響應(yīng)曲面法優(yōu)化魚(yú)腥草多糖提取工藝及抗氧化活性測(cè)定

潘巧靈，姜 波*，于 靜，冉乾鴻，李歡歡

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 116600）

近年來(lái)，中醫(yī)藥行業(yè)越發(fā)引起人們的關(guān)注，而壯藥等民族醫(yī)藥更是因其特有的民族色彩而為人們所關(guān)注。魚(yú)腥草，學(xué)名蕺菜，又名折耳根，多生長(zhǎng)于廣西等中國(guó)西南部地區(qū)，因其氣味略帶腥臭，故名魚(yú)腥草。屬胡椒目三白草科蕺菜屬，常用的魚(yú)腥草為蕺菜的地上干燥部分。性寒涼，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、除濕利尿等作用，用于熱毒、濕邪、疾熱為患的肺癰等癥。經(jīng)研究表明，魚(yú)腥草中含有黃酮類、甾醇類、生物堿、維生素、有機(jī)酸、水溶性多糖等多種物質(zhì)，是極具開(kāi)發(fā)潛力的植物資源[1-3]。但目前人們?cè)谏钪薪佑|到魚(yú)腥草的主要方式，還是采用直接食用或顆粒飲用等方式，魚(yú)腥草成分提取的相關(guān)產(chǎn)品較少，本文旨在對(duì)魚(yú)腥草水溶性粗多糖的提取工藝進(jìn)行研究，以尋找最優(yōu)提取方案，同時(shí)對(duì)多糖的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚(yú)腥草（購(gòu)買(mǎi)于廣西南寧市藥房，原產(chǎn)于廣西），乙醇（95%），葡萄糖、苯酚、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、番紅花紅、EDTA-Na2、硫酸亞鐵、H2O2、抗壞血酸（Vc）、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、濃鹽酸，以上試劑均為分析純。

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平，上海奧豪斯公司；儀表恒溫水浴鍋，金北德工貿(mào)有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器制造廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；循環(huán)式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城儀廠；超聲清洗設(shè)備，大連開(kāi)發(fā)區(qū)博信超聲設(shè)備有限公司；UV2201型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)腥草多糖提取。將干燥魚(yú)腥草用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，80目過(guò)篩，精確稱取2.00g魚(yú)腥草固體粉末，一定液料比加水浸泡，恒溫水浴浸出，抽濾去渣取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，加入5倍體積的95%乙醇，4℃冰箱靜置24h，多糖沉淀，以4000r/min離心15min，并用無(wú)水乙醇洗滌，取沉淀蒸干得水溶性多糖，研磨待用[4]。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。稱取葡萄糖0.1g加入至100mL容量瓶并用蒸餾水定容，制得1.0mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中，去離子水定容，制得 10、20、30、40、50μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述配制的各濃度的葡萄糖溶液1mL于試管中，加入1mL 6%苯酚溶液，加入5mL濃硫酸，搖勻，靜置30min，以蒸餾水做空白管，在488nm波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)液的吸光值[5,6]。

1.2.3 魚(yú)腥草多糖含量測(cè)定。分別取0.05g按步驟1.2.1所制得的魚(yú)腥草水溶性粗多糖于50mL容量瓶中，去離子水定容，各取5mL配制的多糖溶液稀釋至50mL容量瓶中，得到多糖稀釋液。將所得的多糖稀釋液同樣以1.2.2中的苯酚——硫酸法測(cè)定其多糖含量，以蒸餾水代替糖溶液反應(yīng)作為空白管。通過(guò)所測(cè)得的吸光度值與測(cè)定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得樣品濃度，再通過(guò)以下兩式計(jì)算可求出樣品多糖含量與多糖得率[7]。

1.2.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)。采用Box－Behnken試驗(yàn)方法對(duì)試驗(yàn)的提取溫度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)條件見(jiàn)表1因素水平表。

表1 響應(yīng)曲面因素水平表

1.2.5 魚(yú)腥草多糖抗氧化活性測(cè)定。①對(duì)OH-清除率測(cè)定：利用Fenton體系，在每支試管分別加入1.5mL 0.15mol/L的磷酸緩沖溶液、0.2mL 260μg/mL番紅花紅溶液、0.7mL 2mmol/mL EDTA-Na2-Fe2溶液，再分別加入各級(jí)濃度多糖濃度試樣1.0mL、0.8mL 3%H2O2溶液，混勻后37℃水浴保溫30min，以蒸餾水做空白管，3%H2O2代替試樣與EDTA-Na2-Fe2+溶液做對(duì)照管，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A）。平行測(cè)定3次，取平均值，并與同濃度Vc清除率做對(duì)比。清除率計(jì)算公式為：清除率（%）=（A試樣-A空白）/（A對(duì)照-A空白）×100。②對(duì)O2-清除率測(cè)定：取4.5mL 0.05mol/L pH-8.25的Tris-HCl緩沖液于試管中，于25℃水浴鍋中預(yù)熱25min，分別加入1mL不同濃度的多糖稀釋液，0.4mL 3mmol/L鄰苯三酚水溶液，以Tris-HCl為空白管，混勻于25℃精確反應(yīng)4min，立即用0.5mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在最大波長(zhǎng)299nm下測(cè)吸光度。平行測(cè)定3次，取平均值，并與同濃度Vc清除率做對(duì)比。清除率計(jì)算公式為：清除率（%）=（1-A試樣/A空白）×100。③對(duì) DPPH清除率測(cè)定：2mL各級(jí)濃度多糖溶液分別加入2mL 0.16mmol/L的DPPH溶液，于25℃恒溫反應(yīng)15min，在波長(zhǎng)525nm下測(cè)定吸光度[8]。平行測(cè)定3次，取平均值，并與同濃度Vc清除率做對(duì)比。清除率計(jì)算公式為：清除率（%）=（1-A試樣/A空白）×100。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

在試驗(yàn)條件下，以葡萄糖濃度單位為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 為 y=0.0101x+0.0034，R2=0.9969，線性關(guān)系較好，結(jié)果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)條件及結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，對(duì)計(jì)算出的試驗(yàn)條件按步驟1.2.1進(jìn)行多糖提取試驗(yàn)，求得相應(yīng)條件下的多糖提取率，以Design expert8.0.6.1版軟件對(duì)所得試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，所得結(jié)果見(jiàn)表2。

在試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上以A（提取溫度）、B（提取時(shí)間）、C（液料比）為自變量，Y（提取率）為響應(yīng)值，求得多糖提取率對(duì)三因子的擬合回歸方程為R1=5.18+0.15A-0.043B+0.22C-0.11AB+0.067AC-0.015 BC-0.45A^2-0.24B^2-0.52C^2，R2=0.9586。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析結(jié)果

由表3可得知，該模型P值為0.0012，該模型差異極顯著（p＜0.01）。R2=0.9586，說(shuō)明有約95.86%的魚(yú)腥草多糖提取率變化符合該模型，模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ统闪ⅰＳ筛饕蛩谾值可知，三因素對(duì)魚(yú)腥草多糖提取的影響顯著性排序?yàn)椋篊（液料比）＞A（提取溫度）＞B（提取時(shí)間）[9]，A、B 與C 之間的交互作用不顯著（P＞0.05），這表明魚(yú)腥草多糖與各個(gè)因子之間不單單是線性關(guān)系；失擬項(xiàng)P=0.0634＞0.05表明失擬不顯著，一定程度上說(shuō)明模型擬合程度好，因此該模型可以對(duì)提取的多糖的ORAC值進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

由相關(guān)因素的3D響應(yīng)面圖及等高線圖結(jié)合可看出，液料比對(duì)魚(yú)腥草多糖提取工藝的影響極大，在適宜液料比下提取率較高，而當(dāng)液料比過(guò)高時(shí)多糖提取率下降明顯。AC之間的交互作用最顯著，AB次之，BC之間交互作用最不顯著。由軟件求得的最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果為提取溫度為81℃，提取時(shí)間為1.86h，料液比為32mL/g，提取率為5.22%，為驗(yàn)證試驗(yàn)準(zhǔn)確性，按最佳試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到魚(yú)腥草多糖提取率為5.07%，試驗(yàn)結(jié)果較好，該試驗(yàn)方案可行[10]。

圖3 三因素對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.3 多糖抗氧化活性能力測(cè)定結(jié)果

2.3.1 對(duì)OH-清除率測(cè)定。通過(guò)在波長(zhǎng)510nm下測(cè)定得到的吸光度及相關(guān)計(jì)算，得到魚(yú)腥草多糖及同濃度Vc對(duì)羥基自由基的清除率。由圖4可以看出，魚(yú)腥草多糖對(duì)羥基自由基的清除率，與Vc清除能力對(duì)比較差，但隨著多糖濃度的升高，其清除率也有著較為明顯的提升。當(dāng)多糖濃度達(dá)到10.15μg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率高達(dá)11.46%[11]。

圖4 魚(yú)腥草多糖及同濃度Vc對(duì)-OH清除率比較

2.3.2 對(duì)O2-清除率測(cè)定結(jié)果及Vc對(duì)比。通過(guò)在波長(zhǎng)299nm下測(cè)定得到的吸光度及相關(guān)計(jì)算，得到魚(yú)腥草多糖及同濃度Vc對(duì)O2-的清除率。由圖5可看出，魚(yú)腥草多糖溶液對(duì)O2-清除率對(duì)比同濃度Vc的清除率較低，且隨著多糖濃度的增長(zhǎng)，清除率提升幅度不大。

圖5 魚(yú)腥草多糖及同濃度Vc對(duì)O2-清除率比較

2.3.3 對(duì)DPPH清除率測(cè)定結(jié)果及Vc對(duì)比。通過(guò)在波長(zhǎng)525nm下測(cè)定得到的吸光度及相關(guān)計(jì)算，得到魚(yú)腥草多糖及同濃度Vc對(duì)DPPH的清除率。由圖6可看出，魚(yú)腥草多糖對(duì)DPPH的清除率，比同濃度Vc對(duì)DPPH清除率較低，但清除率強(qiáng)弱差距較小，且兩者清除率曲線斜率相近，說(shuō)明清除能力的線性關(guān)系相近，都隨著濃度的增加而提升，說(shuō)明魚(yú)腥草多糖對(duì)DPPH的清除力較好。當(dāng)多糖濃度達(dá)到10.15μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH的清除率達(dá)到了66.31%。

圖6 魚(yú)腥草多糖及同濃度Vc對(duì)DPPH清除率比較

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化的方法對(duì)魚(yú)腥草多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、液料比進(jìn)行試驗(yàn)，得出魚(yú)腥草多糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為提取溫度為81℃，提取時(shí)間為1.86h，料液比為32mL/g，魚(yú)腥草多糖得率為5.22%，在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到平均提取率為5.07%，試驗(yàn)誤差較小，說(shuō)明試驗(yàn)方案可行性較高。通過(guò)測(cè)定魚(yú)腥草多糖溶液對(duì)3種自由基離子的清除率，以及對(duì)同濃度Vc清除率的對(duì)比，對(duì)比兩者抗氧化能力強(qiáng)弱。由清除率圖表可知，魚(yú)腥草多糖抗氧化活性對(duì)比同濃度Vc相對(duì)較弱，但其對(duì)DPPH清除能力較好，對(duì)羥基自由基離子及超氧根離子也具有一定的清除能力。

（收稿：2018-05-26）