硫辛酸麥角甾醇酯的制備及抗氧化作用

唐小卉 紀蘇萍 夏 雪 賈承勝

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

麥角甾醇是一種在麥角和真菌中發(fā)現(xiàn)的純天然類固醇，存在于大部分真菌中[1]。麥角甾醇是維生素D2的前體，在光解和熱重排后可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D2[2]。研究表明，麥角甾醇具有多種生理功能，如抗高血脂[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]等。Hu等[3]發(fā)現(xiàn)榆黃菇的乙酸乙酯提取物和甲醇提取物在大鼠體內(nèi)具有顯著的抗高脂血癥作用，而麥角甾醇是其主要成分之一。Schneider等[6]發(fā)現(xiàn)平菇能有效調(diào)節(jié)人體血液參數(shù)(甘油三酯、總膽固醇、氧化低密度脂蛋白)，可能是由于亞油酸、麥角甾醇和麥角甾醇衍生物的存在。此外，麥角甾醇及其衍生物能夠抑制黑素生成和表皮細胞增殖[7]。但在實際使用過程中，麥角甾醇的油溶解性差，應(yīng)用范圍有限。據(jù)報道[8]，通過與脂溶性成分(如脂肪酸)酯化，甾醇的親脂性能夠得到改善。

硫辛酸是一種非常重要的維生素B族化合物，主要存在于動物肝臟以及番茄和胡蘿卜等植物中。在體內(nèi)，硫辛酸可以被還原為有2個巰基的二氫硫辛酸，二者在脂溶性和水溶性環(huán)境中均能發(fā)揮抗氧化性，可以毫無障礙地在身體內(nèi)游走，到達每一個細胞，被認為是天然的萬能抗氧化劑。硫辛酸因強抗氧化性在國內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域早已得到廣泛使用，用于預(yù)防由身體中的自由基引起的衰老和一些其他疾病，如糖尿病、癌癥、心血管疾病和炎癥[9-11]。

國內(nèi)外對于麥角甾醇的改性研究已有報道。Chaibakhsh等[7]采用酶法合成了油酸麥角甾醇酯；He等[12]在無溶劑體系中通過直接酯化法合成了月桂酸麥角甾醇酯；Lin等[13]合成了糠酸麥角甾醇酯、水楊酸麥角甾醇酯和2-萘甲酸麥角甾醇酯。但對麥角甾醇進行酯化改性增效以提高其抗氧化性未見有報道。本研究擬以麥角甾醇和硫辛酸為原料，通過化學法在常溫條件下合成硫辛酸麥角甾醇酯，并考察硫辛酸麥角甾醇酯對食用油氧化穩(wěn)定性的影響，旨在開拓麥角甾醇及其衍生物在食品、生物醫(yī)藥和化妝品中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

麥角甾醇：純度>95%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

硫辛酸：純度>95%，西安常恒醫(yī)藥有限公司；

甾醇阿魏酸酯：純度>95%，實驗室自制；

4-二甲胺基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)：分析純，中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

碘化鉀：分析純，無錫市展望化工試劑有限公司；

金龍魚菜籽油、金龍魚大豆油：上海益海嘉里食品工業(yè)有限公司；

薄層色譜硅膠板：5 cm×10 cm，青島海洋化工廠；

柱層析硅膠：200～300目，青島海洋化工廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-D (III)型，科瑞儀器有限責任公司；

智能自動磁力恒溫加熱攪拌器：DF-101S型，科瑞儀器有限責任公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：Nicolet iS10型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

超聲波清洗儀：SK5210HP型，上?？茘u超聲儀器有限公司；

恒溫數(shù)顯水浴鍋：HH-S2型，常州市拓興實驗儀器廠；

高效液相色譜儀：Waters 1525型，沃特世科技(上海)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R210型，瑞士步琦有限公司；

層析柱：100 cm×Φ2.5 cm型，上海市達豐有限公司；

可見光分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限責任公司；

磁力攪拌器：IKA c-MAG HS-7型，德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 硫辛酸麥角甾醇酯的制備 稱取一定量的硫辛酸和麥角甾醇于三角燒瓶中，向其中加入適量的二氯甲烷，再加入適量的催化劑，于室溫25 ℃下反應(yīng)20 h。待反應(yīng)結(jié)束之后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干去除溶劑，所得反應(yīng)物經(jīng)柱層析(硅膠200～300目)分離后，得到純化的硫辛酸麥角甾醇酯。將制得的產(chǎn)物真空干燥后進行結(jié)構(gòu)鑒定，確定其結(jié)構(gòu)并證實產(chǎn)物為硫辛酸麥角甾醇酯。

1.2.2 硫辛酸麥角甾醇酯的反應(yīng)條件優(yōu)化 主要選取影響麥角甾醇酯化的5個因素：催化劑種類(DMAP/EDC/Et3N、DMAP/DCC、十二烷基硫酸、無水硫酸氫鈉、對甲基苯磺酸、十二烷基苯磺酸)、麥角甾醇濃度(50，60，70，80，90，100 mmol/L)、催化劑濃度(DMAP濃度：8，16，24，32，40 mmol/L；EDC濃度：80，88，96，104，112 mmol/L；Et3N濃度：96，104，112，120，128 mmol/L)、硫辛酸與麥角甾醇的摩爾比(1.5，2.0，2.5，3.0，3.5)和反應(yīng)時間(18，19，20，21，22 h)。固定參數(shù)：反應(yīng)溫度25 ℃、溶劑二氯甲烷、復(fù)合催化劑種類DMAP/EDC/Et3N、麥角甾醇濃度80 mmol/L、麥角甾醇與DMAP/EDC/Et3N摩爾比1.0∶0.2∶1.2∶1.5、硫辛酸與麥角甾醇的摩爾比1.5、反應(yīng)時間18 h，分別改變其中一因素，進行單因素試驗，研究其對硫辛酸麥角甾醇酯化率的影響，得出最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.2.3 酯化率的測定

(1) 繪制標準曲線：將酯化反應(yīng)所得的純硫辛酸麥角甾醇酯配制成0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mg/mL的石油醚/正己烷(體積比1∶1)溶液，通過高效液相色譜法(HPLC)測定各濃度的硫辛酸麥角甾醇酯的峰面積，將峰面積對數(shù)值和濃度對數(shù)值進行線性擬合，得標準曲線、線性擬合常數(shù)和方程式。將反應(yīng)液進樣之后，將產(chǎn)品峰面積代入標準曲線方程式(1)計算反應(yīng)液中產(chǎn)品的濃度。

lgA=1.558×lgC+6.91(R2>0.99)，

(1)

式中：

A——相應(yīng)的組分峰面積；

C——組分的濃度，mg/mL。

(2) 酯化率的測定：酯化率是酯化反應(yīng)實際生成的產(chǎn)物量和理論上應(yīng)生成產(chǎn)物量的百分比，按式(2)計算。

(2)

式中：

c1——硫辛酸麥角甾醇酯的濃度，mol/L；

c2——反應(yīng)開始麥角甾醇的濃度，mol/L；

K——硫辛酸麥角甾醇酯的酯化率，%。

1.2.4 產(chǎn)物的HPLC分析 分析方法：使用C18色譜柱，流動相是體積分數(shù)0.1%的甲酸-甲醇溶液(色譜純)，樣品溶于甲醇和正己烷的混合溶液(體積比8∶1)，流動相的流速為1.0 mL/min，色譜柱溫度為30 ℃，進樣量為10 μL，柱壓為0.5 MPa。蒸發(fā)光檢測器的檢測條件：載氣為N2，流速為1.5 L/min，溫度為55 ℃，噴霧級別為75%，增益為1。

1.2.5 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 采用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析法，具體方法為：采用KBr壓片法制片，掃描范圍600～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。

1.2.6 產(chǎn)物的溶解性和抗氧化作用的研究

(1) 油溶性的測定：精確稱取200 mg的硫辛酸、麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯和硫辛酸麥角甾醇酯于三角燒瓶中，30 ℃油浴并攪拌，每30 min加入1 mL大豆油，觀察其溶解狀態(tài)。至未溶解的懸浮顆粒開始減少時，每30 min加入大豆油的量改為0.5 mL。待未溶解的懸浮顆粒明顯減少時，加入大豆油的速度改為0.1 mL/30 min，直至懸浮顆粒完全溶解。記錄完全溶解200 mg樣品所用大豆油的量。各物質(zhì)30 ℃時的油溶性可通過加入大豆油的量來計算，單位為g/L。

(2) 過氧化值的測定：按GB 5009.227—2016的滴定法。根據(jù)食品添加劑使用標準(GB 2760—2014)，按0.2 g/kg 分別將硫辛酸、麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯、硫辛酸麥角甾醇酯添加到適量的菜籽油中，將無添加的菜籽油作為空白對照組。當過氧化值超過0.25 g/100 g時，停止測定，計算結(jié)果處理數(shù)據(jù)。

測定不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯過氧化值：分別按照0.1，0.2，0.3，0.4 g/kg將硫辛酸麥角甾醇酯添加到適量的菜籽油中，使用上述方法測定其過氧化值。按式(3)計算過氧化值。

(3)

式中：

X1——過氧化值，g/100 g；

V——試樣消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積，mL；

V0——空白試驗消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積，mL；

c——硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；

0.126 9——與1.00 mL硫代硫酸鈉標準溶液[c(Na2S2O3)=1.000 mol/L]相當?shù)牡獾馁|(zhì)量；

m——試樣質(zhì)量，g；

100——換算系數(shù)。

(3) DPPH·清除活性的測定：分別測定麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯和硫辛酸麥角甾醇酯的DPPH·清除率。具體方法：將待測樣品分別配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L的甲醇/正己烷(體積比8∶1)溶液，然后將1 mL的待測樣品溶液和5 mL的0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液分別加入同一試管中，搖勻，蓋上塞子，于25 ℃避光反應(yīng)15 mim，于517 nm 波長下測定樣品的吸光值；同時取1 mL待測樣品溶液與5 mL無水乙醇的混合溶液，于517 nm波長下測定其吸光值；取1 mL甲醇/正己烷溶液與5 mL 0.1 mmol/L DPPH·的乙醇溶液混勻后測定吸光值。按式(4)計算DPPH·清除率。

(4)

式中：

C——DPPH·清除率，%；

Ai——待測樣品溶液反應(yīng)后的吸光值；

Aj——待測樣品溶液與無水乙醇混合溶液的吸光值；

Ac——甲醇/正己烷溶液與DPPH·的乙醇溶液混合溶液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物分析和結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 高效液相色譜分析 如圖1所示，反應(yīng)液的組分被分離且分離效果較好，硫辛酸、麥角甾醇、硫辛酸麥角甾醇酯的保留時間分別為1.63，3.33，6.08 min。經(jīng)分離純化后的產(chǎn)物純度為94%。

圖1 酯化反應(yīng)混合物HPLC圖Figure 1 HPLC chromatograms of esterification reaction mixture

2.1.2 傅里葉變換紅外線光譜分析 紅外光譜主要用來檢測分子的振動類型并確定分子內(nèi)所含基團及化學鍵的類型。對比文獻[12]中的麥角甾醇FTIR圖，由圖2可知，在1 732 cm-1處出現(xiàn)C═O伸縮震動峰，1 173 cm-1處出現(xiàn)C—O—C伸縮震動峰，確定有酯鍵生成，由此可判斷有硫辛酸麥角甾醇酯生成。

圖2 硫辛酸麥角甾醇酯的傅立葉變換紅外光譜圖Figure 2 FT-IR spectra of ergosteryl lipoate

2.2 酯化條件優(yōu)化

2.2.1 催化劑種類的影響 由圖3可知，在所選的6種催化劑中，只有DMAP/EDC/Et3N和DMAP/DCC具有較高的催化活性，酯化率分別達到了32.1%和27.9%，而其它無機催化劑酯化率均小于1%。雖然在此反應(yīng)中DMAP/EDC/Et3N的催化效率與DMAP/DCC相差不大，但DCC吸水后生成的DCU固體顆粒抽濾時不易去除，且溶解性差，增加了后期分離純化的難度。相比之下，EDC轉(zhuǎn)化成的EDU在有機溶劑和水中溶解性都非常好，柱層析時可溶于洗脫劑中，經(jīng)柱層析分離后便可完全除去。因此，選擇DMAP/EDC/Et3N作為催化劑。

2.2.2 麥角甾醇濃度的影響 由圖4可知，麥角甾醇濃度低于80 mmol/L時，酯化率隨麥角甾醇濃度的增加而顯著增大；高于80 mmol/L時，酯化率隨麥角甾醇濃度的增加而略有減小?？赡苁躯溄晴薮紳舛鹊陀?0 mmol/L時，其濃度增加，反應(yīng)物與催化劑間碰撞幾率增大，促進反應(yīng)的進行；而高于80 mmol/L時，反應(yīng)物濃度的增加使得體系黏度增大，反應(yīng)物與催化劑間碰撞幾率減小，導(dǎo)致酯化率降低。因此，麥角甾醇的濃度選擇80 mmol/L。

A. DMAP/EDC/Et3N B. DMAP/DCC C. 十二烷基硫酸 D. 無水硫酸氫鈉 E. 對甲基苯磺酸 F. 十二烷基苯磺酸

圖3 催化劑種類對酯化率的影響

圖3 Effect of catalyst type on esterification rate

圖4 麥角甾醇濃度對酯化率的影響Figure 4 Effect of ergosterol concentration on esterification rate

2.2.3 催化劑用量的影響 由圖5～7可知：

(1) 隨著DMAP濃度的增加，酯化率先增后減，DMAP濃度為16 mmol/L時，酯化率最高。原因可能是DMAP的濃度小于16 mmol/L時，麥角甾醇與DMAP的碰撞幾率會隨DMAP濃度的增加而增大，促進反應(yīng)的進行；而大于16 mmol/L時，生成大量的中間產(chǎn)物，影響反應(yīng)的進行，導(dǎo)致酯化率的下降。

圖5 DMAP濃度對酯化率的影響Figure 5 Effect of DMAP concentration on esterification rate

圖6 EDC濃度對酯化率的影響Figure 6 Effect of EDC concentration on esterification rate

圖7 Et3N濃度對酯化率的影響Figure 7 Effect of Et3N concentration on esterification rate

(2) 隨著EDC濃度的增加，酯化率明顯增加，當EDC濃度大于96 mmol/L后，酯化率基本無變化。原因可能是原反應(yīng)溶劑水分去除不徹底，中間產(chǎn)物也可能產(chǎn)生一部分水，需過量的EDC加以去除。

(3) 隨著Et3N濃度的增加，酯化率增加，當Et3N濃度大于120 mmol/L后，酯化率不變。

綜上所述，DMAP、EDC、Et3N的最佳用量分別為16，96，120 mmol/L，即麥角甾醇與DMAP/EDC/Et3N的最佳用量摩爾比為1.0∶0.2∶1.2∶1.5。

2.2.4 酸醇摩爾比的影響 由圖8可知，當硫辛酸與麥角甾醇的摩爾比為2∶1時，反應(yīng)酯化率達到最大，可能是在適當?shù)臐舛认?，酸醇摩爾比的增加可以?種反應(yīng)物分子的碰撞幾率增加，有利于反應(yīng)平衡的正向移動；但當硫辛酸的濃度過高時，反應(yīng)體系黏度增加，降低了反應(yīng)物之間、反應(yīng)物與催化劑之間的接觸效率，導(dǎo)致酯化率的降低。因此，酸醇摩爾比選擇2∶1。

2.2.5 反應(yīng)時間的影響 由圖9可知，隨著反應(yīng)時間的延長，硫辛酸麥角甾醇酯的酯化率先增后不變，可能是反應(yīng)時間低于20 h時，溶液中的麥角甾醇并未被完全消耗；而反應(yīng)進行到20 h左右時，麥角甾醇完全轉(zhuǎn)化為硫辛酸麥角甾醇酯或中間產(chǎn)物，酯化率趨于穩(wěn)定。因此，反應(yīng)時間選擇20 h。

根據(jù)以上優(yōu)化結(jié)果，得到酯化最優(yōu)工藝條件為：以DMAP/EDC/Et3N為催化劑，麥角甾醇濃度80 mmol/L，硫辛酸∶麥角甾醇∶DMAP∶EDC∶Et3N摩爾比2∶1∶0.2∶1.2∶1.5，溶劑二氯甲烷，反應(yīng)溫度25 ℃，反應(yīng)時間20 h。采用以上條件進行酯化反應(yīng)，分別經(jīng)3次平行試驗得到硫辛酸麥角甾醇酯的平均酯化率為91.3%。

圖8 酸醇摩爾比對酯化率的影響Figure 8 Effect of molar ratio of reactants on esterification rate

圖9 反應(yīng)時間對酯化率的影響Figure 9 Effect of reaction time on esterification rate

2.3 產(chǎn)物性質(zhì)的研究

2.3.1 油溶性 研究了在30 ℃時，麥角甾醇和硫辛酸麥角甾醇酯在大豆油中的溶解度。由于阿魏酸、硫辛酸同為強抗氧化劑，甾醇阿魏酸酯具有良好的油溶性和抗氧化性，且國內(nèi)外對甾醇阿魏酸酯的研究較多，因此本試驗選取甾醇阿魏酸酯作為參照物。由表1可知，進行酯化反應(yīng)后，產(chǎn)物硫辛酸麥角甾醇酯的油溶性相較于麥角甾醇提升明顯，與甾醇阿魏酸酯相當，可能是與硫辛酸發(fā)生酯化反應(yīng)，引入了親脂基團，在很大程度上改善了麥角甾醇的油溶解性，擴大了其應(yīng)用范圍。這與以前報道[14]的植物甾醇脂肪酸酯的試驗結(jié)果一致。

表1 反應(yīng)物、產(chǎn)物與甾醇阿魏酸酯在大豆油中的溶解度

2.3.2 抗氧化性

(1) 添加不同物質(zhì)的菜籽油過氧化值測定：本研究考察了硫辛酸、麥角甾醇、硫辛酸麥角甾醇酯、甾醇阿魏酸酯的添加對菜籽油氧化過程的影響，選取甾醇阿魏酸酯作為參照物。由圖10可知，菜籽油的過氧化值與時間基本呈線性相關(guān)；試驗所用添加物可明顯延緩菜籽油的氧化過程，經(jīng)過酯化改性的麥角甾醇抗氧化功能明顯高于麥角甾醇，略低于硫辛酸，略高于甾醇阿魏酸酯。硫辛酸具有強抗氧化性，且其抗氧化性高于麥角甾醇，因此硫辛酸麥角甾醇酯的抗氧化性應(yīng)高于麥角甾醇但低于游離硫辛酸本身。

(2) 添加不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯的菜籽油過氧化值測定：由圖11可知，隨著添加硫辛酸麥角甾醇酯濃度的增大，菜籽油過氧化值有明顯降低，且添加量在0.3 g/kg左右時，提升較為明顯，這可為其在食用油中的添加提供一定參考。

圖10 添加不同抗氧化劑的菜籽油的過氧化值Figure 10 The peroxide value of rapeseed oil with different antioxidants

圖11 添加不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯菜籽油的過氧化值

圖11 The peroxide value of rapeseed oil with different concentration of ergosteryl lipoate

(3) DPPH·清除能力的測定：考察了不同濃度的麥角甾醇和麥角甾醇硫辛酸酯對DPPH·的清除能力，選取甾醇阿魏酸酯作為參照物。由圖12可知，在試驗濃度范圍內(nèi)(0.2～1.0 g/L)，麥角甾醇對DPPH·的清除能力隨濃度變化較小，硫辛酸麥角甾醇酯對DPPH·的清除能力較麥角甾醇有較大提升，且隨著濃度的增加明顯增強，當濃度在1.0 g/L時，其抗氧化能力接近甾醇阿魏酸酯。

圖12 不同濃度的麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯、硫辛酸麥角甾醇酯對DPPH·清除率

圖12 The DPPH radical clearance rates of ergosterol, sterol ferulate and ergosteryl lipoate at different concentrations

3 結(jié)論

通過麥角甾醇與硫辛酸的酯化對麥角甾醇進行了改性，提高了其在食用油中的溶解度和抗氧化性，從而擴大了麥角甾醇在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。產(chǎn)物硫辛酸麥角甾醇酯在菜籽油中的溶解度為19.81 g/L，相較于麥角甾醇的9.76 g/L有了很大改善，表明甾醇酯化后其脂溶性成分能改善甾醇的親脂性。硫辛酸和麥角甾醇均具有一定的抗氧化性，酯化后的產(chǎn)物硫辛酸麥角甾醇酯抗氧化能力優(yōu)于改性前的麥角甾醇，與甾醇阿魏酸酯處在同一水平。通過對添加不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯的菜籽油的過氧化值測定，得到0.3 g/kg為較好的添加量，可明顯提高食用油的抗氧化性，可為其實際應(yīng)用提供一定依據(jù)。目前，對于麥角甾醇改性國內(nèi)外研究較少，這意味著將改性麥角甾醇應(yīng)用于食品工業(yè)還很遙遠，麥角甾醇的改性和品質(zhì)優(yōu)化還有待進一步研究。