響應(yīng)面法優(yōu)化篤斯越橘混合菌發(fā)酵工藝

隋 雙， 王 萍

(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

篤斯越橘(VacciniumuliginosumL.)是我國(guó)重要的野生資源之一，主要分布在內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧等地區(qū)[1]。它是一種果肉細(xì)膩、種子極小的小漿果。果實(shí)不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且含有有機(jī)酸、氨基酸、花色苷等獨(dú)特的功能性成分[2]，具有防治心血管疾病、抗癌、抗衰老等多種功效[3-4]。

篤斯越橘極不耐貯藏，其深加工研究有利于緩解該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。Sang等[5]研究結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程可顯著提高原料本身的抗氧化能力。發(fā)酵引起復(fù)合物底物分解和生物轉(zhuǎn)化成相容的組分，從而調(diào)節(jié)產(chǎn)物性質(zhì)或改變某些生物活性化合物的量[6]。用酵母控制發(fā)酵果汁，可長(zhǎng)期保存其所有生物活性化合物(如抗氧化劑)和功能性物質(zhì)[7]。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生不同的代謝物，如有機(jī)酸、二氧化碳、乙醇、過(guò)氧化氫、二乙酰、細(xì)菌素、胞外多糖、風(fēng)味成分、酶和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8]。植物乳桿菌能夠進(jìn)行乳酸發(fā)酵，特別是在高pH值條件下與酵母共接種[9]。醋酸菌可將乙醇氧化為醋酸，醋酸菌的加入將有效降低酒精發(fā)酵階段所產(chǎn)生的乙醇含量。目前，同時(shí)接種酵母菌、植物乳桿菌和醋酸菌進(jìn)行混合發(fā)酵篤斯越橘的研究鮮有報(bào)道。

本研究選用果酒酵母、植物乳桿菌和醋酸菌3種益生菌混合發(fā)酵篤斯越橘，采用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝，旨在得到一種總酚含量和抗氧化能力較高的篤斯越橘低醇發(fā)酵產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

篤斯越橘，黑龍江省大興安嶺； MRS培養(yǎng)基，自制(用于植物乳桿菌的培養(yǎng))； GY培養(yǎng)基，自制(用于醋酸菌的培養(yǎng))；脫氧核糖、2-硫代巴比妥酸、TPTZ ，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純或生物制劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

葡萄酒·果酒專用酵母(Saccharomycescerevisiae)，安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、巴氏醋酸桿菌滬釀1.01(AcetobacterpasteurianusHN 1.01)，東北林業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 主要儀器

DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；5030-PVL型高壓滅菌鍋，長(zhǎng)春百奧生物儀器有限公司；PB-10型酸度計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；WYT-4型手持糖度計(jì)，泉州中友儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1發(fā)酵基質(zhì)的制備

取m(篤斯越橘)∶m(無(wú)菌水)=1∶6進(jìn)行打漿，加入白砂糖調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)的初始糖度至15°Bx，加入1 mol/L小蘇打水溶液調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)的初始pH值至4.80，經(jīng)巴氏殺菌后備用。

1.4.2菌種比例的確定

設(shè)定酵母菌、植物乳桿菌和醋酸菌的菌種比例為1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶1，分別以6%的接種量接入發(fā)酵基質(zhì)中，發(fā)酵60 h后測(cè)定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚、黃酮、原花青素、花色苷含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.3.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

按菌種比例酵母菌∶植物乳桿菌∶醋酸菌=1∶2∶1以6%的接種量接入發(fā)酵基質(zhì)，跟蹤發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力的變化。

1.4.3.2 接種量的確定

以接種量1.5%、3%、6%、9%、12%接入發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵60 h后測(cè)定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.3.3 發(fā)酵溫度的確定

分別在28、33、38、43 ℃的培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵，發(fā)酵60 h后測(cè)定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.3.4 初始糖度的確定

添加白砂糖將發(fā)酵基質(zhì)初始糖度分別調(diào)至9、12、15、18、21 °Bx，發(fā)酵60 h后測(cè)定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.4測(cè)定方法

1.4.4.1 pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定。

1.4.4.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[10]。取1 mL稀釋后的樣品加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液染色，室溫靜置5 min后，以水代替樣品組作為空白，于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白含量。每組樣品平行測(cè)定3次取平均值。

1.4.4.3 還原糖含量的測(cè)定

采用DNS法測(cè)定[11]。將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取2 mL稀釋后樣品加入DNS顯色液1.5 mL，混勻后放入沸水浴5 min，取出后迅速冷卻至室溫。用蒸餾水定容到25 mL，搖勻。在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。結(jié)果用葡萄糖當(dāng)量表示。每組樣品平行測(cè)定3次取平均值。

1.4.4.4 總酚含量的測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定[12]。100 μL適當(dāng)稀釋后的樣品加入試管中，加水7 mL，搖勻，再加0.5 mL福林試劑，充分搖勻，1 min之后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的Na2CO3溶液1.5 mL，混勻，最后加入0.9 mL蒸餾水，于25 ℃水浴條件下避光反應(yīng) 1 h。在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，結(jié)果用沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。每份樣品平行測(cè)定3次取平均值。

1.4.4.5 黃酮含量的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，略有改動(dòng)。0.5 mL的樣品加入體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇至5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻。6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁0.3 mL，搖勻靜置6 min后加入1.0 mol/L的氫氧化鈉4 mL，反應(yīng)15 min后于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，結(jié)果用蘆丁當(dāng)量值表示。每組樣品平行測(cè)定3次取平均值。

1.4.4.6 原花青素含量的測(cè)定

采用香草醛—硫酸法[14]測(cè)定。精確移取0.5 mL樣品于試管中，依次加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL濃硫酸—甲醇溶液，搖勻，于30 ℃水浴條件下避光反應(yīng)20 min。用甲醇代替樣品作為空白對(duì)照，在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光值，結(jié)果用兒茶素當(dāng)量值表示。每組樣品平行測(cè)定3次取平均值。

1.4.4.7 花色苷含量的測(cè)定

采用pH示差法[15]測(cè)定。分別移取1 mL樣品于試管中，用pH值1.0、4.5的緩沖溶液定容到10 mL，置于暗處反應(yīng)達(dá)平衡后(pH值1.0為50 min，pH值4.5為80 min)分別在510、700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)公式(1)計(jì)算花色苷質(zhì)量濃度。每組樣品平行測(cè)定3次取平均值。

(1)

式(1)中：ρ，mg/L；A，吸光度，A=(A510 nm,pH 1.0-A700 nm,pH 1.0)-(A510 nm,pH 4.5-A700 nm,pH 4.5)；ε，矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；DF，稀釋因子；M，矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量，449.2。

1.4.4.8 ·OH清除率的測(cè)定

采用硫代巴比妥酸法(TBARS)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15]并作適當(dāng)修改。取0.25 mL稀釋10倍的樣品，以0.25 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，向樣品中加入0.5 mL PBS緩沖溶液(pH值7.4，100 mmol/L)、0.2 mL 2-脫氧-D-核糖(28 mmol/L)、0.4 mL Fe3+-EDTA (100 μmol/L FeCl3，104 μmol/L Na2EDTA，體積比1∶1)混勻，再加入0.2 mL H2O2(1 mmol/L)和0.2 mL抗壞血酸溶液(1 mmol/L)，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h。立即加入2 mL 28 g/L的三氯乙酸和2 mL 10 g/L的2-硫代巴比妥酸混勻，沸水浴20 min，然后放入冰水浴中終止反應(yīng)。在室溫下靜置10 min，于532 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各樣品吸光值，并根據(jù)式(2)計(jì)算·OH清除率。

·OH清除率=[1-(A1-A2)/A3] ×100%。

(2)

式(2)中：A1，加測(cè)定溶液后的吸光度；A2，加測(cè)定溶液，不加脫氧核糖溶液反應(yīng)后的吸光值；A3，未加測(cè)定溶液時(shí)的吸光度。

1.4.4.9 總抗氧化能力的測(cè)定

采用鐵離子還原/抗氧化力測(cè)定法(FRAP)[16]。取2.5 mL TPTZ溶液(用40 mmol/L HCl配置成10 mmol/L的TPTZ-HCl溶液)，25 mL醋酸(100 mmol/L，pH值3.6)，2.5 mL FeCl3(20 mmol/L)，充分混勻后配置FRAP工作液。取0.1 mL樣品加入試管中，以100 μL蒸餾水作為空白對(duì)照，向各試管中加入4.9 mL FRAP工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻，在37 ℃水浴反應(yīng)30 min，593 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。

1.5 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以總酚含量和·OH清除率為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析。Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±sd表示，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，以p<0.05或p<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種比例對(duì)不同指標(biāo)的影響

菌種比例的確定結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，第1組的總酚、黃酮、原花青素、花色苷含量均稍高于其他3組。第1組·OH清除率和總抗氧化能力均顯著高于其他3組(p<0.05)。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)發(fā)酵使發(fā)酵液中總酚含量較高，同時(shí)抗氧化能力較強(qiáng)，故綜合考慮選擇第1組菌種比例(酵母菌∶植物乳桿菌∶醋酸菌=1∶2∶1)進(jìn)行發(fā)酵。在混合發(fā)酵中，發(fā)酵前期酒精發(fā)酵占主導(dǎo)，后期乳酸發(fā)酵占主導(dǎo)，醋酸發(fā)酵在酒精發(fā)酵之后，乳酸發(fā)酵是活性成分增加的主要原因，第1組中乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌，這是第1組活性物質(zhì)含量高于其他3組的主要原因[17-18]。酵母菌、乳酸菌及醋酸菌本身具有抗氧化能力，果蔬中的抗氧化成分主要有多酚類、類胡蘿卜素、花色苷和生育酚等，酚類化合物大多可以作為還原劑、金屬螯合劑、單線態(tài)氧猝滅劑和氫供體在體系中來(lái)發(fā)揮抗氧化功能[19]，活性物質(zhì)含量的增加也是抗氧化能力提高的原因之一，因此第1組的抗氧化能力顯著高于其他3組(p<0.05)。酒精發(fā)酵占主導(dǎo)時(shí)會(huì)大量利用還原糖，第3組酵母菌所占比例小，優(yōu)勢(shì)菌為醋酸菌，因此第3組剩余還原糖含量顯著高于其他3組(p<0.05)。

表2 菌種比例對(duì)發(fā)酵的影響

第1組菌種比例為1∶2∶1，第2組菌種比例為2∶1∶1，第3組菌種比例為1∶1∶2，第4組菌種比例為1∶1∶1；同行中不同字母表示數(shù)值間差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1發(fā)酵時(shí)間對(duì)不同指標(biāo)的影響

圖中不同字母表示數(shù)值間差異性達(dá)到顯著水平(p<0.05)，下同。圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

發(fā)酵過(guò)程中pH值、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量、總酚含量、·OH清除率和總抗氧化能力隨發(fā)酵時(shí)間的變化如圖1。

通過(guò)計(jì)算溫度條件下各水樣的礦物飽和指數(shù)(表3)發(fā)現(xiàn)，方解石、文石、白云石的飽和指數(shù)均大于0，處于過(guò)飽和狀態(tài)，而ZGJ04方解石及文石飽和指數(shù)近似于0，接近平衡狀態(tài)，說(shuō)明碳酸鹽及硅酸鹽類礦物出現(xiàn)有沉淀的現(xiàn)象；石英、玉髓飽和指數(shù)均小于0，ZGQ08玉髓接近飽和狀態(tài)。螢石能否達(dá)到平衡狀態(tài)，主要取決于熱水中的電導(dǎo)率，研究區(qū)螢石飽和指數(shù)處于-1.06～0.1之間，極有可能與冷水的混合有關(guān)。

如圖1所示，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力隨發(fā)酵時(shí)間呈先升高后降低變化，并在60 h達(dá)到最高點(diǎn)；pH值與還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間呈下降趨勢(shì)；蛋白質(zhì)含量呈波動(dòng)升高后下降的變化趨勢(shì)。由于實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)發(fā)酵使發(fā)酵液中總酚含量較高，同時(shí)抗氧化能力較強(qiáng)，發(fā)酵至60 h時(shí)發(fā)酵液的總酚含量及抗氧化能力均最高，故綜合考慮選擇60 h作為發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵至72 h時(shí)總酚含量及抗氧化能力有所下降的主要原因可能是此時(shí)活菌數(shù)下降，菌系活力降低，而總酚含量的降低也是抗氧化能力下降的原因之一。

2.2.2接種量對(duì)不同指標(biāo)的影響

接種量單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

如圖2所示，pH值、蛋白質(zhì)含量、還原糖的含量隨接種量的增加基本呈遞減的趨勢(shì)，發(fā)酵液中的微生物在不斷的產(chǎn)酸，分解與利用還原糖和蛋白質(zhì)，隨著接種量的加大，程度在加深；與其他接種量比較，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力均在6%接種量時(shí)，表現(xiàn)出較高的活性。當(dāng)接種量低于6%時(shí)發(fā)酵不充分，當(dāng)接種量高于6%時(shí)發(fā)酵液中微生物數(shù)量過(guò)多導(dǎo)致底物濃度不足以滿足其生長(zhǎng)需求，同時(shí)激烈的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)導(dǎo)致底物利用不合理，因此總酚含量及抗氧化能力均在接種量為6%時(shí)出現(xiàn)最大值。

圖2 接種量對(duì)發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculation volume on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

2.2.3發(fā)酵溫度對(duì)不同指標(biāo)的影響

發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

如圖3所示，pH值、還原糖含量在38 ℃時(shí)最低，與其他溫度相比，發(fā)酵程度較深；蛋白質(zhì)含量并無(wú)明顯差異。與其他發(fā)酵溫度比較，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力均在發(fā)酵溫度38 ℃時(shí)，表現(xiàn)出較高的活性。當(dāng)發(fā)酵溫度低于38 ℃時(shí)，對(duì)于植物乳桿菌而言，并未達(dá)到其發(fā)酵最佳溫度，發(fā)酵不充分，當(dāng)發(fā)酵溫度高于38 ℃時(shí)，過(guò)高的發(fā)酵溫度對(duì)酵母菌及醋酸菌有一定的抑制作用，因此總酚含量及抗氧化能力均在發(fā)酵溫度為38 ℃時(shí)出現(xiàn)最大值。

2.2.4初始糖度對(duì)不同指標(biāo)的影響

如圖4所示，pH值在15°Bx時(shí)最低，剩余還原糖含量隨初始糖度的增加呈遞增趨勢(shì)，蛋白質(zhì)含量并無(wú)明顯差異；與其他初始糖度比較，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力均在初始糖度15°Bx時(shí)，表現(xiàn)出較高的活性。當(dāng)初始糖度低于15°Bx時(shí)，碳源不充足，發(fā)酵不充分；當(dāng)初始糖度高于15°Bx時(shí)，過(guò)高的碳源濃度導(dǎo)致發(fā)酵液滲透壓升高抑制微生物生長(zhǎng)，導(dǎo)致微生物代謝不充分，因此總酚含量及抗氧化能力均在初始糖度為15°Bx時(shí)出現(xiàn)最大值。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 Effect offermentation temperature on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

圖4 初始糖度對(duì)發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial sugar content on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

2.3 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果、方差分析分別見(jiàn)表3、表4。

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，分別得到總酚含量和·OH清除率的模擬方程，見(jiàn)式(3)、式(4)：

Y1=53.26-0.35A-0.55B+0.54C-0.092D-
0.12AB+0.17AC+0.29AD+0.18BC-0.69BD-
0.065CD-1.95A2-0.43B2-2.48C2-1.69D2；

(3)

Y2=83.64+1.79A+0.98B+0.069C+
1.52D-1.15AB+0.16AC-0.93AD-
0.76BC-0.63BD+0.025CD-2.41A2-
2.01B2-1.45C2-2.33D2。

(4)

由表4的方差分析結(jié)果可知，將總酚含量作為響應(yīng)值，該模型p<0.01，說(shuō)明該模型極顯著；失擬誤差p>0.05，說(shuō)明沒(méi)有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.9598，說(shuō)明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。方程一次項(xiàng)系數(shù)B、C和二次項(xiàng)系數(shù)A2、B2、C2、D2具有極顯著性，方程一次項(xiàng)系數(shù)A和交互性BD具有顯著性。各因素對(duì)總酚含量影響的大小順序依次為接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間。接種量和初始糖度交互作用對(duì)總酚含量的影響具有顯著性。發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對(duì)總酚含量影響的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖5。將·OH清除率作為響應(yīng)值，該模型p<0.01，說(shuō)明該模型極顯著；失擬誤差p>0.05，說(shuō)明沒(méi)有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.928 0，說(shuō)明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。方程一次項(xiàng)系數(shù)A、B、D和二次項(xiàng)系數(shù)A2、B2、C2、D2具有極顯著性，交互項(xiàng)AB具有顯著性。各因素對(duì)·OH清除率影響的大小順序依次為發(fā)酵時(shí)間、初始糖度、接種量。發(fā)酵時(shí)間和接種量交互作用對(duì)·OH清除率的影響具有顯著性。發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對(duì)·OH清除率影響的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖6。

表3 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表中數(shù)據(jù)為3組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。

2.4 優(yōu)化發(fā)酵工藝條件的確定及驗(yàn)證

利用Design-Expert.V 8.0.6軟件的optimization功能，得到篤斯越橘混合菌發(fā)酵的優(yōu)化工藝條件：發(fā)酵時(shí)間61.45 h，接種量5.93%，發(fā)酵溫度38.44 ℃，初始糖度15.43°Bx；此發(fā)酵條件下發(fā)酵后的篤斯越橘總酚質(zhì)量濃度達(dá)53.19 mg/100 mL，·OH清除率達(dá)83.95%。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)理論值的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，同時(shí)為了方便實(shí)際操作，將優(yōu)化發(fā)酵工藝的條件調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間62 h，接種量6%，發(fā)酵溫度38.5 ℃，初始糖度15.5°Bx。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到發(fā)酵液中總酚質(zhì)量濃度達(dá)(53.27±0.16)mg/100 mL，·OH清除率達(dá)(83.88±0.19)%。結(jié)果與預(yù)測(cè)值相差甚小，因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化的篤斯越橘混合菌發(fā)酵工藝條件準(zhǔn)確合理，有實(shí)際指導(dǎo)意義。

2.5 陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果

優(yōu)化后的篤斯越橘發(fā)酵液的·OH清除率陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可以看出，優(yōu)化后的稀釋10倍的篤斯越橘發(fā)酵液的·OH清除率顯著高于作為陽(yáng)性對(duì)照的2 mg/mL維生素C溶液(p<0.01)，其抗氧化活性約為2 mg/mL維生素C溶液的5倍。

表4 Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)方差分析

p<0.05為顯著，用“*”表示；p<0.01為極顯著，用“**”表示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對(duì)總酚含量的影響Fig.5 Response surface plot of interaction among fermentation time, inoculation volume, fermentation temperature, and initial sugar content on total phenol content

圖6 發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對(duì)·OH清除率的影響Fig.6 Response surface plot of interaction among fermentation time, inoculation volume, fermentation temperature, and initial sugar content on hydroxyl radical scavenging rate

0.25mL的10%發(fā)酵液0.25mL的2 mg/mL維生素C·OH清除率/%83.88±0.19a16.16±0.14b

同行中不同字母表示數(shù)值間差異性達(dá)到顯著水平(p<0.01)。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以篤斯越橘為原料，選擇果酒酵母、植物乳桿菌和醋酸菌為發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。得到的優(yōu)化發(fā)酵工藝條件為：酵母菌、植物乳桿菌、醋酸菌菌種比例1∶2∶1，發(fā)酵時(shí)間62 h，接種量6%，發(fā)酵溫度38.5 ℃，初始糖度15.5°Bx。優(yōu)化后篤斯越橘發(fā)酵液的總酚質(zhì)量濃度達(dá)(53.27±0.16)mg/100 mL，稀釋10倍的篤斯越橘發(fā)酵液對(duì)·OH清除率達(dá)(83.88±0.19)%，與發(fā)酵前對(duì)比分別提高了56.91%和34.34%，其·OH清除率顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(p<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵前后總酚含量與·OH清除率均顯著提高(p<0.01)，這與其他研究人員研究結(jié)果相一致[20-21]。Kwaw等[20]研究結(jié)果表明乳酸發(fā)酵顯著影響了飲料中總酚、花青素和類黃酮的含量，乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中將復(fù)合多酚水解成更簡(jiǎn)單、更具生物活性的化合物，這是總酚含量增加的主要原因。漿果含有高含量的維生素C和多酚，已知維生素C和多酚在漿果中以糖苷的形式存在，當(dāng)用糖苷水解酶從漿果中除去葡萄糖時(shí)，漿果的抗氧化活性得到改善，且天然化合物的抗氧化活性在真菌、酵母菌或乳酸菌發(fā)酵后增加[21]，這是抗氧化能力顯著提高的主要原因。對(duì)比藍(lán)莓酵素及樹莓酵素，本實(shí)驗(yàn)所得篤斯越橘混合菌發(fā)酵產(chǎn)品的·OH清除率顯著高于管章瑞等[22]、程勇杰等[23]的研究結(jié)果(p<0.01)。