砷中毒地區(qū)女性妊娠結局及生殖系統(tǒng)疾病生物學標志物的研究

馮琳，張瑗，孟玉春，楊靜逸，孫瀏，余雄武

（1.云南省曲靖市婦幼保健院 婦一科，云南 曲靖 655000；2.云南省曲靖市婦幼保健院產(chǎn)二科，云南 曲靖 655000；3.云南舜喜再生醫(yī)學工程有限公司研究中心，云南 昆明650000；4.云南省曲靖市婦幼保健院 普外科，云南 曲靖 655000）

單質砷和砷的化合物已被國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer, IARC）明確認定為人類確定致癌物[1]。國外流行病學研究人員通過流行病學研究發(fā)現(xiàn)，慢性飲水型砷暴露與全身各系統(tǒng)非惡性疾病及惡性腫瘤的發(fā)生密切相關[2-3]。據(jù)國內外文獻報道提示長期低劑量接觸砷可以引發(fā)多種疾病，如人體皮膚色素沉著、色素分布異常，皮膚角化過度或角化不全，外周神經(jīng)病變、腦血管及周圍血管病變，生殖功能障礙和全身各器官的腫瘤等[4-5]。本文通過測定砷暴露地區(qū)女性的生殖系統(tǒng)生物標志物的水平，初步探討砷暴露對女性生殖系統(tǒng)的損傷。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

收集2014年曲靖某砷中毒地區(qū)成年女性（18歲及以上）6424例相關資料，平均年齡（28±3）歲。納入標準為在砷暴露地區(qū)居住超過15年的女性，排除標準為接觸砷及其砷化物的相關職業(yè)人員。所有研究對象都符合納入標準并且簽署知情同意書。按照我國國家標準規(guī)定飲水砷衛(wèi)生標準和我國曲靖地區(qū)地下水含砷的水平以及參考文獻[6]后，將研究對象按飲水砷濃度不同，分成低砷暴露組（0.01 mg/L≤飲水砷濃度＜0.1 mg/L）（1922例），高砷暴露組（飲水砷濃度≥0.1 mg/L）（1502例），非砷暴露地區(qū)的成年女性（18歲及以上）作為對照組，飲水砷濃度＜0.01 mg/L（3000例）。

1.2 主要試劑和儀器設備

雌二醇（Estradiol, E2）、孕激素（Progesterone,P4）、黃體生成素（Luteinizinghormone, LH）（南京建成生物工程研究所），ER單克隆抗體、PR單克隆抗體，（福建邁新生物技術有限公司），濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Hyclone公司），中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司），無水乙醇（天津開通化學試劑有限公司），二甲苯（天津市開通化學試劑有限公司），蘇木素（北京索萊寶科技有限公司），甲醇（天津市開通化學試劑有限公司），雙氧水H2O2（天津市開通化學試劑有限公司）。ASA-2SP砷形態(tài)分析儀（日本島津公司），原子吸收分光光度計（德國耶拿公司），SRAF-16C型電磁爐（日本Shimadzu公司），顯微鏡（德國Hund公司）。

1.3 標本的采集及檢測

1.3.1 尿樣、血樣的采集與檢測 留取研究對象尿液20 ml左右貯存于潔凈試管中，冷藏運回實驗室，置于-20℃冰箱冷凍待測。取研究對象的中段尿4 ml于潔凈的10 ml玻璃試管中，向尿樣試管中加入2 mol/L的氫氧化鈉8 ml，混勻、高溫（100℃）加熱3 h，震蕩1次/h?，F(xiàn)場采取研究對象血液5 ml置于采血管中，冷藏運回實驗室，置于-20℃冰箱冷凍待測。嚴格按照E2、P4、LH試劑盒說明說操作，檢測相應的激素水平。原子吸收分光光度計（193.7 nm）測定待測血液和尿液中的砷含量。

1.3.2 子宮和卵巢樣本的采集 通過穿刺方式采集活檢標本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進行免疫組織化學染色。

1.4 研究方法

1.4.1 砷含量及血中雌激素水平檢測 用氫原子吸收分光光度法測定尿液中和外周血中砷的含量。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血中砷含量及雌激素水平。

1.4.2 免疫組織化學法檢測 子宮和卵巢中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）含量采用免疫組織化學法檢測：①切片：將石蠟包埋組織作4μm厚連續(xù)切片；②烤片：切片置于60℃溫箱內過夜；③脫蠟：常規(guī)3級二甲苯脫蠟5min，5級梯度酒精至水1min，蒸餾水沖洗3min，沖洗3次；④阻斷：3% H2O2甲醇溶液，室溫孵育15min，PBS沖洗3min/次，沖洗3次；⑤抗原修復（高溫高壓加熱法）：將修復液置于不銹鋼高壓鍋中煮開，將水化好的組織片浸沒在修復液中，煮沸1～2min后，冷卻；⑥封閉：切片加1滴正常非免疫動物血清，室溫下孵育10min；⑦加一抗和二抗：切片加1滴一抗（ER、PR單克隆抗體）置于濕盒中4℃電冰箱中過夜，PBS沖洗3min，沖洗3次；加1滴生物素標記的二抗體，置于濕盒中4℃孵育30min，PBS沖洗3min，沖洗3次；加一滴鏈霉素抗生物素一過氧化物酶溶液，置于濕盒中4℃孵育30min，PBS沖洗3min，沖洗3次；⑧顯色：切片1滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察顯色情況，適時終止反應；⑨復染、分化、返藍：切片蘇木素復染4min，清水沖洗，鹽酸酒精分化10s，清水沖洗返藍，直至核呈藍色，酒精脫水，二甲苯透明，干燥，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結果。陽性判定標準：ER、PR免疫組織化學染色以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為其陽性判定標準。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，計數(shù)資料采用例（%）表示，采用χ2檢驗，多個率兩兩比較采用χ2分割法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組妊娠異常及生殖系統(tǒng)腫瘤情況比較

高砷暴露組女性妊娠期出現(xiàn)妊娠高血壓和妊娠期不良妊娠結局的概率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.698和9.394，P=0.002和0.007）；高砷暴露組女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.324，P=0.001）。見表 1。

表1 各組妊娠異常及生殖系統(tǒng)腫瘤情況的比較 例（%）

2.2 各組血砷和尿砷含量比較

各組女性的血砷和尿砷含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；組間兩兩比較顯示高砷暴露組和低砷暴露組的血砷和尿砷含量高于對照組（t=9.471、12.575、8.484和10.537，P=0.007、0.003、0.011和 0.005）；高砷暴露組的血砷和尿砷含量高于低砷暴露組（t=7.463和11.486，P=0.012和0.004），且隨著砷暴露濃度增高，女性的血砷和尿砷呈增高的趨勢，存在劑量-效應關系。見表2。

表2 各組血砷和尿砷含量比較 （μg/L，±s）

表2 各組血砷和尿砷含量比較 （μg/L，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與低砷暴露組比較，P ＜0.05

組別 血砷 尿砷對照組（n =3 000） 6.93±0.89 35.09±4.21低砷暴露組（n =1 922） 15.31±1.381） 43.77±5.371）高砷暴露組（n =1 502） 19.22±1.521）2） 56.76±3.781）2）F值 17.571 6.473 P值 0.001 0.026

2.3 砷暴露對女性雌激素E2、P4、LH的影響

各組女性的E2、P4、LH水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高砷暴露組和低砷暴露組女性體內的E2、P4、LH水平低于對照組（t=17.558、8.458、8.478、12.558、9.455 和 11.948，P=0.000、0.011、0.011、0.003、0.009和0.003）；高砷暴露組女性體內的E2、P4、LH水平低于低砷暴露組（t=17.561、7.982和9.482，P=0.001、0.012和0.007），且隨著砷暴露濃度增高，女性體內的E2、P4、LH呈降低的趨勢。見表3。

表3 砷暴露對女性雌激素E2、P4、LH的影響（pg/ml，±s）

表3 砷暴露對女性雌激素E2、P4、LH的影響（pg/ml，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與低砷暴露組比較，P ＜0.05

組別 E2 P4 LH對照組（n =3 000） 55.12±2.82 36.23±1.65 64.39±3.96低砷暴露組（n =1922） 42.04±1.851） 30.32±1.331） 32.24±2.131）高砷暴露組（n =1 502） 10.56±1.301）2） 22.45±1.311）2） 21.57±2.631）2）F值 18.218 17.656 8.473 P值 0.001 0.001 0.011

2.4 雌激素受體蛋白ER、PR在各組女性子宮和卵巢中的表達

各組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高砷暴露組和低砷暴露組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR水平高于對照組，（t=18.478、12.558、25.455、11.948、53.089、10.488、48.937 和 9.948，P=0.001、0.003、0.000、0.002、0.000、0.005、0.000和0.006）；高砷暴露組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR水平高于低砷暴露組（t=12.982、11.685、39.089和36.687，P=0.003、0.003、0.000和0.000）；在低砷暴露組和高砷暴露組女性的子宮和卵巢中出現(xiàn)ER、PR高表達的情況。見表4和圖1～4。

表4 各組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR的表達比較 （±s）

表4 各組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR的表達比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與低砷暴露組比較，P ＜0.05

卵巢ER PR ER PR對照組（n =3 000） 5.35±0.83 6.43±0.69 5.89±0.98 4.59±0.85低砷暴露組（n =1 922） 20.23±1.761） 25.29±2.351） 18.32±2.251） 15.28±1.591）高砷暴露組（n =1 502） 50.51±6.281）2） 62.35±8.351）2） 85.09±7.651）2） 80.21±5.631）2）F值 6.469 7.421 17.519 17.569 P值 0.026 0.021 0.001 0.001子宮組別

圖1 女性子宮ER表達 （×200）

圖2 女性子宮PR表達 （×200）

圖3 女性卵巢ER表達 （×200）

圖4 女性卵巢PR表達 （×200）

3 討論

大量研究表明[7-8]，砷作為內分泌干擾物可對女性的生殖系統(tǒng)有嚴重的毒性，長期砷暴露可改變女性排卵周期，使生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率明顯增加；長期砷暴露還會對女性妊娠造成影響，引發(fā)妊娠高血壓及妊娠高血壓并發(fā)心臟病的發(fā)生率明顯增加，易引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死產(chǎn)等不良妊娠結局；長期砷暴露還有一定的生殖毒性，嚴重者還會增加胎兒畸形的發(fā)生率。動物實驗也表明[9-10]，砷暴露可使雌性動物的卵巢和子宮重量降低，雌激素、孕激素分泌紊亂。本研究結果提示，砷暴露均可使女性體內的血砷和尿砷有不同程度的增加，且有明顯的劑量-效應關系。在同一水砷濃度暴露水平下，高暴露組中女性二甲基砷酸（DMA）、總砷（TAs）含量以及一甲基化率（SMR）水平高于男性；低暴露組和對照組無機砷（As）、DMA、TAs含量、SMR水平在不同性別間差異無統(tǒng)計學意義[11]，這與本研究的結果具有一致性。

砷及其砷化物是一類環(huán)境雌激素物質[12]，能夠干擾或模擬內源性雌激素作用，競爭性的與下丘腦、卵巢、子宮等臟器上的相應雌激素受體結合，干擾體內雌激素的正常作用與水平，破壞內分泌環(huán)境的平衡，從而影響生殖系統(tǒng)的健康生長與正常發(fā)育，最終可導致一系列腫瘤的發(fā)生[13]，對雌激素的干擾途徑也各不相同[14]。破壞內分泌微環(huán)境的平衡，誘導或抑制人體自然雌激素分泌的水平。本研究顯示，砷暴露地區(qū)女性的體內雌激素水平處于低水平，并且砷暴露地區(qū)生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率較高。

砷作為一種潛在的環(huán)境內分泌干擾物（EDCs），低劑量即可與類固醇激素受體（SHRs）優(yōu)先結合，干擾活化的類固醇激素（孕激素、雌激素）的生物學作用，并且能夠作為轉錄因子與DNA結合，從而調控基因的表達水平[15]。砷可對ER、PR存在共同的作用途徑，砷可使這些受體產(chǎn)生復雜的劑量依賴效應，如低劑量砷暴露（0.1～1.0 μmol/L）可增強激素依賴性基因的轉錄與表達；而高劑量砷暴露（1.0～5.0 μmol/L）卻可以抑制激素依賴性基因的轉錄與表達，提示砷可通過調控基因轉錄與表達而發(fā)揮作用[15-17]。劉曉霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ER與雌激素結合后活化，參與基因轉錄，要么直接誘導靶基因轉錄，要么通過其他方式誘導靶基因轉錄，從而通過對靶基因的調控而發(fā)揮其生物學效應。砷可通過干擾激素與激素受體的結合而擾亂激素的分泌及發(fā)揮其生物學作用。本研究結果提示，砷可以使激素受體蛋白ER、PR的表達紊亂，影響女性的生殖健康。體外實驗及動物實驗提示[19-20]砷具有雌激素樣的作用。動物實驗提示大鼠及小鼠動情周期紊亂，雌性小鼠子宮和卵巢的ER和PR mRNA表達水平降低。細胞實驗提示0.5 μmol/L As2O3對Hela細胞的ERa及PR mRNA表達水平的影響與1mmol/L的雌二醇對Hela細胞的ERa及PR mRNA表達水平的影響相似，且它們的作用均可被雌二醇拮抗劑所拮抗。

血砷、尿砷可以作為砷暴露地區(qū)女性生殖系統(tǒng)損害的暴露標志物，E2、P4、LH、ER、PR可作為效應標志物。在今后的研究中，應該加強對砷中毒病區(qū)的流行病調查，同時還可以開展大量動物實驗及體外實驗，并且運用分子生物技術監(jiān)測分析砷中毒發(fā)病及相關生物標志物，從遺傳流行病學及分子流行病學方面分析砷中毒的生物標志物，為揭示砷中毒發(fā)病的分子機制，為防治砷中毒提供可靠的理論依據(jù)。