干旱脅迫對(duì)金銀花葉片葉綠素含量及熒光特性的影響

馬雪梅， 吳朝峰

(河南安陽(yáng)工學(xué)院，河南安陽(yáng) 455000

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicerajaponica)的干燥花蕾，是我國(guó)常用中藥材，具有抗菌、抗病毒、清熱解毒、保肝利膽之功效，主要分布在我國(guó)山東、河南、河北、湖北等省。河南省金銀花大多種植于丘陵地區(qū)或山區(qū)，水分短缺成為影響金銀花生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量、品質(zhì)的主要因素之一。

葉綠素是植物光合作用中的重要色素。在干旱脅迫下，植物葉片的片層結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞，葉綠素發(fā)生分解而導(dǎo)致含量降低、葉片發(fā)黃，在一定范圍內(nèi)，葉綠素含量的高低會(huì)直接影響葉片的光合作用，進(jìn)而影響植物抗旱性的強(qiáng)弱[1-2]。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在測(cè)定葉片光合作用過(guò)程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、轉(zhuǎn)換、耗散、分配等方面具有獨(dú)特的作用，是探測(cè)分析植物光合功能、研究植物光合生理與逆境脅迫關(guān)系的一個(gè)重要手段[3]。本試驗(yàn)通過(guò)研究干旱脅迫對(duì)河南省金銀花葉片葉綠素含量變化及熒光特性的影響，了解干旱脅迫對(duì)金銀花葉片光合作用的影響機(jī)制，為河南省金銀花抗旱特性的鑒定、耐旱性較強(qiáng)品種的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試金銀花品種為金豐一號(hào)、大毛花、密銀花，分別來(lái)自河南省封丘縣、安陽(yáng)市、新密市。

1.2 試驗(yàn)處理

2014年3月下旬，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、大小基本一致的金銀花扦插苗，移栽到基質(zhì)相同、直徑為25 cm、深為30 cm的花盆內(nèi)，每盆1株，正常管理1年。2015年7月27日傍晚澆透水，次日開(kāi)始分別進(jìn)行輕度干旱脅迫(LS)、中度干旱脅迫(MS)、重度干旱脅迫(SS)3種不同干旱脅迫處理，土壤相對(duì)含水量分別為田間持水量的70%～75%、40%～45%、20%～25%，以土壤相對(duì)含水量為田間持水量的85%～90%為對(duì)照(CK)。每處理5盆，重復(fù)3次。采用稱(chēng)重法測(cè)定土壤水分含量，脅迫處理2d后進(jìn)行常規(guī)的水分管理，保證植株生長(zhǎng)旺盛。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 葉綠素含量 將脅迫處理15 d后的新鮮葉片洗凈，擦干，快速剪成直徑約為5 mm的碎片，分成3份；每份稱(chēng)取 0.2 g，放入25 mL具塞刻度試管中，加入95%乙醇溶液 10 mL，密封，置于暗處浸泡2 d待葉片全部變白；將色素提取液倒入1 cm光徑的比色杯內(nèi)，以95%乙醇溶液為空白，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)為663、645 nm的吸光度(D值)，計(jì)算葉片葉綠素a含量(Ca)、葉綠素b含量(Cb)、葉綠素總含量(Ct)，單位為mg/g，計(jì)算公式分別為：Ca=(12.70D663 nm-2.59D645 nm)×V/(WF×1 000)；Cb=(22.90D645 nm-4.67D663 nm)×V/(WF×1 000)；Ct=Ca+Cb=(22.20D645 nm+8.02D663 nm)×V/(WF×1 000)。式中，D663 nm、D645 nm分別為波長(zhǎng)663、645 nm處的吸光度；V為提取液的總體積，mL；WF為樣品鮮質(zhì)量，g。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 于干旱脅迫處理周期結(jié)束當(dāng)天08：00—10：00，采用德國(guó)WALZ產(chǎn)PAM-2100型便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定金銀花葉片的熒光參數(shù)。測(cè)定時(shí)，將葉片暗適應(yīng)20 min，照射測(cè)量光小于0.5 μmol/(m2·s)時(shí)測(cè)初始熒光(Fo)，照射飽和脈沖為2 800 μmol/(m2·s)時(shí)測(cè)定最大熒光(Fm)；打開(kāi)光照度為600 μmol/(m2·s)的內(nèi)源光化光持續(xù)5 min，測(cè)定光適應(yīng)下的穩(wěn)定態(tài)熒光(Ft)，隔20 s打開(kāi)飽和脈沖測(cè)定光適應(yīng)下的最大熒光(Fm′)。根據(jù)測(cè)定的參數(shù)計(jì)算光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)、PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ光化學(xué)量子產(chǎn)量(Y)、表觀光合電子傳遞速率(ETR)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)，計(jì)算公式分別為：

Fv/Fo=(Fm-Fo)/Fo；

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm；

Y=(Fm′-Ft)/Fm′；

ETR=Y×PAR×0.50×0.84；

qP=(Fm′-Ft)/(Fm′-Fo)；

qN=(Fm-Fm′)/(Fm-Fo)。

式中，PAR為光合有效輻射。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，葉綠素a(Chla)含量越高；在脅迫下有利于保持較高的光合強(qiáng)度，葉綠素b(Chlb)含量越大，表明其在脅迫下降解速度緩慢；葉綠素a與葉綠素b的比值(Chla/b)可反映出葉綠素a、葉綠素b對(duì)脅迫的敏感性及脅迫對(duì)二者的傷害程度。由圖1、圖2、圖3可知，隨干旱脅迫程度加劇，3種金銀花葉片的葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，葉綠素b含量微小變化。說(shuō)明干旱脅迫引起葉綠素a含量顯著下降，從而導(dǎo)致葉綠素總量下降。整個(gè)處理過(guò)程，金豐一號(hào)葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉綠素總量都最高，其次是密銀花，大毛花最低。經(jīng)SS處理后，3種金銀花葉片葉綠素總量降幅大小依次為：大毛花(48.5%)>密銀花(42.3%)>金豐一號(hào)(34.3%)，說(shuō)明3種金銀花抗旱能力的大小為：金豐一號(hào)>密銀花>大毛花。圖4表明，干旱脅迫程度加劇，葉綠素(a/b)值呈現(xiàn)先升后降，在SS處理下，葉綠素(a/b)下降幅度數(shù)值大小順序?yàn)榇竺?51.6%)>密銀花(44.1%)>金豐一號(hào)(33.5%)。說(shuō)明隨著干旱脅迫程度的加劇，葉綠素合成受阻，分解速率增大，葉綠素含量下降。

2.2 干旱脅迫對(duì)3種金銀花葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1 對(duì)初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)的影響 初始熒光(Fo)表示葉片PSⅡ反應(yīng)中心處于完全開(kāi)放時(shí)的熒光水平，F(xiàn)o上升表明PSⅡ反應(yīng)中心被破壞或可逆失活[4-5]。由圖5可知，3種金銀花葉片F(xiàn)o均隨脅迫程度加劇呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，與CK相比，經(jīng)LS處理，3種金銀花葉片F(xiàn)o增幅不明顯，在MS下，F(xiàn)o增幅有了一定的變化，而在SS下，金豐一號(hào)、大毛花和密銀花葉片F(xiàn)o比CK分別高12.0%、14.3%和13.1%，表明PSⅡ反應(yīng)中心破壞程度加劇。

最大熒光(Fm)是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量，其數(shù)值降低可作為光抑制的一個(gè)特征[6]。由圖6可知，3種金銀花均表現(xiàn)出脅迫程度加劇、葉片F(xiàn)m明顯下降的特性。與CK相比，在LS、MS下，F(xiàn)m降幅不明顯，重度干旱脅迫下，F(xiàn)m明顯下降，其中金豐一號(hào)葉片F(xiàn)m降低了23.1%，大毛花降低了26.4%，密銀花降低了24.5%。

2.2.2 潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)和最大光化學(xué)效率(Fv/Fm) 可變熒光Fv反映PSⅡ原初電子受體QA的還原情況，代表PSⅡ光化學(xué)活性的大小[7]。Fv/Fo和Fv/Fm是研究葉綠素?zé)晒獾?個(gè)重要參數(shù)，分別代表PSⅡ的潛在活性和原初光能轉(zhuǎn)化效率。圖7、圖8表明，3種金銀花葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo均呈現(xiàn)出隨脅迫程度加劇下降幅度增加的特點(diǎn)，說(shuō)明干旱脅迫使PSⅡ潛在活性中心受損，進(jìn)而影響到植物光合作用的原初反應(yīng)，光合電子傳遞過(guò)程受到影響，而光化學(xué)效率的高低直接決定葉片光合作用的高低。與CK相比，3種金銀花葉片F(xiàn)v/Fo下降顯著，且在SS下，金豐一號(hào)、大毛花和密銀花Fv/Fo值比CK分別下降了38%、43.5%和40.4%。表明重度干旱脅迫使金銀花3個(gè)品種受到較大程度的傷害。由圖8可知，正常供水情況下，3種金銀花葉片F(xiàn)v/Fm在0.80以上。且隨干旱脅迫程度加劇，F(xiàn)v/Fm明顯下降。與CK相比，金豐一號(hào)、大毛花和密銀花Fv/Fm值分別下降了9.66%、12.3%和10.9%，最大光化學(xué)效率順序?yàn)榻鹭S一號(hào)>密銀花 >大毛花。表明大毛花光合作用受干旱脅迫影響較大。

2.2.3 光化學(xué)量子產(chǎn)量(Y)和表觀光合電子傳遞速率(ETR) 光化學(xué)量子產(chǎn)量用來(lái)表示植物光合作用電子傳遞的量子產(chǎn)額，可作為植物光合電子傳遞速率快慢的相對(duì)指標(biāo)[8]。表觀光合電子傳遞速率反映實(shí)際光強(qiáng)條件下的表觀電子傳遞效率。從圖9、圖10可知，3個(gè)金銀花品種的Y和ETR均隨著脅迫程度加劇呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。與CK相比，金豐一號(hào)、密銀花和大毛花Y值分別降低了48.4%、54.1%和50.4%，而ETR下降了40.7%、54.7%和45.9%。其中金豐一號(hào)下降幅度最小，大毛花下降幅度最大。說(shuō)明干旱脅迫對(duì)大毛花光合電子傳遞過(guò)程破壞較大，而對(duì)金豐一號(hào)破壞較輕，進(jìn)而表明金豐一號(hào)適應(yīng)干旱環(huán)境的能力較強(qiáng)，表現(xiàn)出較好的抗旱性。

2.2.4 干旱脅迫對(duì)光化學(xué)淬滅系數(shù)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)的影響

2.2.4.1 光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP) 熒光猝滅是植物體內(nèi)光合量子效率調(diào)節(jié)的一個(gè)重要方面，它分為光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)，qP越大，表示光能中轉(zhuǎn)化為活潑化學(xué)能的能量越多，植物對(duì)光能的利用效率也越高[9]。同時(shí)說(shuō)明PSⅡ的電子傳遞活性和反應(yīng)中心開(kāi)放部分的比例越高[10-11]。圖11表明，3種金銀花葉片qP均隨著干旱脅迫程度的增加而呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。在LS下，金豐一號(hào)、大毛花、密銀花qP降幅分別為5.38%、9.89%和7.37%，差異不顯著，說(shuō)明金銀花在輕度干旱脅迫時(shí)，qP受到的影響較小，PSⅡ仍能維持較高的光合電子傳遞活性。在SS下，與CK相比，金豐一號(hào)、大毛花和密銀花金銀花qP降幅明顯，分別下降25.8%、36.3%和32.6%，表明SS下，大毛花PSⅡ的電子傳遞活性受到抑制?？傊?，金豐一號(hào)抗旱性較強(qiáng)，密銀花抗旱性居中，大毛花抗旱性弱。

2.2.4.2 非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN) 化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)反映PSⅡ反應(yīng)中心天線(xiàn)色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分[12]。qN是一種自我保護(hù)機(jī)制，PSⅡ通過(guò)提高非輻射性熱耗散來(lái)消耗其吸收的過(guò)量的光能，從而保護(hù)自己免受因天線(xiàn)色素吸收過(guò)多光能而引起光合器官破壞或損傷，對(duì)保護(hù)器官起一定的作用。由圖12可知，隨著干旱脅迫程度的增加，3種金銀花葉片qN值均呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，說(shuō)明在干旱脅迫下，金銀花各品種PSⅡ反應(yīng)中心潛在熱耗散能力增強(qiáng)，從而避免因PSⅡ吸收過(guò)量光能而引起光合器官損傷。在LS和MS下，3種金銀花葉片qN增加幅度均較小，重度干旱脅迫時(shí)，3種金銀花品種的qN顯著增大，且與CK相比，金豐一號(hào)、大毛花和密銀花的qN值分別上升了44.6%、19.4%和30.2%，表明金豐一號(hào)通過(guò)提高qN及時(shí)耗散過(guò)剩的光能，有效保護(hù)了光合器官免受破壞。

3 小結(jié)

葉綠素a、葉綠素b分子含量多少及降低幅度大小、Chla/b的比值大小可反映出葉綠素a和葉綠素b對(duì)脅迫的敏感性及脅迫對(duì)葉綠素的傷害程度。試驗(yàn)表明，金豐一號(hào)葉綠素a含量、葉綠素b含量以及葉綠素總量都最高，葉綠素a/b下降幅度最小。說(shuō)明金豐一號(hào)的抗旱性?xún)?yōu)于其他金銀花品種。

Fo、Fv、Fv/Fm和Y等熒光參數(shù)的變化程度可用來(lái)鑒別植物抵抗或忍耐干旱的能力[13-14]。本研究表明，正常供水條件下，3個(gè)金銀花品種的Fo有一定的差異，F(xiàn)m、Fv、Fv/Fo、Yield、qP、ETR等熒光參數(shù)差異較小。說(shuō)明正常供水條件下，3個(gè)金銀花品種葉片的PSⅡ反應(yīng)中心的開(kāi)放程度有所不同。水分脅迫下，3個(gè)金銀花品種的熒光參數(shù)都發(fā)生變化，以重度干旱脅迫為例，金豐一號(hào)葉片的Fv/Fm、Fv/Fo、Y、qP、qN、ETR等各個(gè)熒光參數(shù)的平均值均高于其他2種金銀花，而Fo低于其他品種；從熒光參數(shù)在干旱脅迫下的變化幅度看，與其他2種金銀花品種相比，金豐一號(hào)Fv/Fm、Fv/Fo、qP、Y、ETR下降幅度最小，但金豐一號(hào)葉片F(xiàn)o增加幅度最小、qN增加幅度最大。說(shuō)明干旱脅迫下金豐一號(hào)PSⅡ反應(yīng)中心的脅迫耐性較強(qiáng)，葉片的光化學(xué)效率較高，因此，金豐一號(hào)具有較強(qiáng)的抗旱性。