(chǎng)采集的30份樣品提取核酸進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)real-time PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行16 S/23 S rRNA擴(kuò)增及測(cè)序[5]，檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備結(jié)果

用CA-momp-F/R引物對(duì)MOMP-T進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增片段與預(yù)測(cè)的目的片段大小251 bp相一致(圖1)，初步判定重組的質(zhì)粒是陽(yáng)性。將C.abortus質(zhì)粒MOMP-T的測(cè)序結(jié)果分別與GenBank中已登錄的momp基因序列比對(duì)，BLAST結(jié)果顯示，C.abortus的質(zhì)粒MOMP-T序列與GenBank中登錄的序列同源性為94%。純化后的質(zhì)粒DNA濃度為1.0×1012拷貝/μL，OD 260 nm/OD 280nm為1.96。說明構(gòu)建的C.abortus陽(yáng)性質(zhì)粒的純度比較高，能滿足試驗(yàn)檢測(cè)要求。將其稀釋成1×100拷貝/μL ～1×107拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件和體系的確立

通過動(dòng)力學(xué)曲線和擴(kuò)增效率判斷優(yōu)化的結(jié)果，最終反應(yīng)體系為20 μL，包括2×OneTMqPCR Mix 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL、探針(10 μmol/L)0.2 μL、滅菌去離子水7.8 μL、模板1 μL；其反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 10 s，55.3℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；4℃結(jié)束反應(yīng)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.MOMP-T質(zhì)粒；2.陰性對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000；1.MOMP-T；2.Negative control

2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建結(jié)果

將流產(chǎn)衣原體陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋8個(gè)梯度100～107拷貝/μL，使用本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以Ct值為橫坐標(biāo)，拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制稀釋后拷貝數(shù)100拷貝/μL～107拷貝/μL對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，R=0.993 2，方程式為y=-0.289 4x+12.762，擴(kuò)增效率為94.7%。由此可見本檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率高,熒光曲線與所檢測(cè)的靶基因濃度之間相關(guān)性好,準(zhǔn)確性高。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

C.abortus特異性試驗(yàn)鑒定所使用的DNA有流產(chǎn)衣原體、陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品MOMP-T、豬肺炎支原體、豬衣原體、肺炎衣原體和豬藍(lán)耳病病毒。經(jīng)過熒光定量PCR擴(kuò)增后，結(jié)果僅C.abortus的DNA和陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品MOMP-T DNA有擴(kuò)增曲線，其余均沒有擴(kuò)增曲線(圖3)，表明該檢測(cè)方法良好的特異性。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

將MOMP-T質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比梯度稀釋，應(yīng)用優(yōu)化后的各條件所建立的方法進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，結(jié)果顯示C.abortus實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的靈敏度為1.0拷貝/μL(圖4)，由于嗜衣原體基因組內(nèi)的MOMP基因是單拷貝基因[4]，因此衣原體模板的分子數(shù)可推算為10 fg DNA相當(dāng)于1個(gè)拷貝的基因[6]，證明方法具有較高的敏感性。

1.流產(chǎn)衣原體；2.陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照；3.支原體；4.豬衣原體；5.肺炎衣原體；6.藍(lán)耳病毒；7.陰性對(duì)照；8.空白對(duì)照

1.C.abortu；2.C.abortuMOMP-T；3.Mycoplasma；4.C.suis；5.C.pneumoniae；6.PRRSV；7.Negative control；8.Blank control

圖3實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3 Specificity test results of real-time PCR

1～12.1.0×1012拷貝/μL～1.0×100拷貝/μL；13.陰性對(duì)照；14.空白對(duì)照

1-12. 1.0×1012copies/μL-1.0×100copies/μL，respectively；13.Negative control；14.Blank control

圖4實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

Fig.4 Sensitivity test results of real-time PCR

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將MOMP-T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取濃度范圍在109拷貝/μL～107拷貝/μL這3個(gè)稀釋梯度的質(zhì)粒，每個(gè)梯度的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)n(n≥3)次數(shù)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。其結(jié)果顯示其批內(nèi)與批間的變異系數(shù)為0.022%～0.051%(表2)，說明所建立的檢測(cè)體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

2.7 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用建立的方法對(duì)30份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，檢出流產(chǎn)衣原體6份，陽(yáng)性檢出率20%，將檢出的陽(yáng)性樣品進(jìn)行16 S/23 S rRNA擴(kuò)增及測(cè)序，BLAST結(jié)果顯示6份陽(yáng)性樣品中的病原與豬源流產(chǎn)衣原體同源性為100%。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

最新的分類方法將衣原體目(Chlamydiales)下設(shè)8個(gè)科、11個(gè)屬，其中與人或動(dòng)物衣原體病相關(guān)的衣原體主要?dú)w類到衣原體科(Chlamydiaceae)，該科有一個(gè)衣原體屬(Chlamydia)，包含了12個(gè)衣原體種，C.abortus就是其中一種[7-8]。流產(chǎn)衣原體宿主范圍廣，可造成豬、馬、牛、羊等家畜的流產(chǎn)、肺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病，并可由動(dòng)物傳染給人，導(dǎo)致嚴(yán)重的人獸共患疫病[9]。由于衣原體常與其他病原混合感染，并未引起足夠的關(guān)注，血清學(xué)調(diào)查顯示，不同動(dòng)物衣原體陽(yáng)性率在26.12%～35.41%，是某些地區(qū)山羊等家畜流產(chǎn)的主要原因之一[10-12]。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速的診斷方法是控制該病的關(guān)鍵。

早期人們對(duì)衣原體的研究都是通過簡(jiǎn)單的顯微鏡鏡檢等靈敏度不高的傳統(tǒng)方法，隨著科學(xué)儀器不斷更新，PCR為基礎(chǔ)的各種病原檢測(cè)方法得到了越來越廣泛的應(yīng)用。流產(chǎn)衣原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立，首先是要對(duì)流產(chǎn)衣原體的保守基因編碼序列區(qū)域進(jìn)行比對(duì)分析，然后確定特異性引物和對(duì)應(yīng)特異性探針的最佳保守結(jié)合位點(diǎn)，16 S rRNA因其保守性極佳，是理想的目的基因，但很難區(qū)分豬流產(chǎn)衣原體和其他衣原體，特別是鸚鵡熱衣原體。歐洲不同國(guó)家C.abortus分離株基因組進(jìn)化分析結(jié)果顯示，其基因多樣性要遠(yuǎn)低于其他種屬內(nèi)，并具有很強(qiáng)的地理特征[12]。momp基因保守且屬間特異性強(qiáng)，可用于不同屬衣原體的鑒別診斷[13]。因此，本研究選取momp基因建立了豬流產(chǎn)衣原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，與袁曾壯[14]、馮悅等[15]建立的衣原體TaqMan-MGB探針熒光定量PCR相比，本研究建立的檢測(cè)方法線性相關(guān)系數(shù)R2和擴(kuò)增效率略低于MGB探針，但變異系數(shù)范圍比較小，綜合比對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，本研究建立的分子信標(biāo)方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較高，特異性好，分子標(biāo)記探針成本較MGB探針相對(duì)便宜，具有很好的應(yīng)用前景。