麻鴨鈣非依賴性磷脂酶A2ε(iPLA2ε)的克隆和表達(dá)純化

張玉梅， 李鵬鵬， 王晶晶， 王道營(yíng)， 徐為民，3

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210095

磷脂是含有磷酸的脂類的總稱，富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。肉制品中肌內(nèi)脂肪的50%以上為磷脂(又稱為肌內(nèi)磷脂)。肌內(nèi)磷脂水解產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸極易發(fā)生氧化，氧化產(chǎn)物一方面會(huì)使產(chǎn)品色澤、風(fēng)味發(fā)生改變并造成營(yíng)養(yǎng)損失[1]，另一方面能形成腌臘肉制品的腌香風(fēng)味[2]。肌內(nèi)磷脂的水解是肉品風(fēng)味變化的來(lái)源，如何控制磷脂水解反應(yīng)，利用其水解氧化對(duì)肉品風(fēng)味產(chǎn)生的雙重效應(yīng)來(lái)調(diào)控肉品品質(zhì)成為研究的熱點(diǎn)。內(nèi)源酶是引起肌內(nèi)磷脂水解的主要原因[3-5]，包括脂肪酶和磷脂酶(磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D等)，其中磷脂酶A2(PLA2)被證明在肌內(nèi)磷脂水解過(guò)程中起重要作用[3-4]。

鈣非依賴性磷脂酶A2ε是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類非鈣依賴的磷脂酶A2，該酶同時(shí)具有PLA2、三甘油酯水解酶和?；D(zhuǎn)移酶等多種功能[6]。人和小鼠的iPLA2ε均為4次跨膜蛋白，能夠催化磷脂水解，參與脂質(zhì)代謝、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。iPLA2磷脂酶家族的氨基酸序列都包含1個(gè)Patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域。Patatin是非特異性的脂質(zhì)?；饷?，該結(jié)構(gòu)域有1個(gè)絲氨酸-天冬氨酸(Ser-Asp)催化水解二元體，能夠催化酯鍵水解。Xiao等的研究表明，iPLA2ε的近源磷脂酶——iPLA2η在火腿的加工過(guò)程中起著重要作用[8]。iPLA2ε在禽類的骨骼肌及脂肪細(xì)胞中都能以高豐度表達(dá)，且iPLA2ε在雞的脂質(zhì)代謝中起著重要作用[9]。雖然禽類與人、小鼠等哺乳動(dòng)物的iPLA2ε都包含Paptatin結(jié)構(gòu)域，但是禽類與哺乳動(dòng)物的iPLA2ε序列同源性僅有30%，且目前鮮有關(guān)于禽類iPLA2ε磷脂酶的報(bào)道。本研究采用基因克隆技術(shù)，利用GenBank數(shù)據(jù)，從麻鴨cDNA中篩選并克隆到iPLA2ε的編碼基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，擬在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)異源可溶性表達(dá)。本研究結(jié)果將為鈣非依賴性磷脂酶A2在肉品磷脂水解中的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻鴨，購(gòu)自江蘇省南京市孝陵衛(wèi)集貿(mào)市場(chǎng)，將其宰后采集組織，于-80 ℃保存；酵母提取物、胰蛋白胨，購(gòu)自O(shè)xoid公司；瓊脂粉，購(gòu)自南京奧多福尼生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌Trans5α和Transetta2，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaqDNA聚合酶、pMD19-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ、T4DNA連接酶等，購(gòu)自TaKaRa公司；pMCH載體，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；咪唑、氯化鈉，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺、蛋白定量測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA Purifier蛋白純化系統(tǒng)及Superdex G200和Ni-NTA親和層析柱，美國(guó)GE Healthcare公司；TP600梯度升降溫功能PCR儀，上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C pH計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；UV-6100型分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽，北京六一儀器廠；JS-680C全自動(dòng)凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司；VD-650超凈工作臺(tái)，蘇州江東精密儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀，美國(guó)Bio-Rad；TS-1脫色搖床，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；IMS-20全自動(dòng)雪花制冰機(jī)，常熟雪科電器有限公司；超純水機(jī)，南京前沿儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中北京鴨的全基因組信息(序列號(hào)為XP_005030132)，基于其基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因的特異性引物。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 麻鴨總RNA的提取 麻鴨總RNA的提取按照TaKaRa公司的TRIzol說(shuō)明書進(jìn)行操作。取100 mg胸肌提取總RNA，總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)，用Eppendorf公司的核酸定量分析儀測(cè)定D260 nm/D280 nm值及RNA濃度，以1 μL總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于4 ℃保存，長(zhǎng)期保存應(yīng)放于-20 ℃。

1.3.3 目的基因的獲得 以提取的總RNA為模板，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，其中模板1 μL，SuperTaq2×Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物純化回收后連接至pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR、酶切和PCR鑒定，將連接正確的重組基因質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3.4 序列分析 測(cè)序結(jié)果用LaserGene軟件進(jìn)行序列分析，iPLA2ε基因克隆結(jié)果用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)。利用ProtParam分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)。

1.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

在37 ℃下用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切pMD19T-iPLA2ε及原核表達(dá)載體pMCH 2 h，將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠純化回收后，用T4連接酶連接(22 ℃、2 h)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α后進(jìn)行菌液PCR及雙酶切，以鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 融合蛋白原核表達(dá)及可溶性分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta2感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落接種至5 mL含有100 μg/mL卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600 nm為0.6～0.8時(shí)[10]，加入IPTG至終濃度為 0.25 mmol/L，22 ℃、200 r/min搖晃誘導(dǎo)過(guò)夜。以不加IPTG誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，離心收集沉淀，用Tris-HCl重懸沉淀，于超聲波細(xì)胞破碎儀上破碎5 min，12 000 r/min離心5 min，分別取出上清、沉淀，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱SDS-PAGE)上樣緩沖液，95 ℃加熱 10 min，通過(guò)12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白是否為可溶性蛋白。

1.6 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將上述鑒定的能可溶性表達(dá)iPLA2ε的菌落接種于 500 mL 含有100 μg/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。先離心(4 500 r/min，15 min)后收集菌體，用Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH值為8.0；150 mmol/L NaCl)重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎20 min(功率比為20%，超聲 1 s，間停3 s)；再離心(12 000 r/min，30 min，4 ℃)后收集上清，棄菌體沉淀。將上清加入鎳親和層析柱中，用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，用咪唑濃度為20 mmol/L的清洗緩沖液洗滌去除雜蛋白，用咪唑濃度為250 mmol/L的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，使蛋白得到初步純化。取樣液，加入SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，加熱(95 ℃，10 min)后用12% SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。將較純的樣品用10 ku的超濾管離心濃縮(4 ℃，4 000 r/min，10 min/次)，再用Superdex G200進(jìn)一步純化，然后用SDS-PAGE檢測(cè)純化的產(chǎn)物并離心濃縮。用考馬斯亮藍(lán)染色的方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并于-80 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻鴨骨骼肌總RNA的提取及iPLA2ε編碼基因的擴(kuò)增

用麻鴨骨骼肌組織提取細(xì)胞總RNA，由圖1-A可以看出，麻鴨骨骼肌總RNA電泳顯示出28S、18S、5S 3個(gè)條帶，其中28S條帶略比18S條帶亮，且沒(méi)有其他雜條帶，但是條帶有輕微彌散，說(shuō)明總RNA存在少量降解。用紫外分光光度計(jì)測(cè)得所提取的RNA樣品濃度約為4.8 μg/μL，D260 nm/D280 nm值為1.98，表明提取的總RNA完整性良好，質(zhì)量較好，符合接下來(lái)的反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)要求。

本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中北京鴨的全基因組信息(登錄號(hào)為XP_005030132)，基于其基因序列設(shè)計(jì)了iPLA2ε編碼基因的PCR擴(kuò)增引物。以“2.1”節(jié)提取的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以此為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到iPLA2ε基因產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在 1 500 bp 附近出現(xiàn)1條明亮且單一的條帶(圖1-B)。

2.2 iPLA2ε基因的克隆載體構(gòu)建

將iPLA2ε基因的PCR產(chǎn)物純化后連接至克隆載體 pMD-19T上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定。如圖2所示，陽(yáng)性克隆的PCR擴(kuò)增條帶明亮、單一，且位置正確，大小在 1 500 bp 左右。提取圖2中的4、5、6號(hào)條帶對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性菌落重組質(zhì)粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，3個(gè)克隆片段均正確無(wú)誤，所得麻鴨iPLA2ε基因的全長(zhǎng)為1 425 bp，符合預(yù)期結(jié)果。

2.3 iPLA2ε基因的生物信息學(xué)分析

用ExPASyProParam分析iPLA2ε基因所編碼的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，結(jié)果表明，iPLA2ε編碼的蛋白質(zhì)全長(zhǎng)為474個(gè)氨基酸，分子量約為54 ku，理論等電點(diǎn)為7.86，帶負(fù)電荷氨基酸[天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu)]數(shù)量為51個(gè)，帶正電荷氨基酸[精氨酸(Arg)+賴氨酸(Lys)]數(shù)量為53個(gè)。用TMpred工具分析iPLA2ε蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)和跨膜方向表明，第109至127位氨基酸處預(yù)測(cè)為明顯的由內(nèi)向外的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，第311至332位氨基酸處可能為1個(gè)由外向內(nèi)的跨膜區(qū)(圖3)。

將iPLA2ε的氨基酸序列在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，iPLA2ε序列包含1個(gè)Patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域，屬于Patatin樣磷脂酶家族。Patatin是非特異性的脂質(zhì)?；饷福摻Y(jié)構(gòu)域有1個(gè)絲氨酸-天冬氨酸催化水解二元體，可催化酯鍵水解。通過(guò)同源序列比對(duì)分析iPLA2ε可能的催化活性位點(diǎn)氨基酸Ser(保守基序?yàn)镚ly-X-Ser-X-Gly，其中Gly為甘氨酸，X為任意氨基酸)及Asp(保守基序?yàn)锳sp-Gly-Gly)(圖4)。iPLA2ε多序列比對(duì)中序列的GenBank登錄號(hào)如下：NP_079501、NP_001139598、XP_015146672和XP_005030132。

2.4 iPLA2ε基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ對(duì)表達(dá)載體pMCH和PCR獲得的iPLA2ε基因進(jìn)行雙酶切，回收目的片段和載體片段，并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，通過(guò)菌落PCR鑒定是否連接成功，以判斷是否獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ、SalⅠ雙酶切后的鑒定結(jié)果如圖5所示，其中大小為5 000 bp的大片段和約為1 500 bp的小片段分別與pMCH和iPLA2ε基因大小相符。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序，結(jié)果表明，基因插入位置、閱讀框及重組基因序列均準(zhǔn)確無(wú)誤，表明目的基因已被成功地克隆至表達(dá)載體pMCH中，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其命名為pMCH-iPLA2ε(圖6)。

2.5 iPLA2ε重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測(cè)

將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到Transetta2感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.25 mmol/L IPTG在28 ℃下小量誘導(dǎo)表達(dá)4 h。離心收集菌體，超聲破碎細(xì)胞。為了研究融合蛋白的可溶性，將破碎后的菌體上清、沉淀分別進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè)置未加誘導(dǎo)劑的重組質(zhì)粒菌液作為對(duì)照。如圖7所示，對(duì)比泳道1和泳道2、3，發(fā)現(xiàn)利用該系統(tǒng)可以表達(dá)MBP-iPLA2ε，蛋白大小約為90 ku，與預(yù)期大小一致，未加IPTG誘導(dǎo)劑的重組菌在預(yù)期大小的條帶處沒(méi)有出現(xiàn)明顯的表達(dá)條帶。另外，將泳道2與泳道3相比可以明顯看出，在28 ℃誘導(dǎo)條件下，大腸桿菌可以大量可溶性表達(dá)MBP-iPLA2ε(MBP為麥芽糖結(jié)合蛋白)。

2.6 重組蛋白的純化

2.6.1 MBP-iPLA2ε重組蛋白的初步純化 由于原核表達(dá)的目的蛋白iPLA2ε在N-端帶有MBP標(biāo)簽，首先采用 Ni-NTA 分離純化蛋白，收集用不同咪唑濃度的緩沖液洗脫得到的組分，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。圖8結(jié)果顯示，用 20 mmol/L 咪唑洗脫可以去除較多雜蛋白，用50 mmol/L咪唑洗脫可進(jìn)一步去除雜蛋白，用250 mmol/L咪唑洗脫可以得到較純的MBP-iPLA2ε重組蛋白，表明通過(guò)此方法可以有效地純化大腸桿菌表達(dá)的MBP-iPLA2ε。收集250 mmol/L咪唑洗脫得到的洗脫液，并用分子截留量為10 ku的超濾管進(jìn)行濃縮，為下一步凝膠層析作準(zhǔn)備。

2.6.2 MBP-iPLA2ε重組蛋白的凝膠過(guò)濾結(jié)果 將樣品經(jīng)過(guò)Superdex G200層析柱純化，將洗脫液按照一定的體積收集起來(lái)，并用12% SDS-PAGE檢測(cè)。如圖9所示，3、4號(hào)管雖然含有目的蛋白，但同時(shí)也含有較多的雜蛋白，用2號(hào)管收集的洗脫液去除了部分小分子蛋白，融合蛋白條帶比較單一，雜帶也消失了，為較純的目的蛋白。將該管洗脫峰收集起來(lái)濃縮后用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，分裝后于-80 ℃保存待用。

3 討論與結(jié)論

磷脂屬于復(fù)合脂，指含有磷酸的脂類，分為甘油磷脂、鞘磷脂兩類。磷脂酶屬于可水解甘油磷脂的一類酶，主要有磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D，其中磷脂酶A1(PLA1)主要分布在細(xì)菌中，能夠特異性地水解甘油磷脂分子的第1位酯鍵，而PLA2主要分布在動(dòng)物組織細(xì)胞中[11-12]，選擇在第2位?；飧视土字肿樱琍LA1、PLA2作用于磷脂后，均生成自由脂肪酸和溶血磷脂[13]，從而廣泛參與細(xì)胞的代謝和調(diào)節(jié)。徐為民等通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)檢測(cè)出磷脂酶解產(chǎn)物含有油酸，說(shuō)明PLA2作用在磷脂甘油部分的Sn-2位點(diǎn)[14]。王道營(yíng)通過(guò)模擬卵磷脂酶解產(chǎn)物體系，發(fā)現(xiàn)Sn-2位點(diǎn)脂肪酸鏈缺失的溶血磷脂存在，證實(shí)了PLA2在磷脂水解中的重要作用[15]。PLA2除了具有水解磷脂的酶活性外，還具有多種生理學(xué)活性，如促進(jìn)或抑制血小板活性、抗菌、溶血等，同一種PLA2可具有多種生理學(xué)活性，其中一部分依賴于PLA2的酶活性。鈣離子是PLA2酶活性的輔助因子[16]，但目前對(duì)鈣離子的作用機(jī)制尚不明確。

由于分泌型磷脂酶A2對(duì)鈣離子具有依賴性，而非鈣離子依賴型則對(duì)鈣離子無(wú)依賴性，所以針對(duì)鈣離子對(duì)磷脂酶A2影響的研究較多[17-19]。本研究運(yùn)用基因克隆技術(shù)，以麻鴨cDNA為模板，得到了iPLA2ε基因，并成功構(gòu)建了pMCH-iPLA2ε重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼蛋白質(zhì)含有2個(gè)跨膜區(qū)，為膜蛋白。采用ExPASyProParam預(yù)測(cè)iPLA2ε蛋白質(zhì)性質(zhì)，結(jié)果顯示，該基因編碼474個(gè)氨基酸，其中帶負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu)數(shù)量為51個(gè)，帶正電荷氨基酸(Arg+Lys)數(shù)量為53個(gè)，分子量約為54 ku，理論等電點(diǎn)為7.86。因iPLA2ε序列包含1個(gè)Patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域，又屬于Patatin樣磷脂酶家族。Patatin是非特異性的脂質(zhì)酰基水解酶，該結(jié)構(gòu)域有1個(gè)絲氨酸-天冬氨酸(Ser-Asp)催化水解二元體，可催化酯鍵水解。本研究還通過(guò)同源序列比對(duì)分析了iPLA2ε可能的催化活性位點(diǎn)氨基酸Ser(保守基序Gly-X-Ser-X-Gly)及Asp(Asp-Gly-Gly)。由于動(dòng)物體內(nèi)磷脂酶的種類較多，反應(yīng)體系較復(fù)雜，目前關(guān)于禽類iPLA2ε磷脂酶的報(bào)道較少。

本研究采用大腸桿菌pMCH表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建iPLA2ε基因表達(dá)質(zhì)粒，并在iPLA2ε基因N-端連接大腸桿菌malE基因，該基因編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)可增加融合蛋白的溶解性，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了iPLA2ε的可溶性表達(dá)。由于融合蛋白C-端含組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，首先選用鎳柱親和層析，再通過(guò)凝膠過(guò)濾層析純化，最終獲得較純的iPLA2ε蛋白。由于iPLA2ε蛋白的可溶性較低，而麥芽糖結(jié)合蛋白大小為42.5 ku，不含Cys，常作為融合標(biāo)簽提高重組蛋白的可溶性[20]，尤其對(duì)一些難溶的蛋白如病毒蛋白、膜蛋白和一些真核細(xì)胞蛋白有更好的促溶能力。本研究在iPLA2ε蛋白的N-端引入MBP融合標(biāo)簽，顯著提高了疏水性跨膜蛋白iPLA2ε在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)時(shí)的可溶性，為后續(xù)研究鈣非依賴性磷脂酶A2在肉品磷脂水解中的研究奠定了工作基礎(chǔ)。