讓病毒成為蛋白質(zhì)分子的“展柜”
——2018年諾貝爾化學(xué)獎簡介之噬菌體展示技術(shù)*

葛逸盟 張玉瑩 林怡婷 姚義凡 王雪珩 王月丹

（北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 北京 100191）

2018年10月30日， 瑞典皇家科學(xué)院宣布，將2018年諾貝爾化學(xué)獎的一半獎金授予美國科學(xué)家喬治·史密斯（G. Smith）及英國科學(xué)家格雷戈里·溫特爾爵士（Sir G. Winter），以表彰他們在發(fā)明及應(yīng)用噬菌體（phage）展示技術(shù)中作出的貢獻(xiàn)［1］。什么是噬菌體展示技術(shù)？這個技術(shù)對人類的重要性究竟有多大？

1 噬菌體與噬菌體展示技術(shù)的發(fā)明

從字面含義上看，噬菌體是指能“吃掉”細(xì)菌的病毒，即一類能感染細(xì)菌、真菌、放線菌及螺旋體等微生物的病毒的總稱［2］。噬菌體的體積很小，形態(tài)因種類不同而存在差異，一般多為蝌蚪形，也可呈微小的球形或細(xì)長桿狀。 大多數(shù)噬菌體為有尾巴的二十面體結(jié)構(gòu)（圖1），也有部分噬菌體沒有尾部結(jié)構(gòu)。 其中，衣殼蛋白規(guī)律排列組成了噬菌體二十面體的頭部， 其中含有遺傳物質(zhì)——核酸。 而絲狀噬菌體外形呈線狀，沒有明顯的頭部結(jié)構(gòu)，其衣殼蛋白顆粒組成的盤旋狀結(jié)構(gòu)形成了外殼，包裹著噬菌體的核酸。

圖1 噬菌體的模式圖

目前， 根據(jù)基于病毒基因測序的噬菌體蛋白組樹（phage proteomic tree，PPT）分類法，可將噬菌體分為光滑噬菌體、囊狀噬菌體、絲狀噬菌體、微小噬菌體、短尾噬菌體、長尾噬菌體、肌尾噬菌體和Fuselloviridi 等8 種［3］（表1）。 1915年英國微生物學(xué)家托特（Federick William Twort）首先在金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)中， 觀察到了噬菌體殺死細(xì)菌的現(xiàn)象［2］。作為細(xì)菌的天敵，噬菌體很快就被用于對抗細(xì)菌感染的治療中。 1919年，人們采用噬菌體療法在法國治療兒童痢疾取得了成功［4］。 后來人們又相繼發(fā)現(xiàn)，噬菌體可感染霍亂弧菌和炭疽芽孢菌等多種病原細(xì)菌， 并可將這些宿主病原菌裂解，成為治療這些病原菌感染相關(guān)疾病的特效藥物，成為抗感染治療的有效方法之一。隨著抗生素的發(fā)明和使用，利用噬菌體進(jìn)行治療細(xì)菌感染的方法一度陷入低谷。但進(jìn)入21 世紀(jì)以來，因?yàn)榧?xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥的問題越來越嚴(yán)重，噬菌體治療再次進(jìn)入了人們的視野，并在耐藥細(xì)菌和條件性致病細(xì)菌感染的治療中取得了初步的勝利［5］。

這次噬菌體成為諾貝爾化學(xué)獎的關(guān)鍵詞，卻不是因?yàn)槠淇咕淖饔茫?而是因?yàn)橛腥藢⑵渥兂闪四軌蛘故就庠葱曰蚱尉幋a蛋白及其功能的“展柜”。 1985年，喬治·史密斯首先在Science雜志上發(fā)表了題為《絲狀融合噬菌體：可以在病毒表面表達(dá)克隆抗原的新表達(dá)載體》的文章（圖2）。 這標(biāo)志著一種可用于大規(guī)模高通量蛋白質(zhì)之間相互作用研究（特別進(jìn)行抗原表位和特異性抗體的篩選與鑒定）的新型表達(dá)載體系統(tǒng)誕生了［6］。在此基礎(chǔ)上，以格雷戈里·溫特爵士為代表的科學(xué)家將其應(yīng)用于抗體的人源化改造等生物學(xué)領(lǐng)域的研發(fā)中， 極大推進(jìn)了疫苗和基因工程化抗體等新型生物制品研發(fā)的進(jìn)展， 使抗體技術(shù)在繼雜交瘤技術(shù)和嵌合抗體技術(shù)之后， 進(jìn)入了第3 次技術(shù)革命階段， 越來越多的抗體藥物逐漸進(jìn)入了臨床治療應(yīng)用的選擇范圍中［7］。 這也是溫特爾爵士能成為本次諾貝爾化學(xué)獎分享者的充分理由。

圖2 喬治·史密斯1985年在Science 雜志上發(fā)表的第1 篇噬菌體展示技術(shù)論文的雜志封面及目錄

2 噬菌體展示技術(shù)的原理及常用系統(tǒng)類型

為什么小小的噬菌體能成為展示各種外源性蛋白片段， 以及成為篩選抗原表位和特異性抗體的好工具？ 原來，人們可通過基因工程技術(shù)，將噬菌體中編碼衣殼蛋白信號肽的基因和衣殼蛋白多肽的基因切開， 將編碼外源性多肽或蛋白質(zhì)的基因片段插入到二者之間， 從而使外源性的多肽或蛋白質(zhì)序列與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白分子，在信號的引導(dǎo)下，表達(dá)于噬菌體的表面。 此過程稱為“展示”（圖3）。由于噬菌體體積微小，表達(dá)在其表面被展示出來的外源性多肽或蛋白質(zhì)可保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性， 從而可通過適當(dāng)?shù)奶赃x方法得到與靶分子親和性最強(qiáng)的可結(jié)合序列，并用于各種篩選、鑒定及生物學(xué)功能的研究與實(shí)踐中。

圖3 噬菌體展示系統(tǒng)的模式圖

一般制備表達(dá)特異性蛋白質(zhì)或多肽的噬菌體并進(jìn)行篩選的方法分為以下幾步：

①制備大量噬菌體克隆的展示文庫， 每個噬菌體表面展示一種特定的蛋白質(zhì)或多肽。

②以展示文庫為流動相， 以目的多肽或蛋白質(zhì)分子作為固定相， 使兩相相互接觸并發(fā)生相互作用。

③用緩沖液洗去不能與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體，保留可以與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體。

④將收集到的噬菌體用于侵染大腸桿菌進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增， 產(chǎn)生一個富集池作為新一輪淘洗的展示文庫。

基于類似的展示原理， 科學(xué)家曾嘗試使用細(xì)菌（以大腸桿菌為例）［8］、酵母［9］或直接編碼質(zhì)粒DNA（肽鍵質(zhì)粒文庫）［10］作為蛋白質(zhì)或多肽分子的表達(dá)載體。 但由于這些系統(tǒng)仍然有賴于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)換，它們并沒有成功地構(gòu)造出大量、多樣性的表達(dá) 文庫［11］。

噬菌體展示技術(shù)模擬了自然選擇過程， 能快速、 有效且經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)對靶分子特異性受體篩選的高通量選擇，并首次實(shí)現(xiàn)了將基因型與表型，以及分子結(jié)合活性與抗原可擴(kuò)增性的結(jié)合。 在隨后20 世紀(jì)90年代新型治療學(xué)的研發(fā)中發(fā)揮了重要作用。 基因型-表型連鎖還可通過對噬菌體基因組中特定插入物的DNA 測序，快速確定特定結(jié)合肽或蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列［11］。

迄今為止， 人們已開發(fā)了絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、T4 噬菌體展示系統(tǒng)， 以及λ 噬菌體展示系統(tǒng)等多種不同的噬菌體展示系統(tǒng)。

絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是最早被發(fā)明和應(yīng)用的噬菌體展示體系。絲狀噬菌體的基因編碼pⅧ、pⅢ、pⅥ、pⅦ和pⅨ等5 個衣殼蛋白， 其中pⅧ和pⅢ是最常用的展示蛋白（圖3）。 絲狀噬菌體載體較為穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化效率較低。如果展示的蛋白片段過大， 則會進(jìn)一步降低pⅢ蛋白與大腸桿菌的性纖毛之間的相互作用， 使其感染宿主大腸桿菌的能力進(jìn)一步下降， 需要通過應(yīng)用輔助噬菌體等方法進(jìn)行改善［12］。

T4 噬菌體展示系統(tǒng)是一種比較常用的展示系統(tǒng)。在進(jìn)行展示的時候，人們一般將外源性蛋白片段與T4 生命非必需衣殼蛋白SOC 和HOC 融合，這2 個蛋白分布于噬菌體的正二十面體表面，具有很多拷貝， 且不影響T4 噬菌體的衣殼組裝，是良好的展示蛋白結(jié)構(gòu)。 同時，T4 噬菌體基因組為線性雙鏈DNA，在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝成為病毒顆粒。在此過程中，展示蛋白不需要通過質(zhì)膜和細(xì)胞分泌過程，因此，可廣泛應(yīng)用于包括不能被大腸桿菌分泌的復(fù)雜蛋白在內(nèi)的各種多肽和蛋白質(zhì)的展示研究。

λ 噬菌體具有兩端不閉合的線形雙鏈DNA組成的基因組， 外源性多肽或蛋白質(zhì)主要基于其頭部的D 蛋白和尾部的V 蛋白進(jìn)行展示，這2 個蛋白在噬菌體上的拷貝數(shù)分別為405～420 和192個，能對外源性多肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行多拷貝的表達(dá)。λ 噬菌體不僅在宿主細(xì)胞內(nèi)完成組裝， 無需分泌過程，且該系統(tǒng)還能展示100 kD 以上的活性蛋白大分子及對宿主細(xì)胞具有毒性蛋白質(zhì)。同時，憑借D 蛋白的分子伴侶作用，λ 噬菌體系統(tǒng)還能在大腸桿菌等原核細(xì)胞中， 高水平表達(dá)和展示多種具有生物學(xué)活性的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)。

3 噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用與展望

噬菌體展示技術(shù)自誕生以來， 被廣泛應(yīng)用于各個生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究與開發(fā)之中。其中，抗體藥物的研發(fā)是噬菌體展示技術(shù)最為令人矚目的成就。 2002年，通過噬菌體展示技術(shù)，人們成功開發(fā)了完全人源化的抗腫瘤壞死因子單克隆抗體——阿達(dá)木單抗（Adalimumab，商品名為修美樂），用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等自身免疫性疾病的治療［13］。 目前，該藥已在全球96 個國家上市銷售，覆蓋的適用病種達(dá)到了14 個，其2017年的銷售額更是高達(dá)180 多億美元， 是目前世界上最為暢銷的藥物。

此外，因具有簡便、有效和易于控制等優(yōu)勢，噬菌體展示技術(shù)還在各種病原體（包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲）感染機(jī)制的研究、新疫苗的研發(fā)、腫瘤免疫過程的探索、 自身免疫性疾病的診斷與治療等應(yīng)用領(lǐng)域，以及蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)研究中， 發(fā)揮了極為重要的應(yīng)用與研究價(jià)值， 是解決這些生物醫(yī)學(xué)問題必不可少的科學(xué)工具。

目前，噬菌體展示技術(shù)還存在著庫容有限、長片段表達(dá)易發(fā)生結(jié)構(gòu)的隨機(jī)折疊而影響生物活性， 以及宿主菌對氨基酸修飾的障礙等問題［14］。因此，人們在該技術(shù)的基礎(chǔ)上，又進(jìn)一步開發(fā)出了核糖體展示技術(shù)［15］和酵母蛋白展示系統(tǒng)［16］等有針對性的解決方案。 隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步， 該系統(tǒng)自身也將會得到不斷的改進(jìn)與完善，最終為維護(hù)人類的生命健康，提供源源不斷的新思路與新發(fā)現(xiàn)。