PKCβ抑制劑Ruboxistaurin對糖尿病大鼠不同臟器抗氧化物質(zhì)的影響

羅 軍,夏中元,張 元,蘇娃婷,雷少青

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060;*通訊作者,E-mail:xiazhongyuan2005@aliyun.com)

生理狀態(tài)下,機(jī)體內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡的穩(wěn)定狀態(tài);而糖尿病狀態(tài)下,持續(xù)高血糖刺激可誘導(dǎo)ROS蓄積,從而大量消耗抗氧化物質(zhì),引起氧化應(yīng)激損傷[1]。雖然,ROS過剩的不良影響對所有細(xì)胞而言是一致的,但是臨床上常見的糖尿病靶器官損害主要發(fā)生在:心臟、腎臟、外周神經(jīng)、視網(wǎng)膜病等[2]。這提示,不同組織對糖尿病誘導(dǎo)的氧化損傷耐受性具有差異性。既往研究表明,絲氨酸/蘇氨酸激酶PKCβ高度活化是糖尿病誘導(dǎo)的氧化損傷的重要機(jī)制[3];抑制PKCβ似乎是糖尿病及其并發(fā)癥防治的有效途徑[4]。然而,現(xiàn)有的研究結(jié)論并不一致;因此,本研究擬通過構(gòu)建1型糖尿病模型,并應(yīng)用PKCβ抑制劑RBX干預(yù),以探究RBX對糖尿病大鼠不同臟器抗氧化物質(zhì)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

30只8周齡SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量220-250 g,按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:正常對照組(C組,n=6)、糖尿病組(DM組,n=12)和糖尿病+RBX治療組(DM+RBX組,n=12)。所有動物購自湖北省疾控中心,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)動物實驗服務(wù)中心,商品化標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水供實驗動物自由攝取。

1.2 糖尿病模型構(gòu)建

建模前,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,禁食過夜,戊巴比妥65 mg/kg妥善麻醉。采用一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司)65 mg/kg誘導(dǎo)糖尿病模型;正常對照組注射同體積STZ配制液。給藥72 h,尾靜脈采血,血糖儀(德國Bayer公司)檢測各大鼠血糖水平,以超過16.8 mmol/L為糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)。本次實驗中,DM組有1只大鼠血糖值未達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn),予以剔除。DM+RBX組大鼠每天灌胃給予RBX(瑞士Alexis公司)1 mg/kg,其余兩組給予等體積生理鹽水。每周監(jiān)測血糖、血甘油三酯水平,每天記錄大鼠食物、飲水消耗量,以及墊料干濕重。兩天更換一次墊料,并計算墊料干濕重比值。其計算公式為:墊料干濕重比=1-(墊料濕重-墊料干重)/墊料濕重×100%。墊料干濕重比值與大鼠排尿量成負(fù)相關(guān)關(guān)系。

1.3 指標(biāo)檢測

糖尿病成模滿4周后,處死大鼠,獲取血漿,心、肺、肝、腎組織總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。采用商品化試劑盒分別檢測血甘油三酯含量、總抗氧化能力(以總抗氧化物含量表示),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及過氧化氫酶(catlase,CAT)活性。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,并嚴(yán)格按說明書操作。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Graph Pad Prism 7.04軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用Tukey’s檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況的比較

與Con組比較,DM組及DM+RBX組大鼠飲水量、進(jìn)食量、血糖及血甘油三酯含量顯著升高(P<0.05),而墊料干濕比、體質(zhì)量顯著降低(P<0.05,見圖1)。與DM組比較,DM+RBX組大鼠食物消耗量、血糖及血甘油三酯含量顯著降低(P<0.05),墊料干濕比顯著升高(P<0.05),而飲水量及體質(zhì)量無明顯變化(P>0.05,見圖1)。

與Con組比較,*P<0.05;與DM組比較,#P<0.05圖1 各組大鼠一般情況的比較Figure 1 Comparison of the general characteristics of rats among three groups

2.2 各組大鼠各組織總抗氧化物含量的比較

與Con組比較,DM組大鼠心組織總抗氧化物含量顯著增加(P<0.05),而肺、肝、腎組織總抗氧化物含量顯著減少(P<0.05,見圖2);DM+RBX組大鼠心組織總抗氧化物含量顯著增加(P<0.05),肺、肝組織總抗氧化物含量顯著減少(P<0.05),而腎組織總抗氧化物含量無明顯變化(P>0.05)。與DM組比較,DM+RBX組大鼠心、腎組織總抗氧化物含量顯著增加(P<0.05),而肺、肝組織總抗氧化物含量無明顯變化(P>0.05,見圖2)。

2.3 各組大鼠各組織SOD活性的比較

與Con組比較,DM組大鼠心肌組織SOD活性顯著增加(P<0.05),而肺、肝、腎組織SOD活性顯著降低(P<0.05,見圖3);DM+RBX組大鼠肺、肝組織SOD活性顯著降低(P<0.05),但心、腎組織SOD活性無明顯變化(P>0.05)。與DM組比較,DM+RBX組大鼠心肌組織SOD活性顯著降低(P<0.05),腎組織SOD活性顯著增加(P<0.05),而肺、肝組織SOD活性無明顯變化(P>0.05,見圖3)。

與Con組比較,*P<0.05;與DM組比較,#P<0.05圖2 各組大鼠各組織總抗氧化物含量的比較Figure 2 Comparison of total antioxidant concentration in different tissues among three groups

與Con組比較,*P<0.05;與DM組比較,#P<0.05圖3 各組大鼠各組織SOD活性的比較Figure 3 Comparison of SOD activity in different tissues among three groups

2.4 各組大鼠各組織CAT活性的比較

與Con組比較,DM組大鼠心、肝、腎組織CAT活性顯著增加(P<0.05),而肺組織CAT活性無明顯變化(P>0.05,見圖4);DM+RBX組大鼠肺組織CAT含量顯著減少(P<0.05),腎組織CAT活性顯著增加(P<0.05),而心、肝組織CAT活性無明顯變化(P>0.05)。與DM組比較,DM+RBX組大鼠心、肺、肝組織CAT活性顯著減少(P<0.05),而腎組織CAT活性無明顯變化(P>0.05,見圖4)。

與Con組比較,*P<0.05;與DM組比較,#P<0.05圖4 各組大鼠各組織CAT活性的比較Figure 4 Comparison of CAT activity in different tissues among three groups

3 討論

隨著全球糖尿病人群數(shù)量的不斷增加,使得糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率不斷升高。目前臨床上常見的糖尿病并發(fā)癥主要包括:糖尿病心臟病、糖尿病腎病、糖尿病外周神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病足等[5]。雖然,其他糖尿病相關(guān)的靶器官損害并不常見,但已有研究提出“糖尿病肺[6]”、“非酒精性脂肪肝[7]”、“糖尿病認(rèn)知功能損害[8]”等概念。因此,關(guān)注糖尿病的多臟器損害,具有重要意義。

生理狀態(tài)下,細(xì)胞生命活動產(chǎn)生的ROS可及時有效地被抗氧化系統(tǒng)清除,以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)ROS的清除主要通過抗氧化酶(如SOD、CAT、輔酶Q10等)和非酶(如維生素C、Zn、Mn等)兩大途徑。在糖尿病狀態(tài)下,慢性或間歇性高血糖刺激可誘導(dǎo)ROS蓄積,進(jìn)而大量消耗抗氧化物質(zhì),造成氧化應(yīng)激損傷[2,5]。然而,外源性補(bǔ)充維生素E、維生素C等抗氧化劑并未能改善糖尿病及其并發(fā)癥的進(jìn)展[5]。因此,仍需進(jìn)一步探究糖尿病靶器官氧化損傷的具體機(jī)制。

既往研究指出,PKCβ活化與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。在人腎小球系膜細(xì)胞中,高糖環(huán)境可誘導(dǎo)PKCβ高表達(dá),并導(dǎo)致ROS蓄積[9]。此外,PKCβ可激活膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C,進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪生成,導(dǎo)致胰島素抵抗和脂質(zhì)過氧化損傷[10]。而應(yīng)用PKCβ抑制劑RBX干預(yù),可有效抑制糖尿病大鼠心肌組織PKCβ2(PKCβ亞型)活化,減心肌氧化損傷,改善左心室舒張功能[11]。使用siRNA或RBX下調(diào)PKCβ表達(dá),亦可改善糖尿病腎組織氧化損傷[3]。本研究亦發(fā)現(xiàn),RBX治療可顯著增加心、腎組織總抗氧化物含量,具有類似抗氧化的作用。因此,PKCβ過度活化可能是糖尿病靶器官氧化損傷的重要機(jī)制。

早期積極控制血糖是臨床上糖尿病及其并發(fā)癥治療的基礎(chǔ)[12]。在本研究中,糖尿病大鼠表現(xiàn)出了多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕,以及高血糖、高甘油三酯等1型糖尿病的典型特征;而PKCβ特異性抑制劑RBX,可有效降低糖尿病大鼠血糖水平,一定程度上改善其癥狀。雖然,RBX制劑已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于臨床上糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病黃斑水腫的防治;但一項有關(guān)糖尿病外周神經(jīng)病變的3期臨床試驗中,RBX并未顯示出預(yù)期的保護(hù)作用[4]。可見,糖尿病狀態(tài)下,RBX的療效具有組織特異性。本研究亦發(fā)現(xiàn),RBX可不同程度增強(qiáng)組織總抗氧化能力,但心、腎組織對RBX的治療反應(yīng)性較好。因此,進(jìn)一步探究RBX在糖尿病狀態(tài)下的多臟器作用,將為臨床上糖尿病藥物研發(fā)提供新思路。