氣味訓(xùn)練對(duì)血管性癡呆大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化及DACH1蛋白表達(dá)的影響?

邢雪松 呂威力

(沈陽醫(yī)學(xué)院, 1 解剖學(xué)教研室, 2 病理學(xué)教研室, 沈陽 110034)

缺血性腦損傷是嚴(yán)重危害人類健康的疾病,存在高致殘率[1-3]。較多研究已經(jīng)證實(shí)腦缺血能促進(jìn)成年動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs) 的增殖、遷移和分化,分化的新生神經(jīng)元能部分替代受損的神經(jīng)元,從而在一定程度上改善神經(jīng)功能缺損[4-5]。DACH信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)途徑,在促進(jìn)細(xì)胞增殖分化等過程中起著十分關(guān)鍵的作用[6]。本研究利用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立大鼠血管性癡呆(vascular dementia, VD)模型,研究檢測Nestin和細(xì)胞命運(yùn)決定因子(cellfate determination factor dachshund 1, DACH1)在血管性癡呆海馬組織中的表達(dá)及氣味訓(xùn)練和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的干預(yù)作用,探討血管性癡呆內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞與之相關(guān)因子的改變及氣味訓(xùn)練的干預(yù),對(duì)其增殖分化機(jī)制進(jìn)行初步的闡明。

1 材料和方法

1.1 血管性癡呆模型的制備

健康雄性Wistar大鼠78只,2月齡,體質(zhì)量220～240g,由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組： 假手術(shù)組(Sham組,n=6),模型組(Model組,3、7、14、21d,n=24),訓(xùn)練組(Training組,3、7、14、21d,n=24),bFGF組(bFGF組,3、7、14、21d,n=24)。采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立血管性癡呆動(dòng)物模型。術(shù)前12h禁食、4h禁水。1%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)消毒,行頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid arteries, CCA),玻璃針小心分離雙側(cè)迷走神經(jīng),避免牽拉,模型組在夾閉雙側(cè)CCA之前,腹腔注射硝普鈉(2.5mg/kg),隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA 10min 后,再通10min,再夾閉10min,再通后縫合傷口,放回籠中保溫飼養(yǎng),慶大霉素局部預(yù)防感染。實(shí)驗(yàn)過程中用多導(dǎo)生物記錄儀記錄大鼠血壓,記錄顯示硝普鈉腹腔注射前大鼠平均動(dòng)脈壓維持在103mmHg左右,注射后平均動(dòng)脈血壓迅速下降至至51mmHg左右,持續(xù)約2min后緩慢上升至69mmHg,1h內(nèi)持續(xù)維持于該水平。在造模過程中保持動(dòng)物直腸溫度在37℃ 左右,以防止低溫對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用。假手術(shù)組不阻斷CCA及注射硝普鈉,其他與模型組相同。訓(xùn)練組于造模1d后開始給予氣味訓(xùn)練,bFGF組腹腔注射bFGF,此后分別于3、7、14、21d后處死取材,常規(guī)H-E染色。

1.2 氣味穿梭訓(xùn)練

實(shí)驗(yàn)以氣味乙酸異戊酯為條件刺激,電擊為非條件刺激。先將大鼠放入穿梭箱內(nèi)暗適應(yīng)5min,然后持續(xù)乙酸異戊酯刺激,如大鼠不逃到另一端,則給于電擊,電流強(qiáng)度10～20mA,使動(dòng)物逃至箱底不通電一側(cè),此時(shí)電擊停止,否則持續(xù)受電擊5s。消除氣味后開始下一輪訓(xùn)練。于造模1d后行氣味穿梭訓(xùn)練,每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行20次氣味、電刺激。

1.3 給藥方法

bFGF為北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司研制,用注射用水稀釋, bFGF組腹腔注射10μg/kg,其余組腹腔注射等量生理鹽水,缺血后即刻給藥。

1.4 行為學(xué)評(píng)分

各組大鼠麻醉清醒后進(jìn)行模型篩選,造模成功大鼠分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,評(píng)分參照Zea Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)： 0分： 沒有神經(jīng)功能缺損；1分： 前爪不能完全伸展；2分： 行走時(shí),大鼠向兩側(cè)晃動(dòng)；3分： 行走時(shí),大鼠身體向兩側(cè)傾倒；4分： 不能自發(fā)行走,有意識(shí)喪失。評(píng)分為0分和4分者均被剔除,隨機(jī)補(bǔ)充,保證每亞組6只不變。

1.5 腦梗死體積測定

各組大鼠于再灌注后3d迅速斷頭取腦,置-70℃冰箱速凍10min,取其前腦從額極到枕極切成2mm厚的冠狀面腦片,將切片立即置于2%TTC磷酸緩沖液中避光、37℃恒溫孵育30min,取出置于4%多聚甲醛中固定2h。正常腦組織被染成鮮紅色,而梗死區(qū)呈蒼白色。將固定的腦片按切片順序排列。數(shù)碼相機(jī)拍照后,應(yīng)用Metamorph-Evolution MP 5.0顯微圖像分析系統(tǒng)測量前腦總面積和腦梗死面積,根據(jù)公式V=t(A1+A2+A3+—+An)-t(A1+An)算出前腦總體積和梗死體積。其中t為切片厚度,A為梗死面積。

1.6 Nestin免疫熒光染色

各組大鼠常規(guī)灌注取腦,連續(xù)冰凍冠狀切片,片厚約30μm,隔5取1,進(jìn)行免疫熒光檢測。切片首先0.01mol/L PBST,2N HCL/PBS,37℃孵育30min。0.1mol/L硼酸緩沖液浸泡,0.01mol/L PBST。加入血清A,37℃孵育15min,傾去,勿洗。滴加稀釋的羊抗nestin一抗(濃度為1∶2000),4℃過夜。0.01mol/L PBST洗滌。滴加TRITC-兔抗山羊二抗(1∶100),避光條件下,37℃孵育30min。避光條件下,0.01mol/L PBST洗滌。避光條件下,貼片避光、陰干、稀釋甘油封片后熒光顯微鏡觀察并拍片。每只大鼠切片中選取呈典型反應(yīng)的3張切片,每張切片于海馬齒狀回區(qū)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù),采用Image-Pro Plus 5.0圖像處理軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析處理,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中nestin陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.7 DACH1 的免疫組織化學(xué)檢測

取各組缺血海馬(AP前囟-3.14～前囟-4.5mm),片厚約3mm,浸入4%多聚甲醛固定液中,24h后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測缺血海馬DACH1的表達(dá)情況。切片滴加正常山羊血清(37℃,30min),分別滴加一抗兔抗鼠DACH1 4℃過夜,滴加二抗(37℃,60min),滴加ABC復(fù)合液(37℃,60min),以上各步間均PBS沖洗(5min×3次),DAB顯色(15min),蒸餾水沖洗,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。空白對(duì)照片一抗用0.01mol/L PBS代替。光鏡下觀察切片, 用Metamorph/Evolution MP 5.0顯微圖像分析系統(tǒng)每張切片測5個(gè)相同單位面積的平均灰度值。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積比較

假手術(shù)組未見梗死灶,和模型組相比,訓(xùn)練組和bFGF組梗死體積明顯減小(表1)。

2.2 H-E染色評(píng)估組織學(xué)改變

假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量多,排列整齊,形態(tài)完整；模型組細(xì)胞腫脹,分布不均,細(xì)胞周圍間隙增寬,有的細(xì)胞體積縮小,核固縮深染,其中3d組織變化最為明顯；訓(xùn)練組和bFGF組海馬存活神經(jīng)元數(shù)比模型組增多,神經(jīng)元胞體腫脹明顯減輕,細(xì)胞形態(tài)明顯改善。

表1 各組大鼠腦梗死體積比較(mm3)

*P<0.05vsmodel group

2.3 Nestin免疫熒光染色檢測

陰性對(duì)照海馬未見nestin陽性細(xì)胞。假手術(shù)組海馬僅見少量散在的nestin陽性細(xì)胞,3、7、14、21d間相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組3d時(shí),缺血海馬nestin陽性細(xì)胞開始增多,大小不一,呈簇狀分布;7d達(dá)峰值;21d海馬nestin免疫陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少; 訓(xùn)練組和bFGF組與模型組比較,3、7、14d和21d缺血海馬nestin陽性細(xì)胞均明顯增多(P<0.05) (表2，圖1)。假手術(shù)組大鼠海馬齒狀回顆粒層可以觀察到少量nestin陽性細(xì)胞。

表2 大鼠腦缺血后海馬組織nestin陽性細(xì)胞數(shù)

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group

2.4 氣味訓(xùn)練對(duì)DACH1影響的免疫組織化學(xué)檢測

腦組織切片中顯示細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)有明顯黃色、棕褐色顆粒為DACH1蛋白陽性。在假手術(shù)組海馬DACH1有輕微表達(dá)。DACH1反應(yīng)產(chǎn)物腦缺血再灌注第7天較假手術(shù)組有所增多,隨缺血再灌注時(shí)間的進(jìn)一步延長逐漸增加,第14天后持續(xù)高水平表達(dá),直到21d(P<0.05)。訓(xùn)練組和bFGF組,在海馬神經(jīng)元質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒,DACH1陽性產(chǎn)物表達(dá)較3、7、14d和21d 模型組表達(dá)增加(P<0.05) (表3,圖1)。

表3 大鼠腦缺血后海馬神經(jīng)元DACH1表達(dá)的平均灰度值

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group

3 討論

血管性癡呆是由一系列腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害所引起的癡呆綜合癥,以記憶力減退、表情淡漠、呆滯和人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。已證實(shí)在成年海馬齒狀回顆粒下區(qū)存在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞。在一定條件下NSCs能夠增殖,并向特定方向分化,參與神經(jīng)功能修復(fù)的過程[7-8]。

VD患者大腦的病理性變化,如神經(jīng)元丟失,先可以在嗅皮層中觀察到,并逐漸延伸至海馬和其周圍結(jié)構(gòu),已知海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)是VD患者大腦結(jié)構(gòu)中最明顯的易受損區(qū)。海馬是機(jī)體感覺和運(yùn)動(dòng)的整合區(qū),與認(rèn)知功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的可塑性有關(guān),是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)海馬也是嗅覺系統(tǒng)的投射區(qū),可見嗅覺投射區(qū)域與學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)中樞存在部分重疊,故VD和嗅覺之間有在密切聯(lián)系[9-10]。

DACH1蛋白的DS結(jié)構(gòu)域,是DACH1發(fā)揮生物學(xué)功能的主要部位。DS結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合能力,可以通過與c-Jun、Smads、Six和ER等轉(zhuǎn)錄因子相互作用,在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮重要功能[11-12]。TGF-β超家族主要由一些在細(xì)胞生長、分化、凋亡、遷移或血管生成等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的多功能細(xì)胞因子組成。Dach1與CBP(cyclic AMP-responsive element-binding protein)的結(jié)合可能會(huì)競爭性抑制其他需要結(jié)合CBP發(fā)揮作用的分子的功能,例如β-catenin、R-smad(smad2/smad3)等,有研究證明β-catenin可以在CBP的介導(dǎo)下與smad3相結(jié)合,作用于TGF-β的效應(yīng)基因的作用,抑制TGF-β對(duì)Wnt信號(hào)通路活性的增強(qiáng)作用[13-15]。因此推測Dach1可以抑制TGF-β和Wnt兩條信號(hào)通路對(duì)NSCs的促增殖的調(diào)控作用。

本研究通過腦梗死體積比較顯示, 假手術(shù)組未見梗死灶，和模型組相比,訓(xùn)練組和bFGF組梗死體積明顯減小。說明訓(xùn)練組和bFGF組對(duì)血管性癡呆大鼠腦損傷具有修復(fù)作用。本研究通過Nestin免疫熒光染色檢測顯示,模型組和bFGF組大鼠腦缺血后7d時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞增殖達(dá)高峰,21d時(shí)干細(xì)胞數(shù)量下降,分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)觀察氣味訓(xùn)練和bFGF組對(duì)缺血再灌注后大鼠海馬DACH1表達(dá)的影響,結(jié)果顯示訓(xùn)練組和bFGF組DACH1陽性產(chǎn)物表達(dá)較模型組海馬明顯增加,21d達(dá)高峰,從一個(gè)側(cè)面探討氣味訓(xùn)練和bFGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的作用機(jī)制。

圖1 血管性癡呆大鼠海馬nestin、DACH1陽性細(xì)胞及H-E染色,×200Fig 1 Nestin and DACH1 positive cells of vascular dementia rats, ×200A: Nestin positive cells of model 7d group; B: Nestin positive cells of training 7d group; C: Nestin positive cells of model 21d group; D: Nestin positive cells of training 21d group. E: DACH1 positive cells of model 7d group; F: DACH1 positive cells of training 7d group; G: DACH1 positive cells of model 21d group; H: DACH1 positive cells of training 21d group; I: H-E staining of model 3d group; J: H-E staining of training 3d group