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    剪切力對成纖維細胞中p38和CREB活性影響和作用機制

    2018-10-11 05:21:06賴俊媚葉祥明林敬陽周盼盼張利張劼李厥寶
    心電與循環(huán) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:剪切力貨號印跡

    賴俊媚 葉祥明 林敬陽 周盼盼 張利 張劼 李厥寶

    剪切力(shear stress)是指血流作用于血管壁單位面積的力。剪切力在動脈粥樣硬化、炎癥等疾病中扮演重要的角色[1]。研究發(fā)現(xiàn)各種內(nèi)外因素常使外膜成纖維細胞暴露于剪切力作用下[2],而激活的成纖維細胞是動脈粥樣硬化早期事件之一[3-4]。剪切力作用下的成纖維細胞觸發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),而p38信號持續(xù)激活參與動脈粥樣硬化發(fā)病[5-7]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)提高小鼠動脈硬化模型中血管炎癥[8],并介導(dǎo)血管平滑肌細胞增殖和分化[9-10]。剪切力可以同時激活ROS和鈣離子[11]。本實驗將成纖維細胞置于不同速度、作用時間的剪切力下,并使用不同信號通路抑制劑處理細胞,觀察剪切力作用下p38和CREB活性變化以及ROS和鈣離子的介導(dǎo)機制,旨在了解剪切力作用下成纖維細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,為動脈硬化的發(fā)病機制和治療提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料 成纖維細胞(IMR-90)購于上海細胞庫,細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM。實驗前細胞先饑餓處理(即不含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液)12h。鈣離子螯合劑氨基苯乙烷四乙酸(BAPTA)購于德國Millipore公司(產(chǎn)品貨號196419-25MG),溶于水制備成10mg/L的母液;過氧化氫酶(Catalase)購于美國Sigma公司(產(chǎn)品貨號C1345),溶于磷酸鹽緩沖液(PBS) 制備成 100U/ml。Antiphosopho-p38(產(chǎn)品貨號 4511),Anti-p38(產(chǎn)品貨號8690),Anti-phosopho-CREB(產(chǎn)品貨號 9196),Anti-CREB(產(chǎn)品貨號 9197),Anti-β-actin(產(chǎn)品貨號3700)5種抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司。

    圖1 剪切力作用對成纖維細胞中p38、CREB信號通路活性的影響[細胞分別使用不同的剪切力(2.5和5dyn/cm2)處理0和30min后使用免疫印跡檢測p-p38,p-CREB,p38,CREB,β-actin的表達水平。A:具有代表性的免疫印跡條帶;B、C:各組之間相對增加量。與相同剪切力0min相比,*P<0.05]

    1.2 剪切力裝置以及分組 成纖維細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi),使用STREX細胞機械牽拉儀器置于細胞皿中間,避免觸到培養(yǎng)皿底部,對成纖維細胞進行不同持續(xù)時間和強度的剪切力作用,然后收集細胞。實驗一分別用2.5dyn/cm2和5dyn/cm2剪切力處理細胞0和30min。實驗二將分別使用不同作用時間(0、10、30min)和強度(0、2.5、5、7dyn/cm2)的剪切力作用于成纖維細胞。實驗三分成兩組,一組分別為空白對照、使用Catalase和BAPTA(5和30μmol/L)后加載剪切力,另一組為空白對照,使用Catalase和BAPTA(5和30μmol/L)處理細胞后不加載剪切力。

    1.3 蛋白提取 吸走孔板中的細胞培養(yǎng)液,用PBS漂洗細胞后加上細胞裂解液(60mmol/L,Tris-HCl,pH6.8,5%甘油,2%SDS),離心后煮沸 5min,用 BCA試劑盒(購于碧云天生物技術(shù)研究所,產(chǎn)品貨號P0009)測定蛋白濃度。

    1.4 免疫印跡分析 測定濃度的蛋白用SDSPAGE分離膠分離和轉(zhuǎn)印,與一抗在4℃孵育過夜,在室溫下再與二抗結(jié)合1h,漂洗后與發(fā)光底物(購于Cell Signaling Technology公司)結(jié)合,放入曝光盒膠片曝光,最后顯影、定影。免疫印跡結(jié)果經(jīng)過3次重復(fù)。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Predictive Analytics Software 18.0(PASW,version 18.0)統(tǒng)計軟件,測得計量資料采用表示,多組間比較采用單因素方差分析(Dunnett’s test),兩兩比較采用 t檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 剪切力作用對成纖維細胞中p38、CREB信號

    通路活性的影響 見圖1。

    由圖1可見,免疫印跡顯示,在剪切力作用30min后,與2.5dyn/cm2相比,5dyn/cm2剪切力作用下p38、CREB的磷酸化水平明顯升高(均P<0.05)。

    2.2 不同作用時間和強度的剪切力對成纖維細胞中p38和CREB的活性的影響 見圖2。

    由圖2可見,免疫印跡分別檢測結(jié)果顯示,在5dyn/cm2剪切力處理10min時,p38和CREB磷酸化水平開始升高,30min時p38磷酸化水平和CREB活性繼續(xù)逐步升高(均P<0.05)。在不同強度剪切力作用下處理30min后,免疫印跡檢測結(jié)果顯示,p38和CREB的磷酸化水平在5dyn/cm2和7dyn/cm2均出現(xiàn)明顯升高(均P<0.05)。

    圖2 不同作用時間和強度的剪切力對成纖維細胞中p38和CREB的活性的影響[A-C:剪切力處理細胞0、10和30min后,采用免疫印跡的方法檢測 p-p38、p38、p-CREB、CREB、β-actin 的表達水平;D-F:采用 0,2.5,5,7dyn/cm24 種強度剪切力處理細胞后免疫印跡檢測p-p38、p38、p-CREB、CREB、β-actin 的表達水平。與剪切力 0min相比,*P<0.05]

    2.3 清除ROS和Ca2+對剪切力誘導(dǎo)的p38、CREB活性的影響 見圖3。

    由圖3可見,在剪切力作用下,過氧化氫酶處理后p38和CREB的磷酸化水平較未處理組均降低(均P<0.05);但用BAPTA處理后,p38和CREB的磷酸化水平較未處理組均升高(均P<0.05)。在不加載剪切力組,分別以5、30μmol/L BAPTA處理細胞后,p38和CREB的磷酸化水平較未處理組明顯升高,且呈劑量依賴性(均P<0.05);過氧化氫酶處理細胞后p38和CREB的磷酸化水平較未處理組無明顯下降。

    3 討論

    在動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的進程中,剪切力是最主要的危險因素[12]。暴露在剪切力下內(nèi)皮細胞,通過細胞感受器感受血流剪切力變化,這種機械力通過激活某些信號通路調(diào)節(jié)不同基因和蛋白質(zhì)表達,影響血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的結(jié)構(gòu)和功能;同時血管損傷等情況下可以使平滑肌細胞和成纖維細胞直接暴露在剪切力作用下,參與血管重塑和疾病的發(fā)生[2]。剪切力作用下可激活MAPK、Ca2+、NOS、Akt等信號通路[1]。在圖 1 中剪切力激活成纖維細胞中p38和CREB,這和已發(fā)表的一些研究相一致[13-16]。在人牙周膜細胞[13]及在血管內(nèi)皮細胞中[14],剪切力可激活p38;在人成纖維細胞中剪切力可使CREB的磷酸化水平升高[15]。剪切力這種正向調(diào)控p38和CREB活性呈時間和強度依賴性。圖2中顯示隨著剪切力作用強度增加和作用時間延長,CREB的活性越高;而p38在刺激作用 5、7dyn/cm2時激活強度一致。這說明CREB和p38對于剪切力的感知能力不同,剪切力作用30min,5dyn/cm2時p38已被完全激活,而CREB需要更強的刺激才可完全激活。目前已有許多研究表明,激活的p38能夠介導(dǎo)動脈粥樣硬化過程中細胞氧化應(yīng)激、增殖、分化、遷移以及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[16-18];激活的CREB能夠介導(dǎo)血管外膜成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)換[19],在動脈粥樣硬化模型小鼠中CREB介導(dǎo)了白血素-17a的生產(chǎn)和炎癥[20]。

    圖3 在成纖維細胞中抑制ROS和Ca2+后對p38和CREB的活性影響 [A-C:使用250U/L過氧化氫酶和30μmol/L BAPTA預(yù)處理細胞30min后免疫印跡的方法檢測p-p38、p-CREB、p38、CREB、β-actin的表達水平。D-F:在沒有剪切力作用下,使用5和30μmol/L BAPTA處理細胞 30min 后檢測 p-p38、p-CREB、p38、CREB、β-actin 的表達水平。B-C:組間比較,*P<0.05;E-F:與對照組比較,*P<0.05]

    ROS被認為是參與包括高血壓和動脈粥樣硬化等疾病的病理生理過程[21-22];圖3中用抗氧化劑Catalase清除ROS后,剪切力在成纖維細胞中能夠正向調(diào)控p38和CREB活性的作用被抑制。說明剪切力對p38和CREB的激活部分依賴于ROS介導(dǎo)。血管平滑肌細胞中諸如亞油酸、oxLDL及其代謝產(chǎn)物等產(chǎn)生活性氧可激活p38和ERK[22],在內(nèi)皮細胞中剪切力可通過增加ROS產(chǎn)生來激活p38[23],與本研究結(jié)果相一致。在無剪切力作用下Catalase清除ROS后,p38和CREB活性可見輕微下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異,可能和樣本量少有關(guān)。有意思的是,不同于其他研究[24-26],我們發(fā)現(xiàn)用鈣離子螯合劑BAPTA清除鈣離子,反而使剪切力作用下的p38和CREB活性升高。同時我們發(fā)現(xiàn),在無剪切力作用下,BAPTA同樣激活了p38和CREB,并且呈現(xiàn)劑量依賴性。這說明即使在無剪切力作用下,鈣離子仍如同剎車一般控制著p38和CREB的活性。有研究表明,在動脈粥樣硬化過程中,成纖維細胞可具有分化表型,成為病變血管中異常增生的平滑肌細胞的來源。為了進一步探討激活p38和CREB的下一步生物學(xué)效應(yīng),我們檢測了成纖維細胞的分化標(biāo)志蛋白質(zhì)α-actin,calponin和SM22α,僅見收縮蛋白SM22α輕度升高(實驗數(shù)據(jù)未發(fā)表),這可能和剪切力作用強度小也有一定關(guān)系。所以在本研究中剪切力是否通過p38和CREB途徑影響成纖維細胞增殖、分化以及遷移等生物學(xué)效應(yīng)需要進一步研究。

    綜上所述,本實驗初步證實了剪切力通過誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS激活p38、CREB,隨著剪切力作用時間延長和強度增加,p38及CREB的磷酸化水平逐漸升高。由于p38和CREB升高和動脈粥樣硬化過程相關(guān),推測剪切力可以通過p38和CREB途徑引起動脈粥樣硬化。另外,我們首次發(fā)現(xiàn)抑制鈣離子可以使p38和CREB活性增強,從側(cè)面推測生理水平的鈣離子可能對血管存在保護作用。本研究對于后續(xù)研究剪切力在成纖維細胞中的作用以及了解成纖維細胞參與動脈粥樣硬化疾病發(fā)生中扮演的重要角色具有一定實際意義,更為下一步研發(fā)藥物提供了理論依據(jù)。

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