‘黃老門(mén)’姜莖尖離體培養(yǎng)技術(shù)研究

高 然，關(guān)秋竹，高新華*（山東省泰安第一中學(xué)，山東泰安 7000；山東省果樹(shù)研究所）

姜（Zingiber.officinale Rosc.）屬姜科姜屬多年生草本植物，我國(guó)姜栽培歷史悠久，資源豐富，地方品種頗多。姜生產(chǎn)上主要是通過(guò)老熟的地下根狀莖進(jìn)行繁殖，繁殖系數(shù)低，種姜用量大，容易通過(guò)種姜傳播病害，且長(zhǎng)期無(wú)性繁殖將導(dǎo)致種性退化、長(zhǎng)勢(shì)減弱、抗逆性減弱、產(chǎn)量降低。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)姜組培快繁、無(wú)病毒苗繁育技術(shù)研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足的進(jìn)步[1-3]，但在植物組織培養(yǎng)中不同科屬或同屬不同種間植物對(duì)培養(yǎng)基有著不同的專(zhuān)一適應(yīng)性。本研究以我國(guó)優(yōu)良地方品種‘黃老門(mén)’姜為試材，研究了不同種類(lèi)和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽誘導(dǎo)、增殖、成苗以及生根的影響，并研究了不同的馴化處理對(duì)生根組培苗移栽成活率的影響，旨在建立‘黃老門(mén)’姜組培快繁及馴化移栽技術(shù)體系，為通過(guò)組織培養(yǎng)途徑進(jìn)行‘黃老門(mén)’姜提純復(fù)壯，無(wú)病毒種苗繁育以及品種改良提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

本試驗(yàn)以‘黃老門(mén)’姜為供試材料，選取無(wú)病蟲(chóng)害、色澤好的種姜，洗凈后28±2℃催芽，約30d后出芽，取長(zhǎng)1.5cm左右的初生芽作為外植體，手工除去肉眼可見(jiàn)污漬，流水沖洗30～60min。75%酒精消毒30s，再置于2.0%次氯酸鈉溶液中振蕩殺菌8min，無(wú)菌水清洗3次備用。培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加3%蔗糖和0.7%瓊脂，不同培養(yǎng)階段加入不同濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，高壓滅菌前將pH值調(diào)至5.8，經(jīng)121℃（1.1 kg/cm2）滅菌20 min后備用。培養(yǎng)條件：溫度26±2℃；光照時(shí)間：16h/d；光照強(qiáng)度：45±5μmol/m2。將生根后的組培苗進(jìn)行不同的馴化處理，分別是：A組培室開(kāi)蓋馴化和B溫室開(kāi)蓋馴化。以溫室營(yíng)養(yǎng)缽直接移栽為對(duì)照。馴化第1天開(kāi)蓋時(shí)間為30min，以后每天逐漸延長(zhǎng)，馴化天數(shù)為9d。馴化后移栽至8cm×8cm的營(yíng)養(yǎng)缽，基質(zhì)為草炭/蛭石（1/1），置于日光溫室并進(jìn)行遮蔭。以溫室營(yíng)養(yǎng)缽直接移栽為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)

姜莖尖在不添加任何激素的培養(yǎng)基上不能進(jìn)行分化，單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素BA時(shí)，叢生芽的效果也不是很理想，當(dāng)BA為1.0mg/L時(shí)只抽單芽，雖然BA為2.0mg/L時(shí)，可以誘導(dǎo)形成叢生芽，但芽小且不能正常生長(zhǎng)（表1）。當(dāng)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素同時(shí)存在時(shí)才能很好地誘導(dǎo)叢生芽，其中1.0mg/L BA+0.6mg/L NAA和1.0mg/L BA+0.2mg/L NAA組合的誘導(dǎo)效果好，培養(yǎng)20d后，誘導(dǎo)率達(dá)到100%，且叢生芽生長(zhǎng)正常。

表1 激素對(duì)姜叢生芽誘導(dǎo)及增殖的影響

誘導(dǎo)形成的叢生芽分別在相同培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可以通過(guò)芽基部和腋芽進(jìn)一步增殖，以腋芽增殖為主培養(yǎng)30d和90d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。1.0mg/L BA+0.6mg/L NAA組合在培養(yǎng)90d后增殖系數(shù)達(dá)到8.8，為黃老門(mén)姜莖尖叢生芽誘導(dǎo)及增殖的最佳激素配比組合（表1）。之后叢生芽在最適培養(yǎng)基上每隔1～2個(gè)月分切轉(zhuǎn)接1次，平均增殖率可達(dá)每月9倍。

2.2 生根及壯苗培養(yǎng)

叢生芽培養(yǎng)至30d即可形成許多不定根，分化根比分化芽容易得多。這使得幼苗移至營(yíng)養(yǎng)缽和大田的成活率大大提高。NAA對(duì)生根不是絕對(duì)必須的。但隨著NAA/BA比值的增大，根數(shù)增多且健壯度增加。不過(guò)，NAA質(zhì)量濃度較高時(shí)，姜芽苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出細(xì)弱徒長(zhǎng)趨勢(shì)，不利于移栽成活及移栽后的生長(zhǎng)[4]。培養(yǎng)200d后按具有展開(kāi)葉的單株來(lái)統(tǒng)計(jì)成苗數(shù)。單獨(dú)補(bǔ)加BA可成苗，但苗發(fā)育極不整齊。當(dāng)同時(shí)補(bǔ)加BA和NAA時(shí)，平均每個(gè)莖尖成苗數(shù)分別達(dá)到4.6（1.0mg/L BA+0.2mg/L NAA）、5.6（1.0mg/L BA+0.6 mg/L NAA）和 4.9（2.0mg/L BA+0.6mg/L NAA）。綜合叢生芽發(fā)育及生根情況，2.0mg/L BA+0.6mg/L NAA組合增殖系數(shù)為4.9，每芽生根數(shù)6.1，且組培苗發(fā)育整齊，為黃老門(mén)姜叢生芽成苗及生根的最適培養(yǎng)基。

表2 激素對(duì)姜組培苗成苗及生根的影響

2.3 組培苗馴化和移栽

將組培苗進(jìn)行不同的馴化處理（A組培室開(kāi)蓋馴化和B溫室開(kāi)蓋馴化）9d，以溫室營(yíng)養(yǎng)缽直接移栽為對(duì)照。1個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)不同馴化處理對(duì)試管苗移栽成活率及生長(zhǎng)的影響（表3）。未進(jìn)行馴化處理的生姜苗（對(duì)照）在移栽后即出現(xiàn)嚴(yán)重的萎蔫現(xiàn)象并且全部死亡。處理A和處理B的組培苗移栽成活率分別為66.7%和93.3%，處理B顯著高于處理A。移栽1月后，各處理組培苗都有一定的生長(zhǎng)并且有新葉展開(kāi)。處理B生姜苗平均株高略高于處理A，葉面積也大于處理A，但差異不明顯。平均新葉數(shù)方面，處理B也優(yōu)于處理A。從成活率和植株生長(zhǎng)情況綜合考慮，處理B為試驗(yàn)中得到的較好的馴化方式。

表3 不同馴化處理對(duì)姜組培苗移栽成活率及生長(zhǎng)的影響

3 討論

激素是誘導(dǎo)芽分化關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)成敗起著決定性作用。本研究對(duì)‘黃老門(mén)’姜芽分化過(guò)程的研究表明，細(xì)胞分裂素BA對(duì)叢生芽的分化起著重要的作用，生長(zhǎng)素NAA對(duì)芽的分化有促進(jìn)作用，兩者具有相互增益效應(yīng)，且生姜組培增殖與生根可同步進(jìn)行，從而降低培養(yǎng)成本，縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高組培效率。黃菊輝[5]在四川紅爪姜莖尖培養(yǎng)中葉觀察到相同的情況。林碧英等[6]對(duì)福建生姜研究表明，莖尖在MS+1.5 mg/L BA+0.1mg/L NAA培養(yǎng)基上，芽的分化率最高，達(dá)76.9%。一般認(rèn)為NAA是生根必需的，但本試驗(yàn)在沒(méi)有補(bǔ)加NAA的MS培養(yǎng)基上也觀察到根的分化，只是在數(shù)量與質(zhì)量上明顯不如添加了NAA的處理。

馴化即煉苗過(guò)程，既需要接觸實(shí)際生產(chǎn)中的外界條件，又需要逐步適應(yīng)，馴化能明顯提高多種植物組培苗移栽后的成活率。本次試驗(yàn)中未進(jìn)行馴化的生姜苗在移栽后全部死亡，而在組培室開(kāi)蓋馴化和溫室中開(kāi)蓋馴化的姜苗在移栽后成活率分別達(dá)66.7%和93.3%。溫室中開(kāi)蓋馴化是試驗(yàn)得出的較好馴化方式，這與潘學(xué)峰等的研究結(jié)果相似[7]。關(guān)秋竹等在對(duì)姜組培苗的馴化研究中，也發(fā)現(xiàn)溫室中開(kāi)蓋馴化能顯著提高植株的成活率；并且觀察到在馴化過(guò)程中，植株在光合能力、葉綠體結(jié)構(gòu)、葉片的保護(hù)酶活性等方面發(fā)生了一系列的變化，這些變化保證了植株移栽后的成活率[8]。在組培室開(kāi)蓋馴化時(shí)組培苗不能得到于溫室條件相近的外界條件，因此在移栽入溫室后姜苗依然會(huì)遭受一定的環(huán)境脅迫，也就表現(xiàn)為其較低的成活率。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，即使對(duì)于馴化后的姜苗移栽后的遮蔭也是非常重要，未進(jìn)行遮蔭處理的姜苗，移栽后即發(fā)生嚴(yán)重的光氧化和光漂白現(xiàn)象，葉片褪綠，死亡。黃菊輝報(bào)道營(yíng)養(yǎng)缽澆Holgland營(yíng)養(yǎng)液易于移栽后植株的成活[3]。在本次試驗(yàn)過(guò)程沒(méi)有澆灌任何營(yíng)養(yǎng)液，旨在達(dá)到經(jīng)濟(jì)節(jié)約的目的。從試驗(yàn)結(jié)果看，運(yùn)用草炭/蛭石（1/1）的移栽基質(zhì)，不再澆灌任何營(yíng)養(yǎng)液的處理是可行的，而且仍可達(dá)到較高的移栽成活率這為姜組培與生產(chǎn)實(shí)際結(jié)合提供了一些有效經(jīng)驗(yàn)。

（收稿：2018-05-08）