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    PKC、Rho激酶在卡托普利舒張大鼠離體胸主動脈環(huán)中的作用

    2018-10-11 08:24:28張玉潔胡晶晶李榮巧楊彩紅張軒萍
    中國藥理學(xué)通報 2018年10期
    關(guān)鍵詞:卡托普利激動劑激酶

    張玉潔,胡晶晶,李榮巧,楊彩紅,張軒萍

    (山西醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、2. 藥學(xué)院,山西 太原 030001)

    近年來研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶C(protrin kinase C, PKC)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(Rho-associated kinase, ROCK)在心血管系統(tǒng)的多種細(xì)胞中特異性表達(dá)。PKC、Rho激酶信號通路的激活與糖尿病腎病、腫瘤、心臟病、高血壓,甚至神經(jīng)損傷性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),但由于PKC、Rho激酶在體內(nèi)分布廣泛,涉及生理功能較復(fù)雜,以該靶點(diǎn)做為藥物的潛在不良反應(yīng)較多,很難在臨床上廣泛應(yīng)用??ㄍ衅绽鰹檠芫o張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACE),目前是治療原發(fā)性和腎性高血壓的首選藥物,它能抑制循環(huán)中血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ, AngⅠ)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ),使AngⅡ?qū)ρ艿氖湛s作用減弱[1-2]。有資料顯示,AngⅡ作為Rho激酶的激動劑可激動Rho激酶,引起血管收縮,而PKC在原發(fā)性高血壓中活性增高,可導(dǎo)致腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)過度激活[3-4],那么卡托普利舒張血管的作用是否有PKC、Rho激酶的參與呢?這是本實驗研究的主要目的。雖然有實驗對卡托普利舒張心臟和腎動脈作用進(jìn)行了基礎(chǔ)研究[5],但未就PKC、Rho激酶進(jìn)行研究。本實驗擬使用大鼠胸主動脈,運(yùn)用離體器官恒溫灌流裝置,觀察卡托普利對大鼠離體胸主動脈環(huán)舒張效應(yīng),研究PKC、Rho激酶是否參與卡托普利的舒血管作用,進(jìn)一步探討其舒張血管作用的其他可能機(jī)制,為卡托普利新的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1實驗動物SD♂大鼠,體質(zhì)量(225±25)g,山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(晉)2009-0001。

    1.2試劑乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、HEPES購自上海生物工程有限公司;左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitroarginiemethylester, L-NAME)、吲哚美辛(indometacin, Indo)、苯腎上腺素(phenylephrine, PE)、佛波醇酯(phorbol ester, PMA)、十字孢堿(staurosporine, SP)、花生四烯酸(arachidic acid four arachidic acid, AA)、法舒地爾(fasudil)、卡托普利,均購自美國Sigma公司;其余試劑均為分析純,購自武漢博士德公司。生理鹽溶液(physiological salt solution, PSS)液配制成分:NaCl 144 mmol·L-1、KCl 5.8 mmol·L-1、CaCl22.5 mmol·L-1、MgCl24.2 mmol·L-1、葡萄糖11.1 mmol·L-1、HEPES 5 mmol·L-1,pH 7.4。

    1.3儀器HSS-1B數(shù)字式超級恒溫浴鍋(成都儀器廠);微量進(jìn)樣器(上海求精生化試劑儀器有限公司);Power Lab生物信號采集分析系統(tǒng)、張力記錄儀(澳大利亞埃德公司)。

    2 方法

    2.1大鼠胸主動脈血管環(huán)的制備SD大鼠麻醉處死,開胸取出胸主動脈,置于飽和O2的4℃ PSS液中,去除周圍結(jié)締組織后,剪成3~4 mm長度的小血管環(huán)。用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔,水平懸掛于10 mL浴漕內(nèi),下方固定,上方以1根細(xì)鋼絲連于張力換能器上,檢測其張力變化。浴管內(nèi)持續(xù)通入純O2,加入37 ℃ PSS液5 mL,保持浴管溫度為37℃。調(diào)節(jié)血管張力為2 g,保持1 h,每15 min換液1次。

    2.2血管內(nèi)皮功能的檢測使用細(xì)棉花棒去除內(nèi)皮,輕輕穿過胸主動脈血管環(huán),來回摩擦2次。待血管穩(wěn)定后,加入60 mmol·L-1KCl PSS液刺激血管,連續(xù)刺激穩(wěn)定后,即刺激2次所引起的收縮幅度差小于5%后,加入PE(終濃度為1×10-6mol·L-1)預(yù)收縮,穩(wěn)定后加入ACh(1×10-5mol·L-1)。若舒張幅度大于收縮幅度的80%,則視為內(nèi)皮完整,舒張幅度小于收縮幅度的5%,則視為內(nèi)皮去除完全[5]。

    2.3基礎(chǔ)狀態(tài)下卡托普利對離體大鼠主動脈環(huán)的影響待血管穩(wěn)定后,對基礎(chǔ)狀態(tài)下的大鼠胸主動脈環(huán),加入累積濃度卡托普利(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4mol·L-1),觀察血管張力的改變。每次加藥都在上一濃度藥物作用完全達(dá)到平衡后,開始下一濃度實驗。

    2.4累積濃度卡托普利對KCl、PE預(yù)收縮下內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響設(shè)置對照組、實驗組,對照組加入等容量溶劑,實驗組采用累積加藥法加入濃度梯度的卡托普利。檢查內(nèi)皮功能后,經(jīng)60 mmol·L-1KCl PSS溶液刺激,張力平衡后,用PSS溶液清洗,至血管環(huán)張力恢復(fù)基本張力水平。加入PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮后,加入累積濃度的卡托普利(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4mol·L-1),每次加藥都是在上一濃度藥物作用完全達(dá)到平衡后,開始下一濃度實驗。以加入10-6mol·L-1PE或60 mmol·L-1KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%,計算加入卡托普利后,血管舒張幅度占最大收縮幅度的百分比,即加藥后舒張幅度與10-6mol·L-1PE或60 mmol·L-1KCl誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮幅度的百分比。

    2.5L-NAME、Indo對卡托普利舒張血管作用的影響血管環(huán)經(jīng)內(nèi)皮檢測穩(wěn)定后,加入L-NAME(10-4mol·L-1)、Indo(10-5mol·L-1)孵育25 min,用PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮血管,預(yù)收縮達(dá)到坪值后,加入累積濃度的卡托普利。對照組不孵育L-NAME、Indo,直接加PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮血管,達(dá)到坪值后,直接加入累積濃度的卡托普利。每次加藥都是在上一濃度藥物作用完全達(dá)到平衡后,開始下一濃度實驗,記錄相應(yīng)血管環(huán)張力并計算變化值。

    2.6外鈣內(nèi)流對卡托普利舒張血管作用的影響血管預(yù)刺激、檢測內(nèi)皮穩(wěn)定后,用含EGTA的無鈣PSS液洗脫血管20 min,待血管穩(wěn)定,用無鈣PSS(不含EGTA)洗脫10 min后,加入無鈣KCl(60 mmol·L-1)孵育10 min,再加入2.5 mmol·L-1CaCl2,血管達(dá)坪值后,依舊用含EGTA的無鈣PSS液洗脫血管20 min,無鈣PSS (不含EGTA) 洗脫10 min,向水浴槽中分別加入卡托普利(10-6、10-5、10-4mol·L-1),孵育15 min,換液體為無鈣KCl(60 mmol·L-1)孵育10 min,再加入2.5 mmol·L-1CaCl2。以孵育卡托普利前含鈣液中KCl(60 mmol·L-1)的收縮幅度為100 %。

    2.7PKC、Rho激酶對卡托普利舒張血管作用的影響采用內(nèi)皮完整大鼠胸主動脈環(huán),經(jīng)60 mmol·L-1KCl PSS溶液刺激,張力平衡后,用PSS溶液清洗,待張力恢復(fù)到刺激前穩(wěn)定水平,分別加入PKC特異性抑制劑十字孢堿(3×10-8mol·L-1)、激動劑PMA(10-7mol·L-1)或Rho激酶抑制劑fasudil(2×10-6mol·L-1)或激動劑AA(10-9mol·L-1)預(yù)孵25 min后,用PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮血管,達(dá)到坪值后,加入累積濃度的卡托普利,對照組為預(yù)收縮達(dá)到坪值后直接加入卡托普利,記錄相應(yīng)的血管環(huán)張力變化。

    3 結(jié)果

    3.1基礎(chǔ)狀態(tài)下卡托普利對離體大鼠主動脈環(huán)的影響卡托普利累積系列濃度(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4mol·L-1)時,對基礎(chǔ)狀態(tài)下的血管張力無明顯影響,見Fig 1。

    3.2累積濃度卡托普利對KCl、PE預(yù)收縮下內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響卡托普利對KCl(60 mmol·L-1)、PE(10-6mol·L-1)預(yù)刺激的血管環(huán)具有濃度依賴性的舒張作用,且內(nèi)皮完整組和去內(nèi)

    Fig 1 Effect of captopril on basic tension of

    皮組卡托普利最大濃度的舒張程度分別為(0.160±0.013)和(0.084±0.009)、(0.407±0.058)和(0.140±0.048)??瞻讓φ战M對血管張力幾乎無影響。內(nèi)皮組、去內(nèi)皮組與對照組兩相比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且內(nèi)皮組與去內(nèi)皮組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),內(nèi)皮完整組舒張程度大于去內(nèi)皮組(Fig 2、3)。

    3.3L-NAME、Indo對卡托普利舒張血管作用的影響KCl預(yù)收縮下,L-NAME(10-4mol·L-1)、Indo(10-5mol·L-1)組中,卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.071±0.010)和(0.062±0.029)。與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Fig 4A。PE預(yù)收縮下,L-NAME(10-4mol·L-1)、Indo(10-5mol·L-1)組中,卡托普利的最大舒張程度為(0.142±0.028)和(0.171±0.032)。與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Fig 4B。

    Fig 2 Captopril-induced vasorelaxation in endothelium-intact (End+) or -denuded (End-) rat aorta rings precontracted with KCl n=6)

    Relaxation was expressed as percentages of the maximal tension induced by 60 mmol·L-1of KCl.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsEnd++captopril group.

    Fig 3 Captopril-induced vasorelaxation in endothelium-intact(End+) or -denuded(End-) rat aorta rings precontracted with PE n=6)

    Relaxation was expressed as percentages of the maximal tension induced by 10-6mol·L-1PE.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsEnd++captopril group.

    Fig 4 Effect of L-NAME and Indo on thoracic aorta blood vessels in captopril-diastolic rats with precontraction of KCl(A) or PE(B) n=6)

    *P<0.05,**P<0.01vscaptopril group

    3.4外鈣內(nèi)流對卡托普利舒張血管作用的影響無鈣PSS液體中,KCl(60 mmol·L-1)幾乎不引起血管環(huán)收縮,水浴管中加入2.5 mmol·L-1CaCl2,主動脈產(chǎn)生收縮,且收縮幅度與正常KCl(60 mmol·L-1)PSS液體中的收縮程度一致。而孵育卡托普利(10-6、10-5、10-4mol·L-1)會濃度依賴性地抑制2.5 mmol·L-1CaCl2產(chǎn)生的收縮,與未孵育卡托普利組相比,差異有顯著性(Fig 5)。

    Fig 5 Effect of captopril on KCl-induced contraction of isolated rat thoracic aorta rings with 2.5 mmol·L-1 n=6)

    The vessels were incubated with captopril (10-6, 10-5, 10-4mol·L-1) and the control for 15 min before addition of KCl.*P<0.05vscontrol group

    3.5PKC對卡托普利舒張血管作用的影響KCl預(yù)收縮下,PKC抑制劑SP和PKC激動劑PMA組中,卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.296±0.031)和(0.077±0.013)。與卡托普利組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Fig 6A。PE預(yù)收縮下,PKC抑制劑SP和PKC激動劑PMA組中,卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.741±0.104)和(0.261±0.057)。與卡托普利組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Fig 6B。

    3.6Rho激酶對卡托普利舒張血管作用的影響KCl預(yù)收縮下,Rho激酶抑制劑fasudil和Rho激酶激動劑AA組中,卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.251±0.042)和(0.072±0.009)。與卡托普利組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Fig 7A。PE預(yù)收縮下,Rho激酶抑制劑fasudil和Rho激酶激動劑AA組中,卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.849±0.068)和(0.159±0.022)。與卡托普利組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見Fig 7B。

    4 討論

    卡托普利是抗高血壓的一線用藥,其具有明確的舒張血管、降低血壓的作用。目前已發(fā)現(xiàn),卡托普利在冠脈和腎動脈上,對KCl引起的收縮均無明顯

    Fig 6 Effects of PKC on thoracic aorta blood vessels in captopril-diastolic rats with precontraction of KCl (A)or PE (B) n=6)

    *P<0.05,**P<0.01vscaptopril group

    影響,說明其舒張血管的機(jī)制與電壓依賴型鈣通道無關(guān)。使用L-NAME和Indo阻斷一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和環(huán)氧酶(cyclooxygenase, COX)之后,發(fā)現(xiàn)卡托普利可抑制血栓素A2的作用,促進(jìn)前列環(huán)素釋放,部分抑制NOS的作用,說明其對冠脈和腎動脈的舒張作用與內(nèi)皮NO系統(tǒng)相關(guān)[5]。由于卡托普利舒張血管的作用機(jī)制較為復(fù)雜,本實驗采用大鼠胸主動脈,進(jìn)一步研究卡托普利對大動脈血管舒張作用及其與NO的相關(guān)性,同時觀察外鈣內(nèi)流、PKC和Rho激酶對其的影響。

    本實驗結(jié)果顯示,卡托普利對基礎(chǔ)狀態(tài)大鼠胸主動脈張力無明顯作用。在KCl和PE預(yù)刺激下,內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組均對大鼠胸主動脈有濃度依賴性舒張作用,且內(nèi)皮完整組舒張程度大于去內(nèi)皮組,提示卡托普利對血管的舒張作用大部分是通過內(nèi)皮途徑完成。在本實驗中發(fā)現(xiàn),分別孵育NOS抑制劑L-NAME、COX抑制劑Indo后,卡托普利的舒血管作用均部分被阻斷,提示NO、前列環(huán)素參與卡托普利的舒血管作用,表明卡托普利可促進(jìn)前列環(huán)素和NO的釋放,可能通過NO-cGMP途徑舒張血管或直接使收縮蛋白去磷酸化來舒張血管[7]。

    Fig 7 Effects of Rho kinase on thoracic aortic vascularization in captopril-induced relaxation rats under precontraction of KCl(A) or PE(B) n=6)

    *P<0.05,**P<0.01vscaptopril group

    原發(fā)性高血壓中其鈣動員異常,細(xì)胞外鈣內(nèi)流是影響鈣動員原因之一。外鈣內(nèi)流通道有受體調(diào)控型鈣通道和電壓門控型鈣通道[8-9]。60 mmol·L-1KCl引起收縮是因為高鉀引起了細(xì)胞膜去極化,電壓門控型鈣通道開放,致使外鈣內(nèi)流。本實驗無鈣條件下,KCl預(yù)刺激,孵育卡托普利后抑制了2.5 mmol·L-1CaCl2引起的血管平滑肌收縮,提示抑制電壓門控型的鈣通道開放,抑制外鈣內(nèi)流可能也是卡托普利對大鼠離體主動脈舒血管機(jī)制之一。

    大量研究表明,高糖、高AngⅡ、氧化應(yīng)激均可引起PKC活力增高[10-11],PKC的激活在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能屏障、血管通透性、血管舒縮方面有重要作用,是參與高血壓發(fā)病的重要信號通路。本研究結(jié)果顯示,應(yīng)用PKC抑制劑SP作用于大鼠胸主動脈,卡托普利的舒血管作用被加強(qiáng),而應(yīng)用PKC激動劑PMA作用于大鼠胸主動脈,卡托普利的舒血管作用部分被阻斷,表明PKC信號通路可能參與卡托普利的舒血管作用。

    在機(jī)體內(nèi)多種影響因子的刺激下,體內(nèi)Rho激酶會激活,激活的RhoA與ROCK結(jié)合后,增加鈣調(diào)蛋白生成,使肌球蛋白輕鏈活化,上調(diào)磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)水平,MLC20的磷酸化水平,可影響血管收縮[12]。研究發(fā)現(xiàn),Rho激酶表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的功能性血管收縮與高血壓的發(fā)病有明顯相關(guān)性,抑制Rho激酶可以阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的MLC磷酸化增加和p-MLC去磷酸化抑制,促進(jìn)小動脈舒張。本實驗應(yīng)用ROCK抑制劑fasudil作用于大鼠胸主動脈,卡托普利的舒血管作用增強(qiáng),而使用ROCK的激動劑AA后,卡托普利的舒血管作用減弱,表明Rho激酶信號通路可能參與卡托普利的舒血管作用。有證據(jù)表明,在同一細(xì)胞內(nèi)信號通路中,PKC在Rho激酶上游發(fā)揮作用[13],故卡托普利可能通過抑制PKC-Rho激酶信號通路,發(fā)揮對血管的舒張作用。

    綜上所述,卡托普利的舒張血管環(huán)作用可能與NO-cGMP途徑、前列環(huán)素通路及外鈣內(nèi)流相關(guān),同時其可能通過抑制PKC-Rho激酶信號通路,參與其舒張作用??ㄍ衅绽m已在臨床上治療高血壓應(yīng)用多年,但對PKC、Rho激酶與卡托普利的相關(guān)性只進(jìn)行了初步研究,具體信號通路機(jī)制將需進(jìn)一步的深入研究。

    (致謝:本實驗在山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室完成,感謝張明升教授及藥理學(xué)教研室各位老師的幫助。)

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