生前溺死與死后入水SD大鼠心臟與脾內(nèi)硅藻檢驗(yàn)的研究

劉泉 ，陳軼群 ，柯技 ，王樹法

1.湖北警官學(xué)院偵查系，湖北武漢 430034；2.湖北三真司法鑒定中心，湖北武漢 430034；3.湖北崇新司法鑒定中心，湖北武漢 430403；4.湖北警官學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，湖北武漢 430034

判斷水中的尸體是否為生前溺死還是死后拋尸是法醫(yī)學(xué)非常重要的工作內(nèi)容之一。一般情況下，如果尸體較為新鮮，可以根據(jù)溺死的特征性尸體征象，如口鼻部的蕈樣泡沫、上呼吸道內(nèi)有溺液和異物、水性肺水腫等來進(jìn)行判斷。但在實(shí)際檢案中，水中尸體被發(fā)現(xiàn)時常常已高度腐敗，尸體征象變得不明顯，這時僅依據(jù)尸體征象進(jìn)行溺死的判斷，準(zhǔn)確性大大降低。在這種情況下，法醫(yī)學(xué)工作者會選取一些實(shí)驗(yàn)室的方法輔助診斷溺死。在我國，硅藻檢驗(yàn)被認(rèn)為是溺死診斷的重要輔助手段[1]。一般在肺、肝、腎等器官同時發(fā)現(xiàn)硅藻，且硅藻種類與實(shí)地水樣一致，即可診斷為溺死[2]。

盡管硅藻檢驗(yàn)被很多人認(rèn)為是溺死診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但也有人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，非溺死者的內(nèi)臟中也有硅藻，從而對硅藻診斷溺死提出異議[3]。但大量實(shí)驗(yàn)表明，非溺死者與溺死者肺內(nèi)硅藻數(shù)量存在顯著差異[2，4]，從而提示可以通過硅藻的量化分析對生前溺死進(jìn)行判斷，從而降低誤判的風(fēng)險?，F(xiàn)有的與硅藻量化有關(guān)的研究主要集中在肺組織，但除了肺組織以外，其它內(nèi)臟器官內(nèi)的硅藻是否也有類似的差異，卻未見報道。

該課題組選用2016年9月購置于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心的100只SD大鼠為研究對象，利用微波消解-真空抽濾-光鏡觀察法對生前溺死與死后入水的SD大鼠的心臟與脾內(nèi)硅藻進(jìn)行定性定量分析研究，以探討體循環(huán)內(nèi)臟器官硅藻量化在法醫(yī)學(xué)溺死診斷中的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Topex微波消解系統(tǒng)、高分子聚合材料消解罐、G-100電子恒溫加熱器、，HL-6多聯(lián)真空抽濾設(shè)備，烤片機(jī)，聚醚砜濾膜抽濾杯，數(shù)字虛擬切片工作站。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 分析純硝酸、30%雙氧水溶液、乙酸，丁香油酚，雙蒸水（自制）。

1.1.3 硅藻源與實(shí)驗(yàn)動物 小環(huán)藻屬硅藻（中科院水生生物研究所）；100只雄性實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)SD大鼠，體重250～350 g（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?水樣模型的制備：用電子天平分別精確稱取硅藻土，各放入雙蒸水中，將硅藻水的濃度調(diào)至0.01,0.02,0.04 g/L和0.08 g/L。動物模型的制備：100只SD大鼠，每10只大鼠為一組，被隨機(jī)分成10組：4個生前溺死組、4個死后拋尸組、1個空白生前溺死組、1個空白死后拋尸組。生前溺死組：將SD大鼠稱重記錄，然后放入金屬捕鼠籠里，靜置2 min，然后連同籠子一起，分別浸入前面制備的水樣中1 min，然后提出水面，靜置30 s后再沉入水面。按此循環(huán)5次，使SD大鼠充分溺死，死后的SD大鼠在水樣中持續(xù)浸至30 min后取出。

死后拋尸組：將SD大鼠稱重記錄，使用動脈空氣栓塞法處死。然后采取與生前溺死組相同的方法處理大鼠。

空白生前溺死組與空白死后拋尸組使用無硅藻的雙蒸水作為水樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟同生前溺死組。

1.2.2 檢材提取與硅藻檢驗(yàn) 用雙蒸水反復(fù)沖洗大鼠體表，然后切開皮膚，更換干凈無硅藻污染的工具，切開肌肉和內(nèi)臟包膜，再次更換干凈無硅藻污染的工具，取出心臟，放置干凈的器皿中，稱重并記錄。采用同樣的方法取出脾臟，稱重并記錄。采用微波消解-真空抽濾方法對取出的整個臟器和水樣進(jìn)行消化、制切。整個解剖過程嚴(yán)格操作步驟，防止污染。

1.2.3 統(tǒng)計方法 利用數(shù)字虛擬切片工作站記錄各個切片中的硅藻數(shù)量，只有完整的硅藻才會被記錄下來。將每個組織樣本中觀察到的硅藻總數(shù)量除以相應(yīng)組織的質(zhì)量，得到每個組織中的硅藻數(shù)量質(zhì)量比。采用Microsoft Excel及SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)，計量資料使用t檢驗(yàn)和Spearman回歸分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠器官重量及水樣中硅藻數(shù)量結(jié)果

100只SD大鼠心臟重量在0.93～1.62 g之間，所有SD大鼠脾臟重量在0.57～1.1 g之間。水樣模型中硅藻數(shù)量分別是(1 766.67±1 027.73)個(0.01 g/L)，(3 166.67±1 118.49)個(0.02 g/L)，(5 633.33±1 994.49)個(0.04 g/L)和(9 500.00±2 291.00)個(0.08 g/L)。

2.2 硅藻數(shù)量質(zhì)量比結(jié)果

在死后拋尸組、空白生前溺死組和空白死后拋尸組的大鼠心臟和脾臟中均未觀察到硅藻，其心臟和脾臟的硅藻的數(shù)量質(zhì)量比均為0個/g。生前溺死組與死后拋尸組各濃度硅藻數(shù)量質(zhì)量比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；生前溺死組中，各組織的硅藻數(shù)量質(zhì)量比見表1。表1中顯示，心臟和脾臟的硅藻的數(shù)量質(zhì)量比基本會隨著水樣的濃度升高而增加，通過Spearman回歸分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；在 0.01，0.02，0.04 g/L濃度水樣下的心臟和脾臟內(nèi)的硅藻數(shù)量質(zhì)量比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在0.08 g/L濃度水樣下的心臟和脾臟內(nèi)的硅藻數(shù)量質(zhì)量比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 生前溺死組心臟與脾臟在不同濃度水樣中硅藻的數(shù)量質(zhì)量比[（±s），個/g]

表1 生前溺死組心臟與脾臟在不同濃度水樣中硅藻的數(shù)量質(zhì)量比[（±s），個/g]

注：各濃度的數(shù)量質(zhì)量比值是用均數(shù)的形式表示。他們與水樣濃度之間的關(guān)系通過Spearman回歸分析P＜0.01，說明數(shù)量質(zhì)量比值隨著水樣濃度變化而變化。

臟器心臟脾臟t值P值數(shù)量質(zhì)量比值0.01 g/L 0.02 g/L 0.04 g/L 0.08 g/L 0.49±0.34 0.86±0.75 1.43 0.19 1.08±0.75 0.80±0.81-2.08 0.07 1.22±0.79 1.52±1.21 0.99 0.35 1.52±1.08 2.80±1.69 2.77 0.02

2.3 硅藻檢出率結(jié)果

生前溺死組所有臟器的硅藻檢出率大于50%。生前溺死組心臟和脾臟的硅藻檢出率均隨著水樣硅藻濃度的增加而檢出率增大，且兩臟器的硅藻檢出率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 生前溺死組心臟與脾臟在不同濃度水樣中硅藻檢出率（%）

3 討論

硅藻是一種單細(xì)胞藻類，其主要特點(diǎn)是其有富含硅質(zhì)的細(xì)胞壁，可以抵御強(qiáng)酸強(qiáng)堿[5]。硅藻種類超過萬種，廣泛存在于自然界中，幾乎在每種水域中都能發(fā)現(xiàn)硅藻的蹤影。由于硅藻的這些特點(diǎn)，使得硅藻檢驗(yàn)成為溺死診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[6-8]。但硅藻檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過程易被污染，且身前嗆水也可能會吸入少量硅藻[9]，因此也有人對硅藻檢驗(yàn)判斷溺死提出了異議。但更多學(xué)者認(rèn)為只要嚴(yán)格規(guī)范檢驗(yàn)步驟，是可以有效控制污染的。該實(shí)驗(yàn)設(shè)置了空白生前溺死組與空白死后拋尸組，兩組結(jié)果硅藻均為0。這表明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)沒有交叉污染，硅藻檢驗(yàn)結(jié)果可靠。

在溺水過程中，硅藻會隨著呼吸運(yùn)動到達(dá)肺組織，然后部分硅藻穿過氣血屏障，進(jìn)入到血液循環(huán)，分布到全身各個器官。因此，肺是溺死過程中，硅藻首先到達(dá)的器官，所以目前，有關(guān)硅藻檢驗(yàn)的定量研究主要集中在肺組織。如李向陽等人[2]對62只新西蘭大白兔的各肺葉中的硅藻進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)生前溺死組與死后拋尸組各肺葉中均能檢出小環(huán)藻硅藻，檢出率均為100%，但生前溺死組中小環(huán)藻數(shù)量明顯多于死后拋尸組。朱德全等人[4]以32只五指山豬為研究對象，對肺組織及左、右心室血內(nèi)的硅藻進(jìn)行定性和定量分析，也發(fā)現(xiàn)死后拋尸組的肺內(nèi)能觀察到硅藻，且硅藻含量顯著小于溺死組肺內(nèi)硅藻含量(P＜0.05)；溺死組左右心室血中硅藻數(shù)量分別為 （33±54.72）個/mL和（9±13.33）個/mL，而死后入水組心室血內(nèi)均未檢出硅藻。該實(shí)驗(yàn)，在已知死因的前提下，研究了溺死組與死后拋尸組SD大鼠心、脾的硅藻數(shù)量質(zhì)量比，發(fā)現(xiàn)生前溺死組與死后拋尸組檢出硅藻數(shù)量質(zhì)量比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這與之前的有關(guān)肺組織硅藻檢驗(yàn)結(jié)果是類似的，即生前溺死組體內(nèi)硅藻數(shù)明顯多于死后拋尸組，這表明心、脾作為內(nèi)臟器官可與肺組織一樣，用于硅藻檢驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示死后拋尸組心、脾檢出硅藻數(shù)為0，與朱德全等人研究的山豬的心室血中的檢驗(yàn)結(jié)果一致，這與以往有關(guān)死后拋尸組肺組織也能檢出硅藻不同，這表明心、脾用于硅藻檢驗(yàn)的特異性比肺組織更強(qiáng)。

不僅如此，該課題組還比較了同一硅藻水樣濃度下的大鼠心臟與脾臟，發(fā)現(xiàn)無論在哪個濃度，兩臟器硅藻檢出率均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；心臟和脾臟內(nèi)的硅藻數(shù)量質(zhì)量比在低于0.04 g/L的同一濃度水樣下的SD大鼠的是差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），只有0.08 g/L的濃度水樣下，兩臟器的硅藻數(shù)量質(zhì)量比才差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02），這個結(jié)果暗示，低濃度下心臟和脾臟在硅藻檢驗(yàn)的效力上是差不多的，而只有當(dāng)水樣中硅藻濃度升高到一定程度，這兩個臟器之間才在硅藻數(shù)量質(zhì)量比上產(chǎn)生差異。而類似的不同硅藻水樣濃度下的研究，尚未見報道。

在硅藻檢驗(yàn)中，除了檢驗(yàn)內(nèi)臟中的硅藻，還要檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尸體所在水域中的硅藻。如果水域中的硅藻種類和器官中硅藻一樣，這將是一個強(qiáng)有力的證據(jù)證明死者生前溺水[10-12]。但有時，發(fā)現(xiàn)尸體的時候可能已經(jīng)過了很長時間，或是尸體已經(jīng)漂流了很長一段距離。這時尸體周圍水域中硅藻的種類和數(shù)量已經(jīng)與溺死發(fā)生時周圍水域中的有很大不同。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示進(jìn)入SD大鼠的心臟和脾臟的硅藻數(shù)量會隨水樣的濃度升高而增加（Spearman回歸分析 P＜0.01），這個結(jié)果暗示可能根據(jù)器官內(nèi)硅藻數(shù)量來計算水中硅藻的濃度范圍，這提供了一種在溺水時確定溺死地點(diǎn)硅藻數(shù)量的可能途徑。如果硅藻檢驗(yàn)?zāi)芸紤]到環(huán)境等因素，這會使得硅藻檢驗(yàn)診斷溺死更加可信。

在實(shí)際檢案中，內(nèi)臟的取材量對硅藻的檢出率也是有影響的，因此在常用的破機(jī)罐法的硅藻檢驗(yàn)中，對內(nèi)臟的提取量有一個推薦范圍[13]。該實(shí)驗(yàn)選用的是SD大鼠，體型較小，取材內(nèi)臟重量在1 g上下，無法嚴(yán)格比照推薦取材量進(jìn)行檢材。因此，將內(nèi)臟的取材量考慮在內(nèi)，將SD大鼠內(nèi)臟中硅藻的數(shù)量與質(zhì)量作為一個比值再進(jìn)行分析，能更客觀的反映硅藻在心臟、脾臟這兩個臟器中的變化情況。

硅藻檢驗(yàn)中，除了取材量，還有很多其它因素也會影響最終硅藻的檢出數(shù)量，如水中硅藻數(shù)量、消化程度、離心次數(shù)、玻片制備等[14]。這些實(shí)驗(yàn)步驟均可能造成硅藻的丟失，從而降低檢出率。該實(shí)驗(yàn)選用的是微波消解聯(lián)合真空抽濾的方法進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)，該方法消化組織完全、無離心損耗，極大的提高了硅藻的檢出率[15]。但在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，溺死組心臟或脾臟的硅藻檢出率均小于100%，說明溺死組中兩臟器仍存在硅藻數(shù)為0的假陰性結(jié)果。這可能一方面表明心臟和脾臟對于硅藻檢驗(yàn)而言，并不是很敏感的器官。另一方面，SD大鼠組織器官較小，可能也是造成假陰性結(jié)果的原因之一。如果使用更大型動物做該實(shí)驗(yàn)，可以取得的內(nèi)臟組織器官質(zhì)量就更大，假陰性結(jié)果可能就會減少或消除。除此以外，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心臟或脾臟的硅藻檢出率基本隨著水樣濃度的增加而增加，這說明只要水樣中硅藻數(shù)量足夠，其假陰性結(jié)果也可能會減少或消除。

綜上所述，空白生前溺死組與空白死后拋尸組結(jié)果均為0，說明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)沒有交叉污染，硅藻檢驗(yàn)結(jié)果可靠，也同時說明硅藻檢驗(yàn)過程中污染是可控的；溺死組與死后拋尸組心臟和脾臟硅藻數(shù)量質(zhì)量比有顯著性差異，死后拋尸組所有臟器硅藻檢出數(shù)為0，溺死組所有臟器硅藻的檢出率低于100%，說明心臟和脾臟可用于硅藻檢驗(yàn)，且具有高特異性和低靈敏度的特點(diǎn)；心臟與脾臟的硅藻的數(shù)量質(zhì)量比基本隨著水中硅藻濃度的增加而增加，說明臟器內(nèi)硅藻數(shù)量與水中硅藻數(shù)量有相關(guān)性。但目前的研究僅限于單種硅藻 （小環(huán)藻），其它類型的硅藻是否也具有類似的特點(diǎn)，還需要進(jìn)一步的研究。