低氧狀態(tài)下紅景天通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞腎上腺髓質(zhì)素及其受體的表達(dá)

姜曉斐 羅心平 高秀芳 施海明

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200040)

紅景天是景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物,生長于高寒低氧地帶,藥理作用廣泛[1],其耐缺氧、抗心肌缺血作用的機(jī)制[2-3]一直受到關(guān)注。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族成員,具有促進(jìn)血管擴(kuò)張、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管新生等多種生物學(xué)效應(yīng)[4-5],降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor,CRLR)是ADM的特異性受體,與之結(jié)合產(chǎn)生系列生物學(xué)效應(yīng)。我們之前的研究[6-8]證實(shí)紅景天具有促缺血心肌血管新生作用,這一作用主要存在于低氧狀態(tài)下,與紅景天上調(diào)ADM及CRLR的表達(dá)有關(guān),并且作用具有一定的靶向性。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)[9-10]是體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子,在維持體內(nèi)氧平衡中起著舉足輕重的地位,目前已知ADM基因有多處HIF-1結(jié)合位點(diǎn),CRLR基因啟動子中亦含有HIF-1結(jié)合位點(diǎn),HIF-1α是否是紅景天對ADM系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的上游機(jī)制尚不清楚。因此我們通過低氧狀態(tài)下紅景天處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)觀察ADM、CRLR及HIF-1α基因的表達(dá)情況,并通過siRNA技術(shù)敲低HIF-1α基因探討紅景天作用中ADM及其受體CRLR與HIF-1α之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs由中科院細(xì)胞庫提供。細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中,置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

藥物與藥物配置大花紅景天塊莖購于上海雷允上大藥房。紅景天塊莖粉碎成粉狀,入中藥提取罐加水加熱,提取藥汁、篩網(wǎng)過濾、真空濃縮后入真空干燥箱干燥,干燥后粉碎機(jī)粉碎制成紅景天干粉(1 kg紅景天塊莖可制成紅景天干粉211.59 g),以紅景天苷單體為標(biāo)準(zhǔn)品采取高效液相色譜法測定紅景天干粉中紅景天苷單體的含量為0.83% (即每1 g紅景天干粉中含有8.3 mg紅景天苷單體);之后去離子水溶解無菌過濾制成100 μg/mL的紅景天培養(yǎng)母液,再用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋為紅景天培養(yǎng)液。

儀器與試劑CCK-8試劑盒(日本同仁公司);ADM抗體 、CRLR抗體、HIF-1α抗體和β-actin抗體(美國 R&D SYSTEMS公司);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒FSQ-101、熒光定量PCR檢測試劑盒QPK-212 (日本TOYOBO公司);HIF-1αsi RNA、陽性對照si RNA、陰性對照si RNA及熒光標(biāo)記siRNA(上海吉瑪公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱、無氧培養(yǎng)箱(美國THERMO公司)、酶標(biāo)儀ELX-800(臺灣METERTECH公司)、PCR基因擴(kuò)增儀5341ep(德國Eppendorf公司)、實(shí)時熒光定量PCR儀7500 (美國ABI公司)。

分組及干預(yù)將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為正常氧對照組(NOR)、低氧對照組(HYPO)和低氧紅景天組(HYPO+RHO) 3組。2個對照組使用的對照培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,低氧紅景天組使用紅景天干粉配制的紅景天培養(yǎng)液;低氧條件為1% O2、5% CO2、94% N2的低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每組又根據(jù)轉(zhuǎn)染條件不同分為空白對照CON(不加siRNA)組、陰性對照NEG(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)組、HIF-1α siRNA(轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA)組。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次或3個復(fù)孔。

CCK8法觀察不同作用時間(24～72 h)和藥物濃度(1～100 μg/mL)下紅景天促細(xì)胞增殖情況。酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(D)值,無紅景天干預(yù)孔為對照組,無細(xì)胞僅含檢測液孔為空白組,相對細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)×100%。

Westernblot法干預(yù)處理后的細(xì)胞提取總蛋白,樣品蛋白通過BCA法于分光光度計(jì)檢測其濃度。每樣品孔上樣50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析,半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5% BSA溶液中室溫封閉1 h,分別加入相關(guān)一級抗體4 ℃過夜,TBS/T洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,TBS/T洗膜3次,加入顯色液X線膠片曝光,圖片掃描保存為電腦文件,用Image J 分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化,以β-actin為內(nèi)參,對各組ADM、CRLR、HIF-1α蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)分析。

Real-timePCR法Trizol法提取總RNA,凝膠管電泳系統(tǒng)檢測RNA的完整性,28S∶18S約為2∶1,條帶明顯。分光光度計(jì)測量RNA純度,D260/D280為2.0～2.1。取0.9 μg總RNA在20 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GeneBank提供的基因序列使用ABI Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物(由上?；巧锛夹g(shù)公司設(shè)計(jì),上海生工生物工程有限公司合成)。引物序列詳見表1。取2.0 μL逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行實(shí)時PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 60 s,1個循環(huán),然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s。

表1 實(shí)時定量PCR引物序列Tab 1 Sequences of PCR primers at real-time quantification

小RNA干擾技術(shù)在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)里尋找HIF-1α的mRNA 序列全長,應(yīng)用Silencer TM軟件設(shè)計(jì)3對用于沉默HIF-1α基因的siRNA(上海吉瑪公司化學(xué)合成),使用熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)檢測轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)化細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件,最后確定目標(biāo)siRNA序列在siRNA、RNAi-Mate比例為3∶1,濃度為60 nmol/L時抑制作用最強(qiáng),HIF-1αsiRNA目標(biāo)序列及對照siRNA序列見表2。HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后進(jìn)行相關(guān)干預(yù),干預(yù)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白和基因檢測。

表2 siRNA序列Tab 2 Sequences of siRNA

結(jié) 果

紅景天促進(jìn)低氧狀態(tài)下HUVECs增殖我們之前的研究發(fā)現(xiàn)紅景天具有一定的促細(xì)胞增殖作用,這一作用主要在低氧狀態(tài)下存在,正常氧狀態(tài)實(shí)驗(yàn)條件下未觀察到類似的增殖作用。為了進(jìn)一步分析紅景天對低氧狀態(tài)下HUVECs增殖的影響,用不同濃度紅景天不同時間處理HUVECs后,CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況。以各時段的無藥物干預(yù)組為對照組,所得相對細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn),低氧狀態(tài)下一定劑量范圍內(nèi)紅景天有劑量依賴性促內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用,這一作用在紅景天干預(yù)24 h、紅景天濃度10 μg/mL時最為顯著(表3),并作為最佳干預(yù)條件用于實(shí)驗(yàn)研究。

紅景天促進(jìn)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞ADM及其受體CRLR的表達(dá)為分析紅景天低氧狀態(tài)下促細(xì)胞增生作用中對內(nèi)皮細(xì)胞ADM途徑的影響情況,以10 μg/mL紅景天處理HUVECs 24 h后,實(shí)時定量PCR及Western blot分別測定ADM及其受體CRLR mRNA及蛋白表達(dá)的情況。低氧狀態(tài)下HUVECs經(jīng)紅景天處理24 h后,ADM及CRLR的mRNA水平明顯增加(圖1B);與低氧對照組相比,ADM及CRLR的蛋白水平也同樣上調(diào)(圖1A),提示紅景天可以上調(diào)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞ADM及CRLR的基因表達(dá)。

Concentration of Rhodiola rosea24 h48 h72 hNOR 0 μg/mL2.63±0.843.45±0.344.24±0.12HYPO 0 μg/mL1.54±0.272.17±0.332.53±0.05 1 μg/mL2.13±0.17(1)2.52±0.012.77±0.07 5 μg/mL2.53±0.11(1)2.90±0.15(3)2.98±0.15HYPO+RHO 10 μg/mL2.79±0.10(1) (2)2.92±0.75(3)3.35±0.28 50 μg/mL1.24±0.032.59±0.232.79±0.15 100 μg/mL0.77±0.31(1)2.05±0.212.22±0.11

(1)vs. hypoxia control group for 24 h,P<0.05;(2)vs.other RHO groups for 24 h,P<0.05;(3)vs.hypoxia control group for 48 h,P<0.05.

A:Protein expression of ADM&CRLR;B:Relative mRNA expression of ADM & CRLR.vs.hypoxia control group,(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖1紅景天對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ADM及CRLR基因表達(dá)的影響
Fig1TheinfluenceofRhodiolaroseaonADMandCRLRgeneexpressioninHUVECs

紅景天促進(jìn)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)為分析紅景天低氧狀態(tài)下促細(xì)胞增殖作用中對內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響,同樣條件下紅景天干預(yù)后測定HIF-1α mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)的情況。與低氧對照組比較,紅景天干預(yù)后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α mRNA(圖2B)和蛋白質(zhì)水平(圖2A)均明顯增加,證實(shí)紅景天可以上調(diào)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α基因的表達(dá)。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

圖2紅景天對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)的影響
Fig2TheinfluenceofRhodiolaroseaonHIF-1αgeneexpressioninHUVECs

HIF-1α介導(dǎo)紅景天的促ADM/CRLR表達(dá)作用以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明紅景天可以促進(jìn)低氧狀態(tài)下HIF-1α以及ADM及其受體CRLR基因的表達(dá),已知HIF-1α是體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子,ADM及CRLR基因都含有HIF-1的結(jié)合位點(diǎn)。為驗(yàn)證紅景天是否通過HIF-1α介導(dǎo)產(chǎn)生促ADM及CRLR表達(dá)的作用,我們用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染HUVECs培養(yǎng)24 h后,實(shí)時定量PCR檢測HIF-1α的抑制效率為85%。在此基礎(chǔ)上,我們觀察紅景天干預(yù)后ADM及其受體CRLR基因表達(dá)的變化,結(jié)果提示,與空白對照組(CON)及陰性對照siRNA (NEG)對照組比較,轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA各組內(nèi)皮細(xì)胞ADM及其受體CRLR mRNA(圖3)和蛋白(圖4)表達(dá)均受到明顯抑制,紅景天組與單純低氧組ADM及CRLR表達(dá)無明顯差異,HIF-1α siRNA顯著抑制了紅景天對ADM及CRLR表達(dá)的促進(jìn)作用,提示紅景天的促ADM/CRLR表達(dá)作用確實(shí)由HIF-1α介導(dǎo)。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

圖3HIF-1αsiRNA處理后各組細(xì)胞ADM、CRLR、HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量
Fig3TheexpressionofADM,CRLRandHIF-1αmRNAinHUVECsafterHIF-1αknockdown

討 論

冠心病是嚴(yán)重影響人類健康的一類常見病和多發(fā)病,冠心病的治療手段雖然已經(jīng)有了長足的發(fā)展,但還有一部分患者藥物治療效果欠佳又不適宜進(jìn)行介入治療或手術(shù)后發(fā)生再狹窄,治療性血管新生[11-12]可能能夠改善這部分患者的預(yù)后。

紅景天是主要生長于高寒低氧地區(qū)的一種藥用植物,具有抗疲勞、抗缺氧、抗輻射、心血管保護(hù)等多種藥理作用,我們一直在研究其促血管生長、促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抗心肌缺血作用的機(jī)制[6-8,13-14]。我們前期的研究觀察到與同等條件低氧狀態(tài)下比較,正常氧狀態(tài)下紅景天無明顯的促細(xì)胞增殖作用,以往的研究[15]甚至發(fā)現(xiàn)正常氧狀態(tài)下紅景天具有抑制HUVECs生長的作用。本次研究驗(yàn)證了一定范圍內(nèi)低氧狀態(tài)下紅景天有劑量依賴性促細(xì)胞增殖作用,這些研究結(jié)果提示紅景天的促細(xì)胞增殖作用具有一定的低氧特異性,這一過程是否與低氧狀態(tài)下低氧相關(guān)的細(xì)胞因子(HIF1α)對促細(xì)胞增殖相關(guān)因子(ADM/CRLR)的調(diào)節(jié)有關(guān)？我們針對這一問題進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

圖4HIF-1αsiRNA處理后各組細(xì)胞ADM、CRLR、HIF-1α的蛋白質(zhì)表達(dá)
Fig4TheexpressionofADM,CRLRandHIF-1αproteinsinHUVECsafterHIF-1αknockdown

ADM是1993年由Kitamura等[4,16]從人類嗜鉻細(xì)胞瘤組織中提取的一種生物活性肽,屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族成員,ADM通過與CRLR聯(lián)合作用發(fā)揮其多種生理效應(yīng),在缺血性心臟病、缺血再灌注損傷等方面進(jìn)行的多項(xiàng)科學(xué)研究顯示,通過ADM治療誘導(dǎo)血管新生可獲益。我們的研究發(fā)現(xiàn)紅景天可以明顯上調(diào)缺血心肌ADM及其受體CRLR的表達(dá),并且這一作用具有靶向性。ADM在體內(nèi)分布廣泛,其中循環(huán)的ADM主要來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞,我們用紅景天處理低氧狀態(tài)下的HUVECs,發(fā)現(xiàn)ADM及其受體CRLR的mRNA和蛋白表達(dá)都明顯升高,說明紅景天可以上調(diào)ADM和CRLR基因的表達(dá),這一作用是否有其共同上游作用機(jī)制,其機(jī)制是否與低氧誘導(dǎo)因子相關(guān),我們就此進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

HIF-1是調(diào)節(jié)體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子,其中HIF-1α尤為重要,多種HIF-1的目的基因所編碼的蛋白被確認(rèn)在血管新生的過程中起到關(guān)鍵的作用。目前的研究表明ADM及其受體CRLR基因啟動子中都含有HIF-1結(jié)合位點(diǎn)(hypoxia response element,HRE),ADM的促血管新生作用可能主要在HIF-1的作用下通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn),為了驗(yàn)證紅景天在低氧狀態(tài)下促ADM/CRLR分泌作用也是HIF-1α介導(dǎo)的,我們用siRNA技術(shù)敲除HIF-1α基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天上調(diào)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞ADM及CRLR表達(dá)的作用被明顯抑制,證實(shí)低氧狀態(tài)下紅景天對腎上腺髓質(zhì)素系統(tǒng)的上調(diào)作用是HIF-1α依賴的。這一結(jié)果提示HIF-1可能是紅景天抗缺血缺氧促血管新生作用的核心靶點(diǎn),其作用表現(xiàn)為上調(diào)HIF-1α基因的表達(dá),進(jìn)而與包括ADM、CRLR、VEGF等多種促血管新生因子/受體基因啟動子的HRE結(jié)合,上調(diào)ADM、CRLR、VEGF等基因的表達(dá),最終產(chǎn)生抗缺氧促血管新生的作用。

我們的研究證實(shí)低氧狀態(tài)下紅景天通過上調(diào)HIF-1α促進(jìn)HUVECs ADM及其受體CRLR的表達(dá),提示HIF-1可能是紅景天抗缺血缺氧促血管新生作用的核心靶點(diǎn)。HIF是否是低氧狀態(tài)下紅景天作用的唯一靶點(diǎn),阻斷HIF-1α是否紅景天的促細(xì)胞增殖作用完全消失,正常氧狀態(tài)下紅景天無明顯促細(xì)胞增殖作用,正常氧狀態(tài)下紅景天對HIF-1α、ADM、CRLR等細(xì)胞因子是否不產(chǎn)生影響,這些問題需在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)與證實(shí)。