中溫和高溫發(fā)酵沼液營養(yǎng)源對半連續(xù)培養(yǎng)小球藻生長的影響

王忠江，司愛龍，劉 卓，李 澤，王麗麗，王貴祥

?

中溫和高溫發(fā)酵沼液營養(yǎng)源對半連續(xù)培養(yǎng)小球藻生長的影響

王忠江1,2，司愛龍1，劉 卓1，李 澤1，王麗麗1，王貴祥1

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 寒地農(nóng)業(yè)可再生資源利用技術(shù)與裝備黑龍江省重點實驗室，哈爾濱 150030）

為了解中溫發(fā)酵沼液和高溫發(fā)酵沼液培養(yǎng)微藻的系統(tǒng)性性能，選用FACHB-5和FACHB-8 2種小球藻，采用總氮2 417.63至2 554.37 mg/L，總磷13.44至16.91 mg/L的中溫35℃和高溫55℃雞糞厭氧發(fā)酵后沼液為營養(yǎng)源，在微藻培養(yǎng)液每天更新率10%的半連續(xù)培養(yǎng)條件下，研究更新的培養(yǎng)液中沼液添加比例為10% 、20% 和30%時2種沼液對微藻培養(yǎng)的影響。研究結(jié)果表明，添加比例為10%和20%時，2種小球藻均能很好地適應(yīng)各自的培養(yǎng)環(huán)境，試驗結(jié)束時,各試驗組的OD680均維持在2.40至2.69；但當(dāng)沼液添加比例為較高的30%時，2種小球藻的生長均受到明顯抑制，且FACHB-5與FACHB-8相比對高濃度沼液培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)，試驗結(jié)束時, FACHB-5試驗組的OD680維持在1.98至2.15，F(xiàn)ACHB-8試驗組的OD680維持在1.79至1.92。高溫沼液各試驗組的OD680均高于各自對應(yīng)的中溫沼液試驗組0.13以上，高溫55 ℃厭氧發(fā)酵后沼液更利于微藻培養(yǎng)。

發(fā)酵；生長；沼液；小球藻；半連續(xù)培養(yǎng)；添加比例

0 引 言

微藻作為一種生物質(zhì)能源，與其他能源植物相比，具有生長速度快、生物質(zhì)能含量高、產(chǎn)品附加值高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點[1-3]，隨著全球能源緊張的加劇，生物質(zhì)能源受到了各國學(xué)者的關(guān)注，尤其是微藻生物質(zhì)能源[4-5]。但在微藻的培養(yǎng)過程中需要添加大量的N、P等營養(yǎng)成分[6-7]，這在一定程度上增加了微藻的生產(chǎn)成本，限制了微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近些年，隨著養(yǎng)殖的集約化和規(guī)?；l(fā)展[8]，大中型沼氣工程也得到迅速推廣，通過厭氧發(fā)酵將畜禽糞便轉(zhuǎn)化為清潔能源沼氣，但這些沼氣工程在產(chǎn)生新能源沼氣的同時也產(chǎn)生了大量的沼液得不到及時有效的利用和處理，沼液中含有豐富的營養(yǎng)成分，如N、P等以及大量的有機(jī)物質(zhì)[9]，如果不加處理直接排放，將會對環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，因此如何妥善處理沼液已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。而沼液中富含的N、P等營養(yǎng)成分可以較好地滿足微藻生長的需要，微藻可吸收沼液中的這些營養(yǎng)成分，以滿足自身的生長發(fā)育[10-12]，利用沼液培養(yǎng)微藻不僅節(jié)約微藻的生產(chǎn)成本，而且還可凈化沼液中的污染物，具有良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益[13-15]。然而沼氣發(fā)酵原料的種類繁多，采用不同原料發(fā)酵得到的沼液成分也存在較大差異，以雞糞沼液為例，由于雞的消化道較短，對飼料的利用率較低，與畜類相比，雞糞中含有的營養(yǎng)成分更加豐富，特別是粗蛋白，與此同時雞糞中也含有一定量的添加劑等成分，這些特性對雞糞厭氧發(fā)酵后的沼液成分產(chǎn)生很大影響[16-17]，因此利用雞糞沼液培養(yǎng)微藻存在較大的不確定性，所以在前期研究中很多學(xué)者[18-19]均是將沼液滅菌后再進(jìn)行微藻的養(yǎng)殖試驗，進(jìn)而增加了微藻養(yǎng)殖成本，影響微藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的后續(xù)應(yīng)用和推廣。此外目前很多利用沼液培養(yǎng)微藻的研究還停留在批量培養(yǎng)階段，利用沼液半連續(xù)培養(yǎng)微藻的系統(tǒng)性研究較少。

此外目前的大中型沼氣工程普遍使用的是55 ℃的高溫厭氧發(fā)酵和35 ℃的中溫厭氧發(fā)酵工藝，55 ℃的高溫厭氧發(fā)酵工藝與35 ℃的中溫厭氧發(fā)酵工藝相比，不僅對厭氧發(fā)酵過程影響顯著，而且由于高溫厭氧發(fā)酵滅菌效果更為明顯，所以對經(jīng)過厭氧發(fā)酵后的沼液特性也有顯著影響，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20-21]報道經(jīng)55 ℃高溫厭氧發(fā)酵后獲得的沼液中的各種病原菌的數(shù)量均明顯低于35 ℃中溫厭氧發(fā)酵。所以中溫厭氧發(fā)酵和高溫厭氧發(fā)酵后沼液作為微藻培養(yǎng)的營養(yǎng)液，勢必會對后續(xù)的微藻生長形成一定的影響。而目前關(guān)于利用沼液培養(yǎng)微藻的相關(guān)研究所使用的沼液不是采用中溫發(fā)酵沼液就是沒有交代沼液的發(fā)酵條件，對于利用高溫發(fā)酵沼液用于微藻培養(yǎng)的報道更為少見，關(guān)于利用中溫和高溫發(fā)酵沼液培養(yǎng)微藻的系統(tǒng)性研究鮮見報道。

因此本試驗針對以上問題，以雞糞中溫35 ℃和高溫55 ℃厭氧發(fā)酵后的沼液為原料，在半連續(xù)培養(yǎng)條件下，通過對培養(yǎng)過程微藻培養(yǎng)液中OD680、氨氮、總氮和總磷指標(biāo)的檢測，系統(tǒng)研究未滅菌的中溫和高溫厭氧發(fā)酵雞糞沼液用于微藻半連續(xù)培養(yǎng)的可行性及較優(yōu)的沼液添加比例。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 沼液及預(yù)處理

試驗所使用的沼液來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能源實驗室，以雞糞為沼氣發(fā)酵的原料，沼氣厭氧發(fā)酵的溫度分別為中溫35 ℃和高溫55℃，發(fā)酵時間均為45 d，用孔徑為0.075 mm尼龍標(biāo)準(zhǔn)篩去除沼氣發(fā)酵后剩余物中的大顆粒物，然后利用高速離心機(jī)（Sigma 3-30K）在10 000 r/min下離心10 min去除小顆粒物獲得本試驗所用沼液，之后將沼液儲存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。經(jīng)過固液分離及離心處理后，35 ℃中溫厭氧發(fā)酵沼液總氮質(zhì)量濃度為2 417.625 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度為2 218.273 mg/L，總磷質(zhì)量濃度為16.914 mg/L，化學(xué)需氧量（COD）為10 021.82 mg/L，pH值為8.25，濁度為698 NTU，黏度為2.68 mPa·s。55℃高溫發(fā)酵沼液總氮質(zhì)量濃度為2 554.372 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度為2 376.24 mg/L，化學(xué)需氧量（COD）為10 104.13 mg/L，總磷質(zhì)量濃度為13.448 mg/L，pH值為8.18，濁度為653 NTU，黏度為2.52 mPa·s。

1.1.2 藻種

本試驗以微藻能源化利用過程中研究較多的小球藻為研究對象[22-23]，選取蛋白核小球藻（）與普通小球藻（）作為試驗藻種，2種藻種均來自中國科學(xué)院水生生物研究所，藻種編號分別為FACHB-5（5號藻種，No.5）和FACHB-8（8號藻種，No.8）。

1.2 試驗方法及條件

先將體積分?jǐn)?shù)10%的沼液加入到BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行藻種馴化，待小球藻達(dá)到生長對數(shù)期后，加入BG11培養(yǎng)基補(bǔ)充到試驗初始時的體積（即700 mL），間隔1 d后正式開始半連續(xù)培養(yǎng)，每天的更新率均為微藻培養(yǎng)液總體積的10%，由于本研究是中溫35 ℃和高溫55 ℃厭氧發(fā)酵后沼液進(jìn)行微藻培養(yǎng)對比的初步研究，并且在對比不同沼液對微藻培養(yǎng)影響的同時，也分析了不同藻種在不同沼液中的生長狀況，所以作者在前期預(yù)試驗的基礎(chǔ)上選擇了10%、20%和30% 3個比較有代表性的試驗梯度，試驗時將體積分?jǐn)?shù)10%、20%和30%的沼液與蒸餾水混合作為每天更新的培養(yǎng)液使用。使用人工氣候培養(yǎng)箱（OBY-Q600-SEI，常州歐邦電子有限公司）培養(yǎng)微藻，在溫度為（26±1）℃，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光照時間采用目前應(yīng)用較多的24 h連續(xù)光照[24-25]，同時使用旋渦式氣泵（HG-180，臺灣亞士霸電機(jī)集團(tuán)有限公司）向培養(yǎng)液持續(xù)通入空氣，通氣量設(shè)定為1.5 L/min，在空氣進(jìn)入培養(yǎng)液前使用0.2m 濾膜進(jìn)行過濾。

該試驗使用1 000 mL的三角瓶作為小球藻培養(yǎng)的容器，培養(yǎng)液的體積設(shè)置為700 mL，分別由70 mL沼液、560 mL BG11培養(yǎng)基和在不調(diào)節(jié)pH值條件下達(dá)到生長對數(shù)期的70 mL藻種組成，每組有2個重復(fù)，先進(jìn)行藻種馴化，之后開始半連續(xù)培養(yǎng)，馴化和半連續(xù)培養(yǎng)周期均為10 d，每天進(jìn)行更新取樣，直接測OD680，樣品在10 000 r/min 條件下離心取上清液，經(jīng)0.45m 濾膜過濾后測定其中的總氮、氨氮和總磷質(zhì)量濃度。

1.3 成分指標(biāo)測定

采用光密度法測定生物量[26]，光密度法：取出小球藻藻液，在680 nm吸收波長下用紫外可見分光光度計（T6 新世紀(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）測定其光密度OD680[27]，以此確定小球藻在半連續(xù)培養(yǎng)過程中的相對生長量?？偭缀桶钡褂煤商mSKALAR連續(xù)流動分析儀測定[28-29]?？偟獪y定采用凱氏定氮法（Kjeldahl method）測定，參照GB11891-89《水中凱氏氮的測定法》[30]。采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS V20進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻生長變化

圖1為中溫和高溫厭氧發(fā)酵沼液用于小球藻培養(yǎng)時小球藻的生長曲線。

圖1 小球藻的生長曲線

圖1a為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例中溫厭氧發(fā)酵沼液的生長曲線。從圖1a中可以看出，在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下，當(dāng)沼液添加比例在10%~30%范圍內(nèi)5號藻種和8號藻種在前4 d均未受到明顯的抑制，而且除了添加比例為10%的2個試驗組在第1天沒有明顯變化外，6個試驗組在前4 d的整體變化趨勢相一致，OD值均呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，這與之前的批式試驗[22]的結(jié)果存在較大的差異，前期的批式試驗過程發(fā)現(xiàn)在試驗的前2 d各試驗組的OD值均沒有明顯的升高趨勢，小球藻的生長均出現(xiàn)了明顯的抑制作用，而在本試驗的半連續(xù)試驗過程未出現(xiàn)這一現(xiàn)象，這主要是由于批式培養(yǎng)時沼液是一次性加入，沼液添加量為總培養(yǎng)液體積的10%，20%和30%，對小球藻培養(yǎng)體系的沖擊負(fù)荷較大，會在一定程度上對小球藻產(chǎn)生抑制作用。而本試驗采用的是半連續(xù)培養(yǎng)的方式，每天培養(yǎng)液的更新率僅為10%，且這些10%培養(yǎng)液中僅有10%至30%為沼液，所以半連續(xù)培養(yǎng)時各試驗組培養(yǎng)液中的沼液是從1%至3%逐漸增加，也就是沼液是逐漸加入，培養(yǎng)液中的沼液濃度是逐漸增加的，對小球藻生長的沖擊相對較小，所以才會出現(xiàn)上述現(xiàn)象。從圖1中還可以看出沼液添加比例為30%的2個試驗組的OD值在第4天達(dá)到各自的最大值，之后開始迅速降低，這說明沼液添加比例為30%組隨著試驗的進(jìn)行培養(yǎng)液中的沼液得不到及時有效地利用而發(fā)生積累并超出了小球藻的承受能力，進(jìn)而對小球藻的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。小球藻的生長之所以出現(xiàn)抑制，一方面是由于COD等有機(jī)物質(zhì)的積累所導(dǎo)致，另一方面隨著試驗的進(jìn)行，培養(yǎng)液濁度也逐漸增加，高濁度會影響光合有效輻射，從而抑制小球藻的生長，導(dǎo)致小球藻的生物量積累量下降[31]。而沼液添加比例為10%和20%各試驗組的OD值分別在第6天和第5天達(dá)到各自的最大值，之后開始逐漸趨于穩(wěn)定并略有下降，且試驗后期10%和20%各試驗組的OD值差別較小，這說明沼液添加比例為10%和20%時比較適宜小球藻的生長。從圖1中還可以看出當(dāng)沼液添加比例較低時2種藻種的生長未表現(xiàn)出明顯的差別，但當(dāng)沼液添加比例升高到30%時，在整個試驗周期內(nèi)5號藻種試驗組的OD值始終高于8號藻種試驗組，這說明2種藻種在低濃度的沼液培養(yǎng)基中均能較好地進(jìn)行生長，但隨著培養(yǎng)液中沼液濃度的增加，5號藻種的生長狀況明顯優(yōu)于8號藻種，在對沼液的適應(yīng)能力方面5號藻種略優(yōu)。

圖1b為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例高溫厭氧發(fā)酵沼液的生長曲線。從圖1b中可以看出，在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下，高溫沼液各試驗組的整體變化規(guī)律與圖1a中溫厭氧發(fā)酵沼液各試驗組的趨勢基本一致，即在試驗前期各試驗組的小球藻生長均未受到明顯的抑制，試驗的中后期添加比例較少的10%和20%各試驗組的OD值逐漸趨于穩(wěn)定，而添加比例較多的30%試驗組的OD值出現(xiàn)明顯的下降趨勢，說明30%的添加比例不論對中溫發(fā)酵沼液還是高溫發(fā)酵沼液試驗組均是一個小球藻很難適應(yīng)的比例。從圖1中還可以看出雖然中溫沼液和高溫沼液各試驗組的OD值整體變化規(guī)律基本一致，但高溫沼液各試驗組的OD值的最高值略高于中溫沼液各試驗組，經(jīng)顯著性分析后差異達(dá)到極顯著水平（<0.01），且添加比例較少的10%和20%各試驗組的OD值穩(wěn)定后也呈現(xiàn)出高溫沼液組略高于中溫沼液組，經(jīng)顯著性分析添加比例為10%的試驗組差異達(dá)到顯著水平（<0.05），添加比例為20%的試驗組達(dá)到極顯著水平（<0.01）。

2.2 小球藻培養(yǎng)液氨氮的變化

圖2為中溫和高溫厭氧發(fā)酵沼液用于小球藻培養(yǎng)時培養(yǎng)液中氨氮質(zhì)量濃度的變化情況。

圖2 小球藻培養(yǎng)液氨氮質(zhì)量濃度的變化

圖2a為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例中溫厭氧發(fā)酵沼液條件下培養(yǎng)液中氨氮的變化情況。從圖2a中可以看出，沼液添加比例為10%和20%的4個試驗組的氨氮變化規(guī)律基本一致，即在試驗前期（前4 d）一直處于上升趨勢，之后開始逐漸趨于穩(wěn)定，最終其氨氮質(zhì)量濃度分別維持在22和45 mg/L左右。當(dāng)沼液添加比例為較高濃度的30%時，由于小球藻生長后期受到明顯的抑制，因此在試驗結(jié)束時氨氮的質(zhì)量濃度較高，由試驗開始時的0.38 mg/L上升到試驗結(jié)束時的110.66 mg/L。在試驗后5 d，8號藻種的氨氮質(zhì)量濃度始終高于5號藻種，這與圖1中小球藻的生長趨勢相對應(yīng)，在圖1中當(dāng)沼液添加比例為30%時，在試驗的中后期小球藻的生長速率降低，且呈現(xiàn)出5號藻種試驗組的小球藻生長狀況略優(yōu)于8號藻種的現(xiàn)象，這就導(dǎo)致對沼液中氨氮的利用量減少，使培養(yǎng)液中的氨氮濃度迅速升高，且在試驗中后期呈現(xiàn)出5號藻種試驗組的氨氮質(zhì)量濃度低于8號藻種試驗組的現(xiàn)象。

圖2b為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例高溫厭氧發(fā)酵沼液時培養(yǎng)液中氨氮的變化情況。從圖2b中可以看出，高溫厭氧發(fā)酵沼液各試驗組的氨氮質(zhì)量濃度的整體變化規(guī)律與中溫厭氧發(fā)酵沼液各試驗組基本一致，即當(dāng)沼液添加比例為10%和20%較低水平時，隨著試驗的進(jìn)行培養(yǎng)液的氨氮質(zhì)量濃度先緩慢升高后便基本維持在各自較穩(wěn)定的水平，而當(dāng)沼液添加比例為30%的較高水平時，培養(yǎng)液的氨氮質(zhì)量濃度隨試驗的進(jìn)行始終處于上升趨勢。此外對比圖2a和2b還可以看出，當(dāng)沼液的添加比例為20%時，中溫發(fā)酵沼液試驗組和高溫發(fā)酵沼液組培養(yǎng)液中的氨氮質(zhì)量濃度的變化規(guī)律略有差異，中溫發(fā)酵沼液試驗組和高溫發(fā)酵沼液試驗組相比，培養(yǎng)液中的氨氮質(zhì)量濃度上升速度更快，且穩(wěn)定后培養(yǎng)液中的氨氮質(zhì)量濃度高于高溫發(fā)酵沼液試驗組，經(jīng)顯著性分析后差異達(dá)到顯著水平（<0.05），這與圖1中的小球藻生長曲線相對應(yīng)。

2.3 小球藻培養(yǎng)液總氮的變化

圖3為中溫和高溫厭氧發(fā)酵沼液用于小球藻培養(yǎng)時培養(yǎng)液中總氮濃度的變化情況。

圖3 小球藻培養(yǎng)液總氮濃度的變化

圖3a為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例中溫厭氧發(fā)酵沼液條件下溶液中總氮的變化情況。從圖3a可以看出，沼液添加比例為10%和20%的4個試驗組的總氮變化規(guī)律基本相一致，即在試驗前期（前4 d）一直處于上升趨勢，之后逐漸趨向于穩(wěn)定，最終其總氮質(zhì)量濃度分別維持在30和60 mg/L左右。當(dāng)沼液添加比例為30%時由于小球藻生長后期受到明顯的抑制，因此在試驗結(jié)束時總氮濃度較高，而且還有上升的趨勢，其總氮質(zhì)量濃度由試驗開始時的3.22 mg/L上升到試驗結(jié)束時的130.79 mg/L，在試驗的后期，8號藻種的總氮濃度始終高于5號藻種，這與圖1中小球藻的生長趨勢相一致。

圖3b為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例高溫厭氧發(fā)酵沼液條件下溶液中總氮的變化情況，從圖3b中可以看出，高溫厭氧發(fā)酵沼液各試驗組的總氮變化規(guī)律與中溫厭氧發(fā)酵沼液各試驗組基本一致。結(jié)合圖2和圖3 還可以看出總氮的變化規(guī)律和氨氮的變化規(guī)律基本一致，且培養(yǎng)液中總氮和氨氮質(zhì)量濃度的差別也較小，這主要是由于厭氧發(fā)酵后的沼液中的氮素主要以氨氮的形式存在[32]，并且在有氨氮存在的情況下小球藻將優(yōu)先利用氨氮[27]，所以才會出現(xiàn)上述現(xiàn)象。

2.4 小球藻培養(yǎng)液總磷的變化

圖4為中溫和高溫厭氧發(fā)酵沼液用于小球藻培養(yǎng)時培養(yǎng)液中總磷濃度的變化情況。

圖4 小球藻培養(yǎng)液總磷濃度的變化

圖4a為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例中溫厭氧發(fā)酵沼液時溶液中總磷的變化情況。從圖4a中可以看出，當(dāng)更新添加比例為10%和20%沼液時，4個試驗組培養(yǎng)液中總磷均是先下降，然后最終趨向穩(wěn)定，當(dāng)試驗結(jié)束時分別維持在0.25和0.55 mg/L，在試驗未開始時培養(yǎng)液中總磷濃度較高，這是由于在前期馴化藻種結(jié)束后，加入BG11培養(yǎng)基補(bǔ)充馴化過程中損失的體積，從而增加了培養(yǎng)液總磷濃度。當(dāng)更新添加比例為30%沼液時，培養(yǎng)液中總磷濃度先下降后上升，然后趨于穩(wěn)定，總磷之所以出現(xiàn)這種趨勢，一方面是沼液的添加比例較高，另一方面是小球藻的生長受到抑制，不能很好地吸收培養(yǎng)液中的磷。

圖4b為2種藻種在半連續(xù)培養(yǎng)環(huán)境下添加不同比例高溫厭氧發(fā)酵沼液條件下培養(yǎng)液中總磷的變化情況。從圖4b中可以看出，高溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組和中溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組培養(yǎng)液中的總磷變化規(guī)律差別較大，當(dāng)更新添加比例為10%和20%沼液時，4個試驗組培養(yǎng)液中總磷的變化趨勢相一致，均是先下降，然后最終趨向穩(wěn)定，當(dāng)試驗結(jié)束時，4個試驗組的總磷質(zhì)量濃度均維持在0.25 mg/L的較低水平，這與圖1中的小球藻生長情況相對應(yīng)，當(dāng)沼液添加比例為20%時，高溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組的小球藻整體生長狀況優(yōu)于中溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組，對培養(yǎng)液中磷的消耗量更大，所以才出現(xiàn)高溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組沼液添加比例為20%時培養(yǎng)液中的磷質(zhì)量濃度低于中溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組的現(xiàn)象。當(dāng)更新添加比例為30%沼液時，培養(yǎng)液中總磷的濃度先下降后趨于穩(wěn)定，由試驗開始的2.01 mg/L下降到試驗結(jié)束時的1.13 mg/L，這低于中溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組，這與圖1中沼液添加比例30%時高溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組的小球藻生長狀況優(yōu)于中溫厭氧發(fā)酵沼液試驗組的現(xiàn)象相對應(yīng)。

3 討 論

在半連續(xù)培養(yǎng)條件下，當(dāng)更新的培養(yǎng)液中雞糞沼液添加比例為較低的10%和20%時，5號和8號小球藻均能很好地適應(yīng)各自的沼液培養(yǎng)環(huán)境并迅速生長，且呈現(xiàn)高溫55 ℃厭氧發(fā)酵后的沼液用于小球藻半連續(xù)培養(yǎng)的整體表現(xiàn)優(yōu)于中溫35 ℃厭氧發(fā)酵后沼液，小球藻的生長速率更高。5號小球藻在中溫10%試驗組中，OD680由開始時的2.25上升到結(jié)束時的2.45，最高值達(dá)到2.61；中溫20%試驗組中，OD680由開始時的2.10上升到結(jié)束時的2.40，最高值達(dá)到2.74；在高溫10%試驗組中，OD680由開始時的2.21上升到結(jié)束時的2.69，最高值達(dá)到2.88；高溫20%試驗組中，OD680由開始時的2.30上升到結(jié)束時的2.64，最高值達(dá)到2.88。8號小球藻在中溫10%試驗組中，OD680由開始時的2.10上升到結(jié)束時的2.40，最高值達(dá)到2.61；中溫20%試驗組中，OD680由開始時的2.00上升到結(jié)束時的2.47，最高值達(dá)到2.70；在高溫10%試驗組中，OD680由開始時的2.05上升到結(jié)束時的2.64，最高值達(dá)到2.71；高溫20%試驗組中，OD680由開始時的2.21上升到結(jié)束時的2.61，最高值達(dá)到2.90。但當(dāng)雞糞沼液添加比例為30%時，在試驗后期5號和8號小球藻的生長均受到抑制，5號小球藻比8號小球藻生長的更好，5號小球藻與8號小球藻相比對高濃度沼液培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)。5號小球藻在中溫30%試驗組中，OD680由開始時的2.14下降到結(jié)束時的1.98，在第4天最高值達(dá)到2.65，5號小球藻在高溫30%試驗組中，OD680由開始時的2.35下降到結(jié)束時的2.15，在第4天最高值達(dá)到2.55；8號小球藻在中溫30%試驗組中，OD680由開始時的2.02下降到結(jié)束時的1.79，在第4天最高值達(dá)到2.61，8號小球藻在高溫30%試驗組中，OD680由開始時的2.12下降到結(jié)束時的1.92，在第5天最高值達(dá)到2.71。

在本試驗中，各個試驗組均不同程度出現(xiàn)了小球藻的生長抑制點，先前有研究[33]發(fā)現(xiàn)對于藻類當(dāng)培養(yǎng)液中氮磷比大于20時，具有磷限制性。通過分析本試驗數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，在試驗過程中各試驗組的氮磷比均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，其中沼液添加比例為10%和20%試驗組的氮磷比由試驗開始時的10以下逐漸升高到試驗中后期的200和83，而2個試驗組的微藻生長規(guī)律則均呈現(xiàn)試驗前期生長速率較快，試驗中后期基本維持穩(wěn)定的趨勢。而沼液添加比例為30%試驗組的氮磷比由試驗開始時的10以下逐漸升高到試驗中后期的65，微藻生長規(guī)律則呈現(xiàn)試驗前期生長速率較快，試驗中后期微藻的生長速率逐漸下降的趨勢。即沼液添加比例為10%和20%試驗組的氮磷比雖然始終處于逐漸升高的趨勢，且試驗結(jié)束時氮磷比處于較高水平（氮磷比為200和83），但微藻的整體生長水平卻始終維持在較高水平，而沼液添加比例為30%試驗組的氮磷比雖然也始終處于逐漸升高的趨勢，且試驗中后期氮磷比不是很高（氮磷比為65），但卻對試驗中后期微藻的生長產(chǎn)生較大的抑制作用，所以作者認(rèn)為在本研究中氮磷比不是影響微藻生長的主要原因，作者認(rèn)為30%試驗組試驗中后期微藻生長受到抑制主要是由于培養(yǎng)液中的氮素濃度相對較高，以及培養(yǎng)液的濁度較大影響光照等原因所致。

4 結(jié) 論

1）半連續(xù)培養(yǎng)條件下，當(dāng)更新的培養(yǎng)液中厭氧發(fā)酵雞糞沼液添加比例為10%和20%時，5號和8號小球藻均能很好地適應(yīng)各自的沼液培養(yǎng)環(huán)境并迅速生長；試驗結(jié)束時，各試驗組的吸光度（OD680）值均維持在2.40至2.69，各試驗組的OD680最大值均維持在2.61至2.90。但當(dāng)雞糞沼液添加比例為30%時，在試驗后期5和8號小球藻的生長均受到抑制，5號小球藻比8號小球藻生長的更好，試驗結(jié)束時, 5號小球藻試驗組的OD680值維持在1.98至2.15，8號小球藻試驗組的OD680值維持在1.79至1.92，5號小球藻與8號小球藻相比對高濃度沼液培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)。

2）高溫55 ℃厭氧發(fā)酵后的沼液用于小球藻半連續(xù)培養(yǎng)的整體表現(xiàn)優(yōu)于中溫35 ℃厭氧發(fā)酵后沼液，高溫沼液各試驗組的OD680值均高于各自對應(yīng)的中溫沼液各試驗組0.13以上，在高溫沼液的培養(yǎng)液中小球藻生長速率更高。

[1] Pienkos P T, Darzins A. The promise and challenges of microalgal-derived biofuels[J]. Biofuels Bioprod Bioref, 2009, 3(4): 431－440.

[2] Gustavo B Leite, Ahmed E M Abdelaziz, Patrick C Hallenbeck. Algal biofuels: Challenges and opportunities[J]. Bioresource Technology, 2013, 145: 134－141.

[3] Chiu Shengyi, Kao Chienya, Chen Tsaiyu, et al. Cultivation of microalgal Chlorella for biomass and lipid production using wastewater as nutrient resource[J]. Bioresource Technology, 2015, 184: 179－189.

[4] Li Y, Horsman M, Wu N, et al. Biofuels from microalgae[J]. Biotechnology progress, 2008, 24(4): 815－820.

[5] Trivedi J, Aila M, Bangwal D P, et al. Algae based biorefinery-How to make sense[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2015, 47: 295－307.

[6] Racharaks Ratanachat, Ge Xumeng, Li Yebo. Cultivation of marine microalgae using shale gas flowback water and anaerobic digestion effluent as the cultivation medium[J]. Bioresource Technology, 2015, 191: 146－156.

[7] Logan Christenson, Ronald Sims. Production and harvesting of microalgae for wastewater treatment, biofuels and bioproducts[J]. Biotechnology Advances, 2011, 29: 686－702.

[8] Sakar S, Yetilmezsoy K, Kocak E．Anaerobic digestion technology in poultry and livestock waste treatment：A literature review[J]．Waste Management and Research, 2009, 27(1)：3－18.

[9] 沈其林，單勝道，周健駒，等．豬糞發(fā)酵沼液成分測定與分析[J]．中國沼氣，2014，32(3)：83－86． Shen Qilin, Shan Shengdao, Zhou Jianju, et al. Determination and analysis of compositions in biogas slurry produced by swine manure digestion[J]. China Biogas, 2014, 32(3): 83－86. (in Chinese with English abstract)

[10] Ashish K Sahu, Jon Siljudalen, Tina Trydal, et al. Utilisation of wastewater nutrients for microalgae growth for anaerobic co-digestion[J]. Journal of Environment Management, 2013, 122: 113－120.

[11] Cai Ting, Park Stephen Y, Racharaks Ratanachat, et al. Cultivation ofusing anaerobic digestion effluent as a nutrient source for biofuel production[J]. Applied Energy, 2013, 108: 486－492.

[12] Lam M K, Lee K T. Potential of using organic fertilizer to cultivate Chlorella vulgaris for biodiesel production[J]. Applied Energy, 2012, 94: 303－308.

[13] Xin M, Yang J M, Xu X, et al. Biodiesel production from oleaginous micro organizations[J]. Renewable Energy, 2008, 34(1): 1－5.

[14] Codes I, Baul M, Benoit G. Tetracycline removal during wastewater treatment in high-rate algal ponds[J]. Journal of Hazardous Materials, 2012, 229: 446－449.

[15] Ji Fang, Zhou Yuguang, Pang Aiping, et al. Fed-batch cultivation of. in anaerobic digestion wastewater for improved nutrient removal and biodiesel production[J]. Bioresource Technology, 2015, 184: 116－122.

[16] 王峰，嚴(yán)瀟南，楊海真．雞糞厭氧發(fā)酵沼液達(dá)標(biāo)處理工藝研究[J]．農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2012，43(5)：84－90． Wang Feng, Yan Xiaonan, Yang Haizhen. Treatment process of anaerobically digested effluent of chicken manure for meeting the discharging standard[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2012, 43(5): 84－90. (in Chinese with English abstract)

[17] Singh M, Reynolds D L, Das K C. Microalgal system for treatment of effluent from poultry litter anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(23): 10841－10848.

[18] 王欽琪，李環(huán)，王翠，等．沼液培養(yǎng)的普通小球藻對CO2的去除[J]．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2011，17(5)：700－705． Wang Qinqi, Li Huan, Wang Cui, et al. Reduction of CO2by Chlorella vulgaris cultured in biogas slurry[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2011, 17 (5): 700－705. (in Chinese with English abstract)

[19] 王翠，李環(huán)，韋萍．沼液培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)油脂的研究[J]．環(huán)境工程學(xué)報，2010，4(8)：1753－1758． Wang Cui, Li Huan, Wei Ping. Study on microbial oil production with chlorella cultured in biogas slurry[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2010, 4(8): 1753－1758. (in Chinese with English abstract)

[20] 李明，魏曉明，耿如林，等.沼氣發(fā)酵溫度對沼液糞大腸桿菌群去除效果的研究[J]．農(nóng)機(jī)化研究，2015(5)：246－249． Li Ming, Wei Xiaoming, Geng Rulin, et al. Effects of anaerobic fermentation temperature on extermination of fecal coliform in biogas effluent[J]. Journal of Agricultural Mechanization Research, 2015(5): 246-249. (in Chinese with English abstract)

[21] 許智，葉小梅，常志州，等．溫度對廚余垃圾和人糞尿污水混合液的水解酸化影響[J]．中國沼氣，2011，29(3)：9－12． Xu Zhi, Ye Xiaomei, Chang Zhizhou, et al. Temperature influence on hydrolysis and acidogenesis of kitchen and toilet waste mixture[J]. China Biogas, 2011, 29(3): 9－12. (in Chinese with English abstract)

[22] 王忠江，隋超，王澤宇，等．小球藻對不同沼液添加量培養(yǎng)液的適應(yīng)性及凈化效果[J]．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2017，33(3)：221－226． Wang Zhongjiang, Sui Chao, Wang Zeyu, et al. Adaptation of chlorella to culture liquid with different biogas slurry adding proportion and its purified effect[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE), 2017, 33(3): 221－226.(in Chinese with English abstract)

[23] 周連寧，王波，吳鋒，等．培養(yǎng)條件對小球藻生長及油脂積累的影響研究[J]．生物學(xué)雜志，2015，32(3)：46－60． Zhou Lianning, Wang Bo, Wu Feng, et al. The impact of different culture conditions on the chlorella’s growth and fat accumulation[J]. Biology Journal, 2015, 32(3): 46－60.(in Chinese with English abstract)

[24] 李巖，周文廣，張曉東，等．微藻培養(yǎng)技術(shù)處理豬糞厭氧發(fā)酵廢水效果[J]．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2011，27(增刊1)：101－104． Li Yan, Zhou Wenguang, Zhang Xiaodong, et al. Effect of microalgae culture on treatment of wastewater from anaerobic digested swine manure [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2011, 27(Supp.1): 101－104. (in Chinese with English abstract)

[25] Fen Tan, Zhi Wang, Siyu Zhouyang, et al. Nitrogen and phosphorus removal coupled with carbohydrate production by five microalgae cultures cultivated in biogas slurry[J]. Bioresource Technology, 2016, 221: 385－393.

[26] II-Seung Yang, EI-Sayed Salama, Jong-Oh Kimet, et al. Cultivation and harvesting of microalgae in photobioreactor for biodiesel production and simultaneous nutrient removal[J]. Energy Conversion and Management, 2016, 117: 54－62.

[27] 霍書豪，陳玉碧，劉宇鵬，等．添加沼液的BG11營養(yǎng)液微藻培養(yǎng)試驗[J]．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2012，28(8)：241－246． Huo Shuhao, Chen Yubi, Liu Yupeng, et al. Experiment on microalgae cultivation in BG11 nutrient solution adding biogas slurry[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2012, 28(8): 241－246. (in Chinese with English abstract)

[28] 劉倩．連續(xù)流動分析儀法同時測定污水中總氮、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮[J]．工業(yè)水處理，2009，29(8)：72－74． Liu Qian. Simultaneous determination of the total nitrogen, ammonium-nitrogen, nitrite-nitrogen, and nitrate-nitrogen in wastewater by continuous fluxion analysis[J]. Industrial Water Treatment, 2009, 29(8): 72－74.(in Chinese with English abstract)

[29] 夏倩，劉凌，王流通，等．連續(xù)流動分析儀在水質(zhì)分析中的應(yīng)用[J]．分析儀器，2012(2)：64－68． Xia Qian, Liu Ling, Wang Liutong, et al. Application of continuous flow analyzer in water analysis[J]. Analytical Instruments, 2012(2): 64－68.(in Chinese with English abstract)

[30] 楊珺，張效蘇，吳忠祥，等．水質(zhì)凱氏氮標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究[J]．環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2002，14(1)：14－19． Yang Jun, Zhang Xiaosu, Wu Zhongxiang, et al. Research about standard samples of water quality-determination of Kjeldahl nitrogen[J]. Environmental Monitoring Management and Technology, 2002, 14(1): 14－19.(in Chinese with English abstract)

[31] Wang L, Li Y, Chen P, et al. Anaerobic digested dairy manure as a nutrient supplement for cultivation of oil-rich green microalgae Chlorella sp[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(8): 2623－2628.

[32] Yang Anqi, Zhang Guangming, Yang Guang, et al. Denitrification of aging biogas slurry from livestock farm by photosynthetic bacteria[J]. Bioresource Technology, 2017, 232: 408－411.

[33] Facundo J M, Nishio N, Nagai S, et al. Enhancement of biomass and pigment production during growth of Spirulina platensis in mixotrophic culture[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1995, 62(2): 159－164.

Effect of biogas slurry of medium and high temperature digestion on growth of chlorella with semi-continuous culture

Wang Zhongjiang1,2, Si Ailong1, Liu Zhuo1, Li Ze1, Wang Lili1, Wang Guixiang1

(1.,,150030,; 2.,150030,)

The experimental Chlorella ofFACHB-5 andFACHB-8 was cultured in a 1 000 mL Erlenmeyer flask with 700 mL nutrient solution in an artificial climate incubator. The culture temperature, illuminance, airflow rate and continuous illumination time were (26±1) ℃, 4 000 lx, 1.5 L/min and 24 h, respectively. The biogas slurry of chicken manure achieved after anaerobic digestion at medium temperature (35 ℃) and high temperature (55 ℃) for 45 d was used as nutrient source for Chlorella culture. The main compositions and characteristics of biogas slurry digested at 35 and 55 ℃ were 2 417.63 and 2 554.37 mg/L for total nitrogen, 2 218.27 and 2 376.24 mg/L for ammonium nitrogen, 16.91 and 13.44 mg/L for total phosphorus, 10 021.82 and 10 104.13 mg/L for chemical oxygen demand (COD), 8.25 and 8.18 for pH value, 698 and 653 NTU for turbidity, and 2.68 and 2.52 mPa·s for viscosity, respectively. The semi-continuous culture ofwas realized by discharging nutrient solution of 10% and adding new nutrient solution of 10% at the same time daily. Furthermore, the addition ratios of unsterilized biogas slurry in daily new nutrient solution were 10%, 20% and 30%, respectively. Effects of 3 different addition ratios of unsterilized biogas slurry digested at 35 and 55 ℃ on the semi-continuous culture of Chlorella were studied systematically based on the analysis of nutrient solution during Chlorella culture including OD680, total nitrogen, ammonium nitrogen, total phosphorus, and so on. The results showed that theFACHB-5 andFACHB-8 could adapt the culture environment well and grow rapidly when the addition ratios of unsterilized biogas slurry in daily new nutrient solution were 10% and 20%. Furthermore, the OD680values of 2 types ofwere maintained at 2.40-2.69 at the end ofculture for 10 d. However, the growth of FACHB-5 and FACHB-8 in the later period of culture experiment was restrained significantly when the addition ratio of unsterilized biogas slurry in daily new nutrient solution was 30%. Furthermore, the growth rates and adaptive capacity of FACHB-5 in the nutrient solution containing more biogas slurry were better than that of FACHB-8. A similar fluctuation trend was achieved in OD680of different comparative samples with biogas slurry addition. However, the OD680values of comparative samples with 55 ℃ digestive biogas slurry were over 0.13 higher than that of comparative samples with 35 ℃ digestive biogas slurry, especially for the comparative samples with biogas slurry of 10% and 20% addition ratios. Moreover, the OD680values of FACHB-5 and FACHB-8 were maintained at 1.98-2.15 and 1.79-1.92 at the end of Chlorella culture for 10 d, respectively. Therefore, the effects of biogas slurry digested at 55 ℃ on semi-continuous culture of Chlorella were superior than that of biogas slurry digested at 35 ℃. The results supply references for the theoretical research and subsequent large-scale application of Chlorella culture using biogas slurry digested at different temperatures.

fermentation; growth; biogas slurry; chlorella; semi-continuous culture; appending proportion

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.029

Q938

A

1002-6819(2018)-18-0235-07

2018-04-22

2018-08-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2014AA022001）；國家自然科學(xué)基金（51406032）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金（20131792）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項項目（ZY17C05）聯(lián)合資助

王忠江，教授，博士，主要從事農(nóng)業(yè)生物環(huán)境與能源工程領(lǐng)域研究。E-mail：neauwzj@126.com

王忠江，司愛龍，劉 卓，李 澤，王麗麗，王貴祥. 中溫和高溫發(fā)酵沼液營養(yǎng)源對半連續(xù)培養(yǎng)小球藻生長的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2018，34(18)：235－241. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.029 http://www.tcsae.org

Wang Zhongjiang, Si Ailong, Liu Zhuo, Li Ze, Wang Lili, Wang Guixiang. Effect of biogas slurry of medium and high temperature digestion on growth of chlorella with semi-continuous culture[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(18): 235－241. (in Chinese with English abstract) doi: 10.11975/j.issn.1002-6819.2018.18.029 http://www.tcsae.org