內(nèi)眥區(qū)域組織結(jié)構(gòu)薄層切片三維可視化

閆 帥 黃明玉 祁存芳

(青海大學(xué),1 研究生院, 2 醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室, 西寧 810001)

淚小管裂傷是眼外科常見(jiàn)的損傷,需要進(jìn)行急診手術(shù)恢復(fù)其解剖和功能的完整性,但在術(shù)中淚小管斷端的尋找、支撐物的選用以及傷口縫合等方面存在某些爭(zhēng)議[1-2]。然而,由于淚小管細(xì)小且位于約1cm2的狹小區(qū)域內(nèi),同時(shí)此區(qū)域還有皮膚,膠原纖維和彈性纖維、淚總管、肌纖維、淚囊等結(jié)構(gòu),對(duì)淚道的研究主要集中于淚囊和鼻淚管,而對(duì)淚小管與周圍結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。隨著計(jì)算機(jī)信息技術(shù)的迅猛發(fā)展,三維重建技術(shù)在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中得到極大程度的推廣[3],同時(shí)基于影像手段的三維模型手術(shù)模擬已被廣泛應(yīng)用[4]。但由于淚小管周圍的內(nèi)眥區(qū)域?yàn)檐浗M織,常規(guī)的影像學(xué)方法對(duì)其成像效果并不理想,相對(duì)來(lái)說(shuō),組織連續(xù)切片后進(jìn)行三維重建可最大程度保持和呈現(xiàn)淚小管及其周圍結(jié)構(gòu)的原始位置和空間配布關(guān)系。本研究采用該方法對(duì)淚小管和內(nèi)眥區(qū)域結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維重建。

1 材料和方法

1.1 材料

成年國(guó)人內(nèi)眥標(biāo)本3例,標(biāo)本由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室提供,均為男性,將內(nèi)眥區(qū)域沿額骨和上頜骨眶緣、淚囊窩及眶內(nèi)側(cè)骨面分離,并對(duì)取下的標(biāo)本修剪成約2cm×2cm×1cm的小塊,內(nèi)側(cè)包括淚囊,外側(cè)緣在淚點(diǎn)外0.5cm處,然后將其固定于15%的福爾馬林溶液中。

1.2 內(nèi)眥區(qū)域連續(xù)切片

標(biāo)本經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟,包埋于自制的包埋盒中。將組織皮膚朝上擺放,行組織切片,切片厚15μm,保留相鄰2層切片作為1組,每組間隔45μm。經(jīng)鋪片、烤片,然后進(jìn)行染色,第1層切片用H-E染色；第2層用Masson染色。

1.3 圖像獲取

將染色、封片后的組織切片置于顯微鏡下,對(duì)其中的各種顯微組織成分進(jìn)行觀察,并從標(biāo)本邊緣開(kāi)始用40倍鏡進(jìn)行拍攝,然后平移標(biāo)本進(jìn)行下一視野的拍攝,同一水平拍攝完畢后向下平移,進(jìn)行下一水平段的拍攝,在拍攝中要保證相鄰圖像存在相同的組織結(jié)構(gòu)以便后期圖像的拼接,每個(gè)切片獲得15～20個(gè)不等的圖像。在對(duì)淚小管組織進(jìn)行觀察時(shí),將顯微鏡調(diào)整到100和400倍并進(jìn)行局部觀察和拍攝。所獲得的同一標(biāo)本的40倍鏡圖像在Adobe Photoshop CS6軟件中進(jìn)行圖像拼接,統(tǒng)一大小并進(jìn)行壓縮。

1.4 圖像配準(zhǔn)

將得到的相同染色的切片圖像進(jìn)行配準(zhǔn),以最外側(cè)的圖像為參考圖像,在PS軟件中打開(kāi),然后將與其相鄰的相同染色的內(nèi)側(cè)切片圖像導(dǎo)入到PS軟件中作為浮動(dòng)圖像,設(shè)置浮動(dòng)圖像的不透明度為60%,按Ctrl+T對(duì)浮動(dòng)圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)以及平移,使得浮動(dòng)圖像解剖結(jié)構(gòu)與參考圖像最大程度的重合。然后刪除參考圖像的圖層,將浮動(dòng)圖像的不透明度調(diào)回100%,另存為保存,即完成1個(gè)圖像的配準(zhǔn)。依此方法將切片由外側(cè)向內(nèi)側(cè)進(jìn)行配準(zhǔn)。

1.5 三維重建和可視化

選用切片連續(xù)性強(qiáng)、成像效果較好的1組標(biāo)本切片圖像進(jìn)行三維重建。在3D-Doctor軟件中打開(kāi)切片圖像,運(yùn)用Boundary Editor功能手動(dòng)勾畫輪廓,用不同顏色標(biāo)示淚小管、眼輪匝肌瞼板前部淺頭和Horner肌等區(qū),設(shè)置X、Y、Z參數(shù),用3D-Rendering菜單下的Surface Rendering選項(xiàng)對(duì)這些分區(qū)進(jìn)行表面三維重建和可視化,最后將構(gòu)建好的三維模型導(dǎo)出并保存。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)眥區(qū)域顯微結(jié)構(gòu)觀察

從淚點(diǎn)開(kāi)始淚小管和淚總管內(nèi)襯未角化的復(fù)層鱗狀上皮(圖1A),與瞼緣處結(jié)膜上皮類型相同,淚總管開(kāi)口于淚囊處可見(jiàn)淚總管部分突入淚囊而形成的皺襞,由復(fù)層鱗狀上皮構(gòu)成,其下方出現(xiàn)較明顯的復(fù)層柱狀上皮,兩者間界限明顯。淚囊內(nèi)襯復(fù)層柱狀上皮(圖1B)。

淚點(diǎn)四周的纖維斜行環(huán)繞淚點(diǎn),與前、后方皮下和結(jié)膜下的纖維相連。淚小管、淚總管和淚囊上皮細(xì)胞的下方可見(jiàn)明顯的基底層細(xì)胞,基底層外為彈性纖維和膠原纖維。淚小管和淚總管周圍的纖維大致可分為3層,靠近基底層的纖維排列較致密,環(huán)繞淚小管管壁,與基底層細(xì)胞關(guān)系緊密；中間的纖維斜行環(huán)繞淚小管,排列較疏松；最外層的纖維垂直淚小管,穿行于周圍肌纖維之間,將肌纖維分割成小的肌纖維束,呈網(wǎng)狀和皮膚及瞼結(jié)膜下方的纖維相連(圖1C、D)。

2.2 淚小管及周圍組織的三維結(jié)構(gòu)

從重建的3部分(圖2)可以看到,淚小管整體形態(tài)完整,眼輪匝肌瞼板前部淺頭和深頭(Horner肌)圍繞淚小管排列。淺頭起始于淚囊前方的內(nèi)眥韌帶,平行走行于淚小管的前方；Horner肌起始于淚囊的后方,在淚總管后方與其平行,在淚總管與上、下淚小管交界處,部分Horner肌肌纖維緊貼淚小管壁深入到上、下淚小管之間,逐漸向外,Horner肌分為上、下2部分,伴行淚小管走行。在上、下淚小管水平部的鼻側(cè)端,Horner肌位于其后內(nèi)側(cè),眼輪匝肌瞼板前部淺頭位于其前外側(cè),然后Horner肌逐漸向前外側(cè)斜行,最終深、淺兩頭肌纖維在上淚小管的上方和下淚小管的下方匯合成為眼輪匝肌瞼板前部肌纖維,經(jīng)淚小管壺腹前方行向外側(cè)。在淚小管水平部外側(cè)段,淚小管后方與瞼結(jié)膜之間的肌纖維明顯少于其前方與瞼部皮膚之間的肌纖維,甚至在淚小管水平部外側(cè)段后方無(wú)肌纖維,取而代之的是增厚的淚小管周圍的纖維組織。

在淚囊和淚總管的前方可見(jiàn)明顯的內(nèi)眥韌帶,為內(nèi)眥韌帶前部,其上、下有眼輪匝肌瞼板前部淺頭和眼輪匝肌眶隔前部淺頭肌纖維附著。內(nèi)眥韌帶前部后方的纖維包繞淚總管和淚囊,與淚囊筋膜相連。在淚囊和淚總管上方的內(nèi)眥韌帶有眼輪匝肌眶隔前部深頭肌纖維附著,為內(nèi)眥韌帶的上部。在淚囊后方的內(nèi)眥韌帶有部分Horner肌纖維附著,是內(nèi)眥韌帶的后部。內(nèi)眥韌帶的3個(gè)分部中前部最長(zhǎng)且易于觀察,上部和后部短,都與淚囊筋膜關(guān)系緊密。

圖1 淚小管及周圍結(jié)構(gòu)。A： 淚點(diǎn),Masson染色,×400；B： 淚總管和淚囊,H-E染色,×400；C： 淚小管垂直部,Masson染色,×100；D： 淚小管垂直部,Masson染色,×400。→： 角化復(fù)層鱗狀上皮；： 未角化復(fù)層鱗狀上皮；： 復(fù)層柱狀上皮.

圖2 淚小管及周圍結(jié)構(gòu)三維模型。A： 淚小管正面觀；B： 淚小管和Horner肌正面觀；C： 淚小管和Horner肌背面觀；D淚小管和眼輪匝肌瞼板前部淺頭正面觀。淺藍(lán)色： 淚小管；黃色： Horner??；橘色： 眼輪匝肌瞼板前部淺頭.

Fig 1 Lacrimal canaliculus and surrounding structures. A： Lacrimal punctum, Masson staining, ×400; B： Common canaliculu and lacrimal sac,H-E staining, ×400; C： Vertical part of lacrimal canaliculus, Masson staining, ×100; D： Vertical part of lacrimal canaliculus, Masson staining, ×400. →： Keratinized complex squamous epithelium;： Nonkeratinized stratified squamous epithelium;： Stratified columnar epithelium.

Fig 2 Three dimensional model of lacrimal canaliculi and its surrounding structure. A： The front view of lacrimal canaliculi; B： The front view of lacrimal canaliculi and Horner’s muscle; C： The back view of lacrimal canaliculi and Horner’s muscle; D： The front view of lacrimal canaliculi and shallow head of the anterior part of the eyelid of orbicularis oculi muscle. Light blue： Lacrimal canaliculi; Yellow： Horner’s muscle; Orange： Shallow head of the anterior part of the eyelid of orbicularis oculi muscle.

3 討論

3.1 淚道上皮的形態(tài)特點(diǎn)

淚道源于鼻上頜溝的外胚葉下陷形成的實(shí)心上皮細(xì)胞柱,上端出芽形成淚小管；隨后細(xì)胞分解,分別形成淚小管、淚囊,淚點(diǎn)在胚胎6～7月出現(xiàn)[5-8]。但組織學(xué)觀察可見(jiàn),淚小管上皮與結(jié)膜的上皮形態(tài)一致,在淚囊腔內(nèi)可見(jiàn)淚總管突入其中形成皺襞,淚總管上皮與淚囊上皮之間涇渭分明。有文獻(xiàn)報(bào)道,瞼裂狹小綜合癥為常染色體顯性遺傳疾病,其典型異常表現(xiàn)為斜視、弱視、瞼外翻、視神經(jīng)異常、淚道狹窄等[9],而目前有關(guān)瞼裂狹小結(jié)合癥的淚道發(fā)育異常的類型包括淚點(diǎn)移位、淚小管狹窄、副淚點(diǎn)、淚點(diǎn)缺如等[10]。根據(jù)淚小管上皮與結(jié)膜的上皮形態(tài)一致和眼瞼發(fā)育異常可導(dǎo)致淚小管狹窄的特點(diǎn),是否可推斷在淚小管形成過(guò)程中,淚囊部外胚層細(xì)胞團(tuán)形成的上、下兩個(gè)索狀分支構(gòu)成了淚小管的基部,在淚小管管腔形成的過(guò)程中,來(lái)自眼瞼皺褶的內(nèi)表皮上皮伸展進(jìn)入淚小管而構(gòu)成了淚小管的上皮細(xì)胞,并伸入淚囊而形成淚總管皺襞。

3.2 淚小管及毗鄰結(jié)構(gòu)的關(guān)系

文獻(xiàn)報(bào)道,淚小管上皮下富有彈力纖維,四周環(huán)型圍繞眼輪匝肌纖維[8]。筆者在對(duì)組織切片和三維模型的分析后發(fā)現(xiàn)淚小管周圍包繞著三層纖維,使淚小管管壁與肌纖維、皮膚和結(jié)膜連成一個(gè)整體。

在淚小管顳側(cè)4/5部分周圍有Horner肌,也被稱為眼輪匝肌淚部,在鼻側(cè)1/5部分,Horner肌走行于淚總管后方[11]。目前對(duì)于Horner肌的歸屬有兩種觀點(diǎn),一種是將Horner肌稱為眼輪匝肌淚部,與瞼部和眶部并列；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為眼輪匝肌分為眶部、眶隔前部和瞼板前部[12],瞼板前部有深、淺兩個(gè)頭,深頭為Horner肌。筆者觀察靠近鼻側(cè)Horner肌可見(jiàn),其與前方的眼輪匝肌瞼板前部淺頭之間存在較明顯的界限,而逐漸向外側(cè),可見(jiàn)兩部分肌纖維之間的界限越來(lái)越模糊,直到Horner肌和眼輪匝肌瞼板前部淺頭在壺腹外側(cè)匯合。

Horner肌與眼輪匝肌瞼板前部淺頭的位置關(guān)系和走形特點(diǎn)決定了當(dāng)這兩部分肌纖維收縮,擠壓淚小管,并通過(guò)纖維組織牽拉淚囊,改變管腔大小和形狀,從而影響淚液的引流[13]。

3.3 切片法三維重建內(nèi)眥區(qū)域

目前,通過(guò)影像學(xué)方法進(jìn)行三維重建已十分成熟,相比之下,組織切片進(jìn)行三維重建發(fā)展則較為遲緩。由于切片過(guò)程易造成切片變形、移位、甚至碎裂,以及對(duì)于肌纖維纖細(xì)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且沒(méi)有包膜肌纖維重建而言,組織學(xué)切片技術(shù)不是最好選擇[14]。淚小管上皮下方有明顯的基底細(xì)胞層,相對(duì)于周圍的肌纖維,可以分辨出其大體輪廓,因此本研究重建后的淚小管形態(tài)良好,與實(shí)體解剖的淚小管標(biāo)本一致,但是重建后的肌纖維無(wú)法清晰顯示其纖維走行,效果并不理想。而且在實(shí)際操作中,切片厚度、染色批次、拍照自然條件、曝光等必然會(huì)影響切片質(zhì)量,如果這些因素處理不當(dāng),對(duì)后期圖像的配準(zhǔn)、輪廓?jiǎng)澐忠约澳Ｐ徒⒍紩?huì)造成很大的困難,因此找到一種穩(wěn)定、可靠適用于精細(xì)組織的切片三維重建的方法是十分必要的。