結(jié)直腸腺癌EGFR、CDX2表達(dá)的臨床病理意義及相互關(guān)系*

錢紅，王輝，牛國(guó)梁，趙娟霞，曹桂明

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 1.病理科，2.胃腸外科，3.腫瘤科，湖南 衡陽(yáng) 421002）

結(jié)直腸腺癌（colorectal adenocarcinoma, CRC）是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在我國(guó)已呈逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)生、發(fā)展可能是在遺傳、環(huán)境等多種因素作用下發(fā)生的一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，具體機(jī)制尚不清楚。研究證明，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2（caudal type homeobox genes 2,CDX2）在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及預(yù)后方面發(fā)揮重要作用，但在結(jié)直腸腺癌中EGFR和CDX2對(duì)患者臨床病理表現(xiàn)的影響和意義以及它們相互之間的關(guān)系研究結(jié)論不一。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜中EGFR和CDX2的表達(dá)，并結(jié)合臨床、病理資料進(jìn)行分析探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2016年10月南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院病理科結(jié)直腸腺癌手術(shù)標(biāo)本170例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放射或化學(xué)治療。選取30例無(wú)癌患者正常腸黏膜作對(duì)照，男女比為19∶11，中位年齡51歲，平均年齡59歲。

1.2 方法

所有腫瘤標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定12～48 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片，HE和免疫組織化學(xué)染色，由兩名病理診斷醫(yī)生雙盲作出病理診斷、組織學(xué)分類及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷，意見(jiàn)不一致的再共同討論決定。病理診斷及組織學(xué)分類按照WHO（2010版）標(biāo)準(zhǔn)。免疫組織化學(xué)用SP法染色，試劑盒及抗體購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；EGFR（RMA-0689）、CDX2（EPR2764Y）均為即用型兔抗人單克隆抗體。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

顯微鏡下觀察，EGFR陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，CDX2陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核；染色為淡黃色、棕黃色或深棕色為陽(yáng)性；按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)分：①陽(yáng)性染色判定標(biāo)準(zhǔn)：未染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，深棕色3分；②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)：按每400高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分比：＞1%0分，1%～24% 1分，25%～50% 2分；＞50% 3分；③以上兩項(xiàng)評(píng)分乘積為最后得分：＜中位分值為低表達(dá)，≥中位分值為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用例表示，采用χ2檢驗(yàn)和χ2分割法（檢驗(yàn)水準(zhǔn)經(jīng)矯正后α=0.008）；EGFR和CDX2的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析及χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸腺癌的臨床病理特征

170例結(jié)直腸腺癌患者年齡28～85歲，中位年齡62歲，平均60歲；＜60歲的73例（42.9%），≥60歲的97例（57.1%）；男性112例（65.9%），女性58例（34.1%），男女比1.9∶1；腫塊最大徑0.8～15 cm，中位4 cm，平均4.3 cm，其中最大徑＜4 cm的96例（56.5%），≥4 cm的74例（43.5%）；浸潤(rùn)至黏膜肌層9例（5.3%），浸潤(rùn)肌層33例（19.4%），侵及全層或外膜脂肪組織128（75.3%）例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例（32.4%），神經(jīng)侵犯30例（17.6%），脈管內(nèi)癌栓或血管壁侵犯29例（17.1%），系膜或網(wǎng)膜出現(xiàn)癌結(jié)節(jié)26例（15.3%）；高、中、低分化腺癌分別為44、100、26例，分別占總例數(shù)的25.9%、58.8%、15.3%。

2.2 EGFR在結(jié)直腸腺癌和正常腸黏膜組織中的表達(dá)

結(jié)直腸腺癌中EGFR細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的淡黃色至深褐色著色（見(jiàn)圖1）。170例結(jié)直腸腺癌EGFR免疫組織化學(xué)染色最后綜合得分中位數(shù)為4分，因此選定＜4分者為低表達(dá)，≥4分者為高表達(dá)；EGFR高、低表達(dá)分別為61例（35.88%）及109例（64.12%），其中高、中、低分化腺癌的EGFR高表達(dá)率分別為31.82%、35.00%、46.15%，并且隨著腺癌分化程度的降低而逐漸增加。正常腸黏膜中EGFR主要為細(xì)胞膜著色；30例對(duì)照組中EGFR高表達(dá)3例，高表達(dá)率為10.00%。不同分化程度結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.481，P=0.024），然后進(jìn)行χ2分割法比較，結(jié)果顯示，中分化與低分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.008），而高分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達(dá)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.008）。但不同分化程度的結(jié)直腸腺癌EGFR高表達(dá)率兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

2.3 CDX2在結(jié)直腸腺癌和正常腸黏膜上皮中的表達(dá)

圖1 結(jié)直腸腺癌EGFR表達(dá) （SP×400）

表1 不同分化程度的結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜EGFR表達(dá)

圖2 結(jié)直腸腺癌CDX2表達(dá) （SP×200）

CDX2在結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜上皮中均為細(xì)胞核著色，呈不同程度的淺棕黃色至棕褐色顆粒樣，近核周的胞質(zhì)中也有少量顆粒樣著色（見(jiàn)圖2）。CDX2高、低表達(dá)分別為143例（84.12%）及27例（15.88%），其中高、中、低分化腺癌的CDX2高表達(dá)率分別為90.92%、87.00%和61.54%。30例正常腸黏膜中CDX2均呈高表達(dá)，表達(dá)率為100%。不同分化程度的結(jié)直腸腺癌組織與正常腸黏膜CDX2高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.063，P=0.002），然后進(jìn)行χ2分割法比較，結(jié)果顯示，低分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.008），而高分化與中分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.008）。但不同分化程度的結(jié)直腸腺癌CDX2高表達(dá)率兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同分化程度的結(jié)直腸腺癌組織及正常腸黏膜CDX2表達(dá)情況

2.4 EGFR和CDX2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理表現(xiàn)的關(guān)系

170例結(jié)直腸腺癌中，EGFR表達(dá)與年齡、性別、分化程度、腫塊直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、系膜或網(wǎng)膜癌結(jié)節(jié)形成、浸潤(rùn)深度、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓形成均無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但CDX2表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)癌栓形成有關(guān)（P＜0.05），其中，低分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達(dá)率（61.54%）低于高分化及中分化結(jié)直腸腺癌的高表達(dá)率（90.92%及87.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CDX2高表達(dá)率（86.96%）高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（78.18%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；無(wú)脈管內(nèi)癌栓形成者CDX2高表達(dá)率（86.52%）高于脈管內(nèi)癌栓形成病例（72.41%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但CDX2蛋白表達(dá)與年齡、性別、腫塊直徑、系膜或網(wǎng)膜癌結(jié)節(jié)的形成、浸潤(rùn)深度、神經(jīng)侵犯等無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表 3。

2.5 EGFR與CDX2表達(dá)的相關(guān)性

EGFR高表達(dá)的61例中，CDX2高表達(dá)8例，低表達(dá)53例，高表達(dá)率為13.11%；EGFR低表達(dá)的109例中，CDX2高表達(dá)90例，低表達(dá)19例，高表達(dá)率為82.57%。EGFR和CDX2蛋白表達(dá)的Spearman相關(guān)分析（r=0.057，P=0.463）及χ2檢測(cè)（χ2=0.545，P=0.518）結(jié)果均提示兩者無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表4。

表3 結(jié)直腸腺癌EGFR和 CDX2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

表4 結(jié)直腸腺癌CDX2與EGFR表達(dá)的相互關(guān)系 例（%）

3 討論

EGFR是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體，通過(guò)介導(dǎo)多種途徑的信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、黏附、增殖、分化、凋亡和存活，并與腫瘤的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成、細(xì)胞凋亡的抑制和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。結(jié)直腸腺癌中EGFR表達(dá)上調(diào)，與預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快、復(fù)發(fā)早、生存期短及化療耐藥等相關(guān)[1-3]。免疫組織化學(xué)檢測(cè)是目前臨床評(píng)價(jià)EGFR表達(dá)的常用方法之一[4]，但報(bào)道的EGFR表達(dá)率差異較大。為了更準(zhǔn)確地反應(yīng)結(jié)直腸腺癌中EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的范圍和程度，本組采用復(fù)合性評(píng)分系統(tǒng)[5]，以陽(yáng)性結(jié)果評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分的乘積作為最后得分。本研究顯示，隨著分化程度的降低，EGFR高表達(dá)率逐漸增加，尤其是中分化與低分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明EGFR高表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生及分化程度關(guān)系密切，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3，6-7]。但EGFR表達(dá)與年齡、性別、分化程度、腫塊直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、系膜或網(wǎng)膜結(jié)節(jié)的形成、浸潤(rùn)深度、神經(jīng)侵犯、脈管內(nèi)癌栓形成均無(wú)關(guān)，而且高分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達(dá)率比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EGFR蛋白表達(dá)不適合單獨(dú)作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸腺癌的預(yù)后指標(biāo)，與部分研究報(bào)道不一致[7-8]，這可能與EGFR表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)不同，或與本組結(jié)直腸腺癌大多屬臨床中晚期有關(guān)。此外，有學(xué)者提出引起結(jié)直腸腺癌細(xì)胞增殖和遷移的EGFR的轉(zhuǎn)錄機(jī)制存在多種信號(hào)通路[9-10]，這也提示不能通過(guò)單一分子的表達(dá)來(lái)評(píng)判腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

CDX2是一種特異性的腸道核轉(zhuǎn)錄因子，亦是腸道腫瘤發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮作用的一個(gè)關(guān)鍵因子[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道[12-16]，CDX2是一種抑癌基因，特異性表達(dá)于腸上皮性腫瘤中，在引導(dǎo)和維持腸上皮形態(tài)和功能方面具有重要作用，能夠調(diào)節(jié)大量腸道特異性基因的表達(dá)，與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，CDX2對(duì)診斷結(jié)直腸腺癌具有敏感性，是結(jié)直腸腺癌診斷和鑒別診斷的良好指標(biāo)。本組高、中、低分化結(jié)直腸腺癌中，CDX2高表達(dá)率均低于正常腸黏膜CDX2表達(dá)，表明結(jié)直腸腺癌中的CDX2蛋白表達(dá)受到抑制；尤其是低分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達(dá)率低于高、中分化結(jié)直腸腺癌，而且低分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達(dá)率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明CDX2的表達(dá)隨結(jié)直腸腺癌細(xì)胞分化程度降低而下調(diào)，分化越差，下調(diào)越明顯，這種現(xiàn)象也提示CDX2具有引導(dǎo)和維持腸上皮形態(tài)和功能的作用，支持CDX2是一種抑癌基因的觀點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，29例脈管內(nèi)癌栓形成的結(jié)直腸腺癌患者，其CDX2高表達(dá)率低于無(wú)脈管內(nèi)癌栓形成患者，而55例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CDX2高表達(dá)率也低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者；說(shuō)明CDX2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系；這也反過(guò)來(lái)證明了CDX2高表達(dá)具有抑制結(jié)直腸腺癌進(jìn)展的作用，CDX2蛋白下調(diào)可提高結(jié)直腸腺癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步證實(shí)CDX2是一種抑癌基因。有學(xué)者[16-18]認(rèn)為CDX2過(guò)表達(dá)時(shí)能逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制胃癌、腸癌細(xì)胞遷移、侵襲，因此推測(cè)結(jié)直腸腺癌CDX2表達(dá)缺失可能通過(guò)促進(jìn)癌組織發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致侵襲能力的增強(qiáng)及血管和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但該假設(shè)還需要進(jìn)一步深入研究。

此外，EGFR蛋白高表達(dá)的結(jié)直腸腺癌中，CDX2蛋白多呈低表達(dá)，比例高達(dá)86.89%，而EGFR蛋白低表達(dá)的結(jié)直腸腺癌患者，其CDX2蛋白82.57%呈高表達(dá)，似乎提示EGFR與CDX2蛋白表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，不過(guò)Spearman相關(guān)分析及χ2檢驗(yàn)均未證實(shí)該推測(cè)。分析原因，可能與EGFR及CDX2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的途徑存在不同通路有關(guān)，但這還有待于大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和深入研究?？傊?，探討多個(gè)結(jié)直腸腺癌相關(guān)基因的表達(dá)及其相互關(guān)系，才能更全面的了解其發(fā)生發(fā)展和預(yù)后，以期為臨床診療和篩選高危人群提供重要的參考意義。