包裝方式對(duì)牛肉貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化及降解的影響

扶慶權(quán)，張萬(wàn)剛，宋尚新，王海鷗，陳守江

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包裝方式對(duì)牛肉貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化及降解的影響

扶慶權(quán)1，張萬(wàn)剛2，宋尚新1，王海鷗1，陳守江1

（1. 南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，南京 211171；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

為探明托盤(pán)透氧包裝（air packaging, AP）和高氧氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging, MAP, 80% O2+20% CO2）對(duì)宰后牛肉貯藏過(guò)程中對(duì)牛肉嫩度影響的潛在機(jī)制，以真空包裝（vacuum packaging, VP）為對(duì)照，選取6 頭西門(mén)塔爾純種母黃牛背最長(zhǎng)肌，分別進(jìn)行托盤(pán)透氧包裝、真空包裝和高氧氣調(diào)包裝，4℃冷庫(kù)分別貯藏0、4、7、10 d，分別測(cè)定蛋白羰基含量及分布、蛋白表面疏水性值、蛋白質(zhì)溶解度值以及肌間線(xiàn)蛋白和肌聯(lián)蛋白的降解變化。結(jié)果表明：相對(duì)于真空包裝組，托盤(pán)包裝組和高氧氣調(diào)包裝組在宰后貯藏過(guò)程中肌細(xì)胞外圍出現(xiàn)羰基氧化熒光信號(hào)顯著增加，且不斷向細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)散，說(shuō)明其蛋白質(zhì)氧化程度不斷增加；宰后貯藏10 d后，托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組的蛋白質(zhì)表面疏水性顯著高于真空包裝組（< 0.05），而托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組的蛋白溶解性顯著低于真空包裝組（< 0.05）；宰后貯藏7和10 d，托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組的肌間線(xiàn)蛋白和肌聯(lián)蛋白的降解顯著低于真空包裝組（< 0.05），說(shuō)明托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組抑制了肌間線(xiàn)蛋白和肌聯(lián)蛋白的降解（< 0.05）。托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組能夠提高宰后貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化程度，從而抑制其對(duì)牛肉骨骼關(guān)鍵蛋白的降解，該研究可為牛肉貯藏提供理論支撐。

冷藏；包裝；蛋白質(zhì)；牛肉；托盤(pán)包裝；高氧氣調(diào)包裝；真空包裝；蛋白質(zhì)氧化；蛋白質(zhì)降解

0 引 言

中國(guó)是冷鮮肉和肉制品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，而冷鮮肉在冷藏貯藏過(guò)程中，由于肉質(zhì)變得柔嫩多汁且具有良好氣味和滋味，已成為國(guó)內(nèi)外消費(fèi)的主流[1]。近年來(lái)，冷鮮肉在生鮮肉的生產(chǎn)和銷(xiāo)售中所占的比例不斷增大。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，冷鮮肉將是今后鮮肉發(fā)展的必然趨勢(shì)。

目前，在冷鮮肉生產(chǎn)和銷(xiāo)售過(guò)程中，為了滿(mǎn)足不同顧客的需要，不同包裝方式冷鮮肉應(yīng)運(yùn)而生。最常見(jiàn)的包裝形式主要有透氧托盤(pán)包裝、真空包裝和高氧氣調(diào)包裝。這些包裝技術(shù)的主要作用于防止二次污染、抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖、提高產(chǎn)品的嫩度和顏色等感官品質(zhì)，抑制蛋白質(zhì)氧化和脂肪氧化，減少質(zhì)量損失，提高產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。真空包裝是市場(chǎng)上鮮肉常用的一種包裝方式，通常被用于牛肉在運(yùn)輸過(guò)程中進(jìn)行保鮮。它是將包裝袋內(nèi)的空氣抽以降低氧氣含量，然后采用密封技術(shù)，使包裝內(nèi)的鮮肉和空氣隔絕，從而保持鮮肉肌紅蛋白本身所具有的紫紅色[4]。托盤(pán)透氧包裝是目前肉類(lèi)超市冷柜中最常見(jiàn)的一種包裝方式。鮮肉切分后采用白色的泡沫聚苯乙烯托盤(pán)進(jìn)行包裝，上面配以無(wú)毒的聚氯乙烯或聚乙烯薄膜通過(guò)熱封收縮緊貼在托盤(pán)上[5]。高氧氣調(diào)包裝（80% O2+20% CO2）主要用于小塊牛肉和高價(jià)格的牛肉如背部最長(zhǎng)肌、腰大肌和半膜肌等的包裝，其主要目的是保持鮮肉穩(wěn)定的亮紅色和延長(zhǎng)貨架期[6]。托盤(pán)包裝和80%高氧氣調(diào)包裝含有高濃度的氧，在鮮肉冷藏期間潛在引起脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化，而蛋白質(zhì)氧化能夠降低鮮肉的品質(zhì)如嫩度和多汁性[7-8]。

蛋白質(zhì)氧化是通過(guò)活性氧或氧化應(yīng)激的副產(chǎn)物引起蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾，從而能夠引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變[9]。在鮮肉的加工和貯藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)氧化是導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降的主要原因。蛋白質(zhì)氧化可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)、氨基酸側(cè)鏈修飾和蛋白質(zhì)片段的形成[10]。蛋白質(zhì)氧化修飾的程度主要通過(guò)羰基衍生物的形成、巰基的損失以及分子內(nèi)和分子間交聯(lián)的程度來(lái)評(píng)價(jià)。前期已研究證實(shí)，蛋白質(zhì)氧化能夠抑制-鈣蛋白酶的活性從而影響其對(duì)鮮肉關(guān)鍵骨架蛋白的降解速率和程度，從而進(jìn)一步影響鮮肉肌細(xì)胞內(nèi)水分的分布狀態(tài)以及嫩化程度[11-12]。

然而，托盤(pán)包裝、真空包裝和80%高氧氣調(diào)包裝3種包裝條件下蛋白質(zhì)氧化調(diào)控牛肉品質(zhì)的機(jī)理目前還不清楚，尤其是3種包裝方式對(duì)牛肉肌細(xì)胞蛋白氧化的分布情況以及關(guān)鍵骨架蛋白的降解目前還未有報(bào)道。因此，本文主要是探討3種不同包裝方式下蛋白質(zhì)氧化對(duì)宰后牛肉在貯藏過(guò)程中的氧化修飾的影響以及對(duì)關(guān)鍵骨骼蛋白降解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)選取體質(zhì)量基本相當(dāng)?shù)哪更S牛（西門(mén)塔爾純種）6頭，月齡均為18個(gè)月。所有黃牛均在阜陽(yáng)雨潤(rùn)食品有限公司屠宰，胴體稱(chēng)質(zhì)量后送入4℃冷庫(kù)排酸24 h，分別從每頭牛的左半邊胴體的第13根肋骨到最后一根肋骨處取下背最長(zhǎng)肌備用。

聚丙烯托盤(pán)、封口膜及真空包裝袋由快衛(wèi)爾（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)；DNPH（2,4-二硝基苯肼，2,4-dinitrophenylhydrazine），上海阿拉丁試劑有限公司；CY3-羊抗兔二抗、山羊和兔血清，武漢博士得生物工程有限公司；DNPH抗體（D9556）、肌間線(xiàn)蛋白單克隆抗體（ab8976）和HRP（辣根過(guò)氧化物酶，horseradish peroxidase）標(biāo)記羊抗鼠IgG，英國(guó)Abcam公司；過(guò)氧化物標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白，美國(guó)Bio-Rad公司；PVDF（聚偏二氟乙烯膜，polyvinylidene fluoride）膜，美國(guó)Millipore公司；BCA（二喹啉甲酸，bicinchoninic acid）蛋白檢測(cè)試劑盒和ECl（電化學(xué)發(fā)光，elctro-chemi-luminescience）試劑盒，美國(guó)Thermo公司；BSA (牛血清白蛋白, bovine serum albumin )，美國(guó)Promega公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Turrax T18 Basic高速勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司； Avanti J-E落地式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司； Smart 500氣調(diào)包裝機(jī)，西班牙Ulma包裝公司；DC800-FB-E真空包裝機(jī)，美國(guó)快爾衛(wèi)包裝公司；托盤(pán)透氧包裝機(jī)，蘇果超市有限公司衛(wèi)崗店； SpectraMax M2酶標(biāo)儀，美國(guó) Molecular Devices公司； UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；LSM 700 META 激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)蔡司公司；CM1950 超薄冷凍切片機(jī)，德國(guó) Leica 公司；PowerPac 1000 垂直電泳儀和Mini-protein Tetra Cell 電泳設(shè)備，美國(guó) Bio-Rad 公司；ImageQuant LAS 4000 分子成像系統(tǒng)和 Imagescanner凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó) GE公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

剔除6條背最長(zhǎng)肌上面可見(jiàn)脂肪、筋膜和結(jié)締組織，將牛肉樣品分割成厚3 cm、長(zhǎng)6 cm、質(zhì)量500 g的肉塊，牛肉樣品充分混合后隨機(jī)分成3組，一組進(jìn)行托盤(pán)透氧包裝（PE材料，氧氣透過(guò)率>7 000 cm3/m2·24 h·atm，二氧化碳透過(guò)率>28 000 cm3/m2·24 h·atm），一組進(jìn)行真空包裝（PA/PE材料，氧氣透過(guò)率<30 cm3/m2·24 h·atm，二氧化碳透過(guò)率<120 cm3/m2·24 h·atm），另外一組進(jìn)行高氧氣調(diào)包裝（80 % O2+ 20% CO2，PA/EVOH/PE材料，封口膜氧氣透過(guò)率<1 cm3/m2·24h·atm，二氧化碳透過(guò)率<5 cm3/m2·24 h·atm）。包裝后的牛肉樣品放在4℃冷庫(kù)中貯藏，在0（未包裝樣品）、4、7、10 d到達(dá)后分別取樣測(cè)定相關(guān)的指標(biāo)。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

宰后貯藏0、4、7、10 d后牛肉肌原纖維蛋白的提取根據(jù)Park 等[13]的方法并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。稱(chēng)取5 g解凍好的凍肉攪碎后，加入25 mL預(yù)冷過(guò)的肌原纖維蛋白提取緩沖液（2 mol/L MgCl2，100 mol/L NaCl，1 mol/L EGTA，10 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH值7.0），使用勻漿機(jī)在4℃以12 000 r/min的速度勻漿2次，每次15 s，勻漿液于4 ℃ 2 000 g轉(zhuǎn)速離心10 min。沉淀用20 mL上述緩沖液以同樣的條件重復(fù)2次。離心后沉淀用20 mL 100 mol/L NaCl溶液重復(fù)洗滌2次，離心后沉淀即為肌原纖維蛋白。沉淀首先溶解在20 mol/L磷酸鹽緩沖液中（含0.6 mol/L NaCl，pH值6.5），采用雙縮脲方法測(cè)定肌原纖維蛋白的濃度[14]，肌原纖維蛋白濃度最終調(diào)整為8 mg/mL。一部分溶解的肌原纖維蛋白溶液用于測(cè)定蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)，一部分溶解的肌原纖維蛋白溶液與等體積的電泳上樣緩沖液（125 mmol/L Tris-base，4% SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfate），20%甘油，0.5% MCE（β-巰基乙醇，β-mercaptoethanol），0.1%溴酚藍(lán)，pH值6.8）用漩渦器充分混合，最終肌原纖維蛋白的上樣液濃度為4 mg/mL，樣品于95 ℃水浴5 min，取出冷卻后分裝樣品，-80 ℃存放用于蛋白電泳和蛋白免疫印跡測(cè)定。

1.3.3 肌細(xì)胞內(nèi)羰基分布測(cè)定

牛肉樣品羰基肌細(xì)胞的分布測(cè)定參考Astruc 等[15]的方法并做一定的修改。將宰后冷藏貯藏0、4、7、10 d后的牛肉樣品，沿肌原纖維方向?qū)⑴Ｈ鈮K切成細(xì)長(zhǎng)條（長(zhǎng)2 cm×寬0.2 cm×高0.2 cm），立即放入液氮中快速冷凍60 s以防止肌肉冰晶形成，平行測(cè)定6個(gè)牛肉樣品。冰凍超薄切片機(jī)將牛肉細(xì)長(zhǎng)條切成10m厚的薄片，立即加入0.02% DNPH溶液（溶解在20 mmol/L磷酸鹽緩沖液和0.1 mol/L氯化鈉的混合液中，pH值6.0）于暗處反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后切片樣品用含0.1%吐溫的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值6.75）重復(fù)沖洗6次，每次洗滌5 min。切片樣品隨后用10%的兔血清（溶解在20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值6.0）37℃封閉1 h。移除封閉液，立即加入DNPH多克隆抗體（稀釋100倍）于4℃孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后切片樣品用含0.1%吐溫的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值6.75）重復(fù)沖洗6次，每次洗滌5 min。切片樣品用羊血清進(jìn)行于37℃二次封閉1 h。移除封閉液，加入CY3標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白溶液（稀釋50倍）暗處孵育1 h。反應(yīng)結(jié)束后同樣用磷酸鹽緩沖液重復(fù)沖洗6次，每次洗滌5 min。采用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察肌細(xì)胞間羰基分布情況。測(cè)試條件為激發(fā)波長(zhǎng)555 nm，發(fā)射波長(zhǎng)570 nm，樣品放大200倍，曝光時(shí)間相同。

1.3.4 表面疏水性測(cè)定

肌原纖維蛋白表面疏水性測(cè)定參照Chelh 等[16]的方法并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。宰后貯藏0、4、7、10 d后牛肉樣品提取的肌原纖維蛋白用20 mmol/mL 的磷酸鹽緩沖液（pH值6.0）溶解并調(diào)整的至蛋白濃度為2 mg/mL，取出2 mL 蛋白溶液加入40L 1 mg/mL 溴酚藍(lán)溶液充分混合，對(duì)照組取2 mL的20 mmol/mL 磷酸鹽緩沖液（pH值6.0）同樣加入40L的1 mg/mL 溴酚藍(lán)溶液充分混合。樣品和對(duì)照品用搖床在室溫震蕩10 min，于4℃條件下以4 000 g 離心15 min，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定上清液吸光度值，表面疏水性結(jié)果即結(jié)合溴酚藍(lán)采用公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

結(jié)合溴酚藍(lán)=40× (OD對(duì)照組? OD樣品) / OD對(duì)照組（1）

1.3.5 蛋白溶解度測(cè)定

宰后貯藏0、4、7、10 d后牛肉樣品的溶解度測(cè)定參考Joo 等[17]的方法略有改動(dòng)。肌漿蛋白溶解度測(cè)定：1 g碎肉加入0.025 mol/mL（pH值7.2）預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液，勻漿機(jī)以最低速勻漿1 min，放入搖床固定于4℃勻速震蕩過(guò)夜，取出勻漿液1 500 g離心20 min，上清液肌漿蛋白溶解度采用雙縮脲方法進(jìn)行測(cè)定?？偟鞍兹芙舛葴y(cè)定：1 g碎肉加入20 mL的0.1 mol/mL（含1.1 mol/mL碘化鉀，pH值7.2）預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，按肌漿蛋白同樣的方法和程序進(jìn)行勻漿、震蕩、離心和測(cè)定。肌原纖維蛋白的溶解度為總蛋白溶解和肌漿蛋白溶解度的差值。

1.3.6 肌間線(xiàn)蛋白測(cè)定

宰后冷藏0、4、7、10 d后牛肉樣品的肌間線(xiàn)蛋白測(cè)定參考Fu 等[18]的方法并進(jìn)行稍微修改。肌間線(xiàn)蛋白電泳采用4%的濃縮膠和10%的分離膠，按膠孔從左到右邊的順序依次加入4L標(biāo)準(zhǔn)蛋白和30g肌原纖維蛋白分別用來(lái)測(cè)定目標(biāo)蛋白的位置和分析不同樣品肌間線(xiàn)蛋白的變化。濃縮膠于恒壓60 V電泳30 min，進(jìn)入分離膠后增大電壓至120 V 繼續(xù)電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)跑至分離膠的底部停止電泳。肌間線(xiàn)蛋白在恒壓90 V條件下于4℃轉(zhuǎn)印120 min，轉(zhuǎn)印液為10%甲醇, 192 mmol/L甘氨酸和25 mmol/L Tris-base。轉(zhuǎn)印完成后的聚偏氟乙烯膜放入含有5%脫脂奶粉的TTBS溶液（20 mmol/L Tris-base，137 mmol/L NaCl， 0.05% Tween 20，5 mmol/L KCl）于常溫孵育封閉2 h。肌間線(xiàn)蛋白一抗按1：500的稀釋倍數(shù)于4℃條件下孵育反應(yīng)15 h。反應(yīng)結(jié)束后取出膜并用TTBS溶液反復(fù)洗滌6次，每次5 min。聚偏氟乙烯膜置于HRP標(biāo)記二抗溶液（1：500）中于室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后取出膜同樣用TTBS溶液反復(fù)洗滌6次，每次5 min。聚偏氟乙烯膜表面用ECL顯色劑在暗箱反應(yīng)顯色5 min，使用凝膠成像儀掃描曝光并拍照。肌間線(xiàn)蛋白的條帶強(qiáng)度用Quantity one分析軟件進(jìn)行半定量分析。肌間線(xiàn)蛋白降解的結(jié)果用免疫反應(yīng)的熒光強(qiáng)度值除以對(duì)照樣品的熒光強(qiáng)度值所得百分比來(lái)表示。

1.3.7 肌聯(lián)蛋白測(cè)定

宰后冷藏貯藏0、 4、7、10 d后牛肉樣品的肌聯(lián)蛋白的降解測(cè)定參照Li 等[19]的方法并稍加修改。5%的連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=100:1，1.5 mol/L Tris-base，pH值8.0，0.1% SDS，0.05%過(guò)硫酸銨，0.05%四甲基乙二胺），每孔肌原纖維蛋白的上樣量均為20g。每塊膠以恒流4.5 mA常溫電泳20 h電泳結(jié)束。采用考馬斯亮藍(lán)對(duì)肌聯(lián)蛋白膠進(jìn)行固定、染色和脫色，使用凝膠成像儀掃描并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，所有牛肉樣品使用6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。采用SAS 8.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不同處理組的差異采用ANOVA的方差分析，平均值的差異比較采用鄧肯的多重比較，每2個(gè)數(shù)據(jù)的均值的差異顯著性采用-檢驗(yàn)進(jìn)行（< 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同包裝方式對(duì)牛肉肌細(xì)胞內(nèi)羰基分布的影響

圖1所有樣品白色熒光信號(hào)均為牛肉肌細(xì)胞中蛋白氧化形成的羰基。不同包裝方式對(duì)牛肉貯藏過(guò)程中肌細(xì)胞內(nèi)羰基分布的影響如圖1所示。

注：AP，VP和MAP表示托盤(pán)透氧包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝。視野放大倍數(shù)均為200倍；標(biāo)尺表示100 μm。

由圖1可知，宰后冷藏貯藏4 d后，托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝牛肉樣品的肌細(xì)胞四周出現(xiàn)氧化熒光信號(hào)，熒光分布不均勻，真空包裝牛肉樣品的肌細(xì)胞四周出現(xiàn)少量的氧化熒光信號(hào)。宰后冷藏貯藏7 d后，托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝牛肉樣品的白色熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，且由肌細(xì)胞外部逐漸向胞內(nèi)擴(kuò)散，真空包裝牛肉樣品的少量的白色熒光分布在肌細(xì)胞四周。宰后冷藏貯藏10 d后，托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝牛肉樣品的肌細(xì)胞四周呈現(xiàn)高亮熒光信號(hào)，白色熒光部分逐漸向肌細(xì)胞內(nèi)部滲透且熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，而真空包裝牛肉樣品的白色熒光信號(hào)相對(duì)較弱，分布多集中在細(xì)胞的周?chē)Ｏ鄬?duì)于真空包裝，托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品白色熒光信號(hào)的增加說(shuō)明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其羰基含量越來(lái)越高，蛋白質(zhì)氧化程度加劇。蛋白質(zhì)氧化是活性氧（ROS，reactive oxygen species）直接或間接與蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激二級(jí)產(chǎn)物反應(yīng)引起蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾[9]?；钚匝踝杂苫c氨基酸反應(yīng)或者活性氧氧化氨基酸的殘基側(cè)鏈、肽骨架以及功能基團(tuán)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)、肽鏈骨架的斷裂或氨基酸側(cè)鏈的氧化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的損失和酶活性鈍化[20]。在已有的參考文獻(xiàn)中，大多數(shù)作者通常采用氨基酸側(cè)鏈形成的蛋白羰基化合物濃度來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)氧化的程度，此方法過(guò)程繁瑣且測(cè)定結(jié)果誤差大。

在本試驗(yàn)中，采用免疫組化的方法同時(shí)使用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)來(lái)觀(guān)察蛋白質(zhì)氧化程度，能夠更加清晰明了的觀(guān)察到肌細(xì)胞氧化的變化過(guò)程。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品相對(duì)托盤(pán)包裝其氧化程度加劇，且氧化熒光信號(hào)由細(xì)胞外逐漸向細(xì)胞內(nèi)滲透。Astruc等[15]通過(guò)激光共聚焦來(lái)觀(guān)測(cè)羰基在肌細(xì)胞內(nèi)的熒光分布情況，發(fā)現(xiàn)宰后動(dòng)物體內(nèi)蛋白氧化起始于細(xì)胞膜上蛋白氧化，ROS從肌細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)部傳遞的過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白逐漸被氧化。

2.2 不同包裝方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

溴酚藍(lán)同非水溶性蛋白特異性結(jié)合被認(rèn)為是測(cè)定肌原纖維蛋白表面疏水性值的一種簡(jiǎn)單而可靠的方法，而結(jié)合溴酚藍(lán)的數(shù)量是反應(yīng)蛋白表面疏水性值的一個(gè)指標(biāo)[16]。3種包裝方式處理的牛肉樣品貯藏4 d后其表面疏水性值無(wú)顯著性差異（圖2,> 0.05）。

牛肉樣品貯藏7 d后，托盤(pán)包裝牛肉樣品的表面疏水性值顯著高于真空包裝和氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05），而真空包裝的牛肉樣品和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品相比無(wú)顯著性差異（> 0.05）。牛肉樣品貯藏10 d后，托盤(pán)包裝牛肉樣品的表面疏水性值顯著高于真空包裝和氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05），而80%高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品的表面疏水性值又顯著高于真空包裝的牛肉樣品（< 0.05）。溴酚藍(lán)能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互作用，因此它常常作為一種簡(jiǎn)單而可靠的方法用來(lái)鑒別肌原纖維蛋白構(gòu)象的變化和特征化表面疏水位點(diǎn)的暴露[21-22]。試驗(yàn)結(jié)果與Chelh等[16]報(bào)道的結(jié)果具有一致性。Chelh 等發(fā)現(xiàn)隨著加熱溫度的增加，蛋白質(zhì)氧化程度高，豬肉肌原纖維蛋白的表面疏水性也就隨之增加。Santé-Lhoutellier 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)氧化增加了肌原纖維蛋白表面疏水性。蛋白表面疏水性增加表明化學(xué)氧化可能引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這些結(jié)構(gòu)的改變由于非極性氨基酸分子進(jìn)入疏水簇導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分子的展開(kāi)或者重排[24]。

注：不同字母表示不同包裝方式在相同冷藏時(shí)間下差異顯著（P < 0.05），下同。

2.3 不同包裝方式對(duì)牛肉蛋白質(zhì)溶解度的影響

3種包裝方式處理對(duì)牛肉樣品宰后貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白溶解度、肌漿蛋白溶解度和總蛋白溶解度的影響如圖3所示。

圖3 3種包裝方式在4℃貯藏10d過(guò)程中對(duì)牛肉樣品肌原纖維蛋白溶解度、肌漿蛋白降解度和總蛋白溶解度的影響

由圖3可知，在牛肉樣品貯藏4 d，3種包裝方式的牛肉樣品的肌原纖維蛋白的溶解度無(wú)顯著性差異（> 0.05），而真空包裝牛肉樣品的肌漿蛋白和總蛋白溶解度顯著高于托盤(pán)包裝的牛肉樣品（< 0.05）。在牛肉樣品貯藏7 和10 d，真空包裝牛肉樣品的肌原纖維蛋白和總蛋白溶解度顯著高于托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05），而高氧氣調(diào)包裝牛肉樣品的肌原纖維蛋白和總蛋白的溶解度顯著高于托盤(pán)包裝的牛肉樣品（< 0.05）。在牛肉樣品貯藏7 d，真空包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度顯著高于托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05）。而托盤(pán)包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度和80%高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品相比無(wú)顯著性差異（> 0.05）。在牛肉樣品貯藏10 d，真空包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度顯著高于托盤(pán)包裝的牛肉樣品（< 0.05），而托盤(pán)包裝牛肉樣品的肌漿蛋白溶解度和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品相比無(wú)顯著性差異（> 0.05）。溶解度可用于表征蛋白質(zhì)變性聚集和交聯(lián)程度。氧化可以改變蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象導(dǎo)致溶解度降低。在本文研究中，托盤(pán)包裝和80%高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品在宰后貯藏過(guò)程中相對(duì)于真空包裝其蛋白質(zhì)溶解度的下降可能是由于氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的氧化修飾程度高導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化加劇，從而使蛋白質(zhì)分子內(nèi)疏水基團(tuán)的暴露更多，表面疏水性不斷增加。同時(shí)由于游離巰基易氧化轉(zhuǎn)化為二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的出現(xiàn)大量聚集和沉淀[25]。

2.4 不同包裝方式對(duì)牛肉樣品肌間線(xiàn)蛋白的影響

肌間線(xiàn)蛋白是中間絲狀體結(jié)構(gòu)的一個(gè)主要蛋白，其主要功能是維持肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。肌間線(xiàn)蛋白的降解在宰后貯藏期間對(duì)肉質(zhì)量的改善有重要的影響。不同包裝方式對(duì)宰后牛肉貯藏過(guò)程中肌間線(xiàn)蛋白降解的影響如圖4a、4b所示。

注：孔1、2、3代表貯藏0 d未包裝的牛肉樣品；孔4、5、6代表貯藏4 d后的托盤(pán)包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品；孔7、8、9代表貯藏7 d后的托盤(pán)包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品；孔10、11、12代表貯藏10 d后的托盤(pán)包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品。對(duì)照樣品為0 d的牛肉樣品。

由圖4b可知，不管是宰后貯藏4 、7 還是10 d，真空包裝牛肉樣品的肌間線(xiàn)蛋白降解率顯著高于托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05），而在宰后貯藏4和7 d，托盤(pán)包裝牛肉樣品的肌間線(xiàn)蛋白降解率顯著高于高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05），在宰后貯藏10 d，托盤(pán)包裝牛肉樣品的肌間線(xiàn)蛋白降解率顯著低于高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05）。肌間線(xiàn)蛋白是一種含量豐富且非常重要的細(xì)胞骨架蛋白，它連接骨骼肌中肌節(jié)和肌膜的Z-盤(pán)，分子量約53 kDa，其主要功能是維持肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[26-27]。在宰后貯藏期間，肌間線(xiàn)蛋白的降解與鮮肉嫩度的改善密切相關(guān)[28]。在本研究中，3種包裝方式的肌間線(xiàn)蛋白降解不同，這可能是由于3種包裝的牛肉樣品的蛋白質(zhì)氧化程度不同導(dǎo)致鈣激活酶活性抑制程度不同，從而使得活性不同的鈣激活酶在宰后貯藏期間對(duì)肌間線(xiàn)蛋白的降解程度有所差異。

2.5 不同包裝方式對(duì)牛肉樣品肌聯(lián)蛋白的影響

肌聯(lián)蛋白橫跨Z線(xiàn)和M線(xiàn)，維持肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性。宰后肌聯(lián)蛋白的降解速率和鮮肉嫩度密切相關(guān)。在宰后貯藏過(guò)程中，牛肉的肌聯(lián)蛋白由完整條帶降解為分子量大約2 400 kDa的降解產(chǎn)物。不同包裝方式對(duì)宰后牛肉貯藏過(guò)程中肌聯(lián)蛋白降解的影響如圖5所示。由圖5可知，在宰后貯藏0 d后，3種包裝方式下牛肉樣品的肌聯(lián)蛋白降解條帶T2沒(méi)有顯著差異（> 0.05）。無(wú)論宰后冷藏貯藏4 、7還是10 d后，真空包裝牛肉樣品的肌聯(lián)蛋白降解條帶T2顯著高于托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品（< 0.05），即托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝抑制了宰后牛肉肌聯(lián)蛋白的降解。肌聯(lián)蛋白是分子量很大的肌原纖維蛋白，約為2.8×106kDa，在有條紋的肌原纖維蛋白中，它橫跨Z線(xiàn)和M線(xiàn)，從而維持肌纖維骨架結(jié)構(gòu)的完整性[29]。肌聯(lián)蛋白也是對(duì)降解最敏感的骨架蛋白之一，在宰后貯藏期間很容易降解，因此宰后貯藏過(guò)程中肌聯(lián)蛋白的降解速率和鮮肉嫩度密切相關(guān)[30]。試驗(yàn)中，我們無(wú)論宰后貯藏4、7還是10 d，真空包裝牛肉樣品的肌聯(lián)蛋白降解率顯著高于托盤(pán)包裝和氣調(diào)包裝的牛肉樣品，說(shuō)明包裝方式對(duì)肌聯(lián)蛋白的降解有顯著的影響。

注：T1表示完整的肌聯(lián)蛋白，T2表示降解的肌聯(lián)蛋白；孔1代表0 d的樣品并作為對(duì)照；孔2、3、4代表貯藏4 d后的托盤(pán)包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品；孔5、6、7代表貯藏7 d后的托盤(pán)包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品；孔8、9、10分別代表10 d后的托盤(pán)包裝、真空包裝、高氧氣調(diào)包裝的牛肉樣品。

3 結(jié) 論

相對(duì)于真空包裝，托盤(pán)包裝和高氧氣調(diào)包裝牛肉樣品在4℃貯藏10 d后其羰基在肌細(xì)胞分布不斷增加，說(shuō)明羰基含量增加，蛋白質(zhì)氧化程度加劇。宰后貯藏10 d后，托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組的蛋白質(zhì)表面疏水性顯著高于真空包裝組（< 0.05）；宰后貯藏7 和10 d，托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組的肌間線(xiàn)蛋白和肌聯(lián)蛋白的降解顯著低于真空包裝組（< 0.05），說(shuō)明托盤(pán)透氧包裝組和高氧氣調(diào)包裝組抑制了肌間線(xiàn)蛋白和肌聯(lián)蛋白的降解（< 0.05）。

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Effects of different packaging methods on protein oxidation and degradation of beef during refrigeration storage

Fu Qingquan1, Zhang Wangang2, Song Shangxin1, Wang Haiou1, Chen Shoujiang1

(1.211171,; 2.210095,)

Air packaging (AP), vacuum packaging (VP) and modified atmosphere packaging (MAP) have been widely used during chilled storage in retail meat market. However, different packaging has its advantage and disadvantage. AP can get desirable red color in a short time, but protein oxidation and lipid oxidation occur during cold storage. VP keeps a stable purple color and increases the shelf life of fresh meat. However, VP can cause liquid exudation and product deformation of fresh meat. MAP with 80% oxygen can maintain desirable and stable cherry red color of fresh meat and extend the shelf life of fresh beef. Nevertheless, it can possibly cause protein oxidation and lipid oxidation of fresh meat during chilled storage. Protein oxidation is the covalent modification of proteins induced by reactive oxygen species or by-products of oxidative stress. Previous researches have demonstrated that protein oxidation inhibits-calpain activity, which may influence the rate and degree of protein degradation of fresh meat. The aim of this study was to examine effects of AP and high-oxygen MAP (80% O2+ 20% CO2) on the tenderness of beef samples during postmortem cold storage using VP as control. Six longissimus dorsi muscles of Simmental purebred yellow cattle were precooled at 4℃ for 24 h, which were then randomly assigned to MAP, VP and AP, and stored for 0, 4, 7 and 10 d respectively at 4℃. The carbonyl content and distribution, the values of protein surface hydrophobicity, the solubility values of myofibrillar protein, sarcoplasmic protein and total protein, and the degradation of desmin and titin were determined, respectively. The results showed that AP and MAP presented the stronger fluorescence light signal in a peripheral area, and the fluorescence light signal spread to the internal cellular environment, which showed that the extent of protein oxidation increased. The values of protein surface hydrophobicity of beef samples from AP and MAP were significantly higher than that of the samples from VP (<0.05), while the protein solubility values of beef samples from AP and MAP were significantly lower than that of the samples from VP 10 d after the storage (<0.05). The degradation of desmin and titin of beef samples from AP and MAP was significantly lower compared to the VP 7 and 10 d after the storage (<0.05), which showed protein oxidation further inhibited the degradation of desmin and titin. Increased protein oxidation under AP and MAP inhibits the degradation of the key protein during postmortem cold storage.

refrigeration; packaging; protions; beef; air packaging; high oxygen modified atmosphere packaging; vacuum packaging; protein oxidation; protein degradation

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.038

TS251. 5

A

1002-6819(2018)-18-0308-07

2018-05-03

2018-08-18

江蘇省科技廳自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（BK20170146）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（17KJB550006）；南京曉莊學(xué)院高層次培育項(xiàng)目（2016NXY14）

扶慶權(quán)，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。Email：fuqingquan@126.com

扶慶權(quán)，張萬(wàn)剛，宋尚新，王海鷗，陳守江. 包裝方式對(duì)牛肉貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化及降解的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2018，34(18)：308－314. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.038 http://www.tcsae.org

Fu Qingquan, Zhang Wangang, Song Shangxin, Wang Haiou, Chen Shoujiang.Effects of different packaging methods on protein oxidation and degradation of beef during refrigeration storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(18): 308－314. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.038 http://www.tcsae.org