小麥-黑麥抗條銹病1BL/ 1RS易位系8-2-1的鑒定

梁邦平，刁慧珊，李家創(chuàng)，袁鳳平，劉 洋，白宇皓，李 毛，郝冬冬，白升升，武 軍，趙繼新，楊群慧，陳新宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)具有悠久的種植歷史，是我國乃至世界的重要糧食作物，廣泛種植于全球各個(gè)國家[1]。近年來小麥病害頻發(fā)，嚴(yán)重威脅我國糧食安全，小麥條銹病是其中的主要病害之一。它是由條形柄銹菌(Puccinia.striiformisf.sp.tritici)引起的危害小麥葉片、由空氣傳播的真菌病害，具有發(fā)生區(qū)域廣泛、傳播迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、小種變異快和爆發(fā)性強(qiáng)等特點(diǎn)，對(duì)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，發(fā)病輕者減產(chǎn)20%～40%，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收[2-3]。我國為小麥條銹病發(fā)生面積最大、區(qū)域最廣、發(fā)生最為嚴(yán)重的國家，每年都有不同程度的流行，建國以來，我國分別在1950 年、1964 年、1990 年和 2002 年發(fā)生過四次大規(guī)模的流行，每次產(chǎn)量損失在100萬噸以上，尤其以1950 年危害最為嚴(yán)重，產(chǎn)量損失占總產(chǎn)量的40%以上[4-5]。

將小麥近緣屬植物的抗病基因通過遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程植入到小麥中，創(chuàng)制抗病新品種是防治小麥條銹病最為安全、有效的方式。目前，育種家已從十多個(gè)小麥近緣種屬中獲得抗條銹病基因并將其應(yīng)用到育種中，如來自圓錐小麥的Yr24/Yr26和Yr36[6]，來自節(jié)節(jié)麥的Yr28[7]，來自山羊草的Yr40[8]等。目前，因條銹菌致病性變異，90%以上的小麥生產(chǎn)品種喪失抗銹性[9-10]，抗病資源嚴(yán)重不足,尋找新的抗病資源十分緊迫。黑麥(SecalecerealeL. RR,2n=14)是小麥近緣種屬之一，具有普通小麥不具有或優(yōu)于普通小麥的優(yōu)良性狀，如穗子大，籽粒中賴氨酸和蛋白質(zhì)含量高，膳食纖維(DF)含量較高，分蘗能力強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，抗旱耐鹽堿，耐低溫，攜帶抗銹病(Yr9、Lr26、Sr31)、抗白粉病(Pm7、Pm8、Pm17、Pm20)和蚜蟲等多種病蟲害的優(yōu)良性狀基因。其豐富的基因資源，被用于小麥高產(chǎn)、抗病、抗逆等方面遺傳育種研究，并取得了重大成果[11-12]。王 鑫等[13]鑒定出新的1BL/1RS矮稈種質(zhì)材料SN224；甘 敏等[14]鑒定出對(duì)條中31、條中32、水 4、水 14 及水 7 等混合菌具有抗性的小麥-黑麥衍生系；1BL/1RS易位系與小麥赤霉病抗性有關(guān)聯(lián)，已被廣泛的應(yīng)用于小麥育種中。但由于1RS攜帶的黑麥堿(secalin)替代了小麥 1BS 上的低分子量谷蛋白和醇溶蛋白,導(dǎo)致面筋品質(zhì)變差、面團(tuán)發(fā)黏、食品加工品質(zhì)顯著變劣等[16-18]。隨著人們生活水平的提高，對(duì)面制品品質(zhì)的需求越來越高，優(yōu)質(zhì)成為小麥育種目標(biāo)的重要方向[19]。

8-2-1是本課題組用優(yōu)質(zhì)普通小麥品系W770B(2n=6X=42,AABBDD)和引進(jìn)的墨西哥黑麥(SecalecerealeL.; 2n=2x=14,RR)進(jìn)行雜交，經(jīng)秋水仙素處理后再經(jīng)過多次與W770B回交和多次人工條銹病鑒定、農(nóng)藝性狀分析篩選出的新衍生系，為了對(duì)8-2-1的利用奠定基礎(chǔ)，本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、GISH、SCAR分子標(biāo)記、SSR分子標(biāo)記、SDS-PAGE和近紅外谷物分析儀多種方法對(duì)8-2-1進(jìn)行鑒定，并對(duì)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，以期為該材料在小麥抗病育種中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

8-2-1由本課題組保存，W770B、中國春(2n=6X=42,AABBDD)和銘賢169(2n=6X=42,AABBDD)均由陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)所用條銹病菌種CYR31和CYR32由西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院提供。

采用隨機(jī)區(qū)組播種供試小麥材料，行長1 m，行距25 cm，株距5 cm，每個(gè)材料種植2行，三個(gè)重復(fù)，在行的垂直方向種植一行銘賢169。2015年10月5日和2016年10月10日播種在西北農(nóng)林科技大學(xué)原植物所東院。

1.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

參考Cota-Sánchez等[20]的方法提取供試材料基因組DNA。參照Wu等[21]方法進(jìn)行根尖染色體的制片，觀察染色體的數(shù)目。GISH程序參照Wu等[21]方法。利用Dig-Nick-Translation Mix試劑盒(Roche,Germany)用缺口平移法按照說明書對(duì)墨西哥黑麥基因組DNA進(jìn)行探針標(biāo)記。在OLYMPUS BX60熒光顯微鏡下觀察，Photometrics SenSys CCD照像、保存。

1.3 分子(SCAR，SSR)標(biāo)記鑒定

黑麥特異SCAR標(biāo)記參考Chai等[22]、Francis等[23]、Koeber等[24]、Iqbal等[25]方法，小麥SSR 標(biāo)記參考Roder等[26]和Pestsova等[27]方法。20 μL PCR反應(yīng)體系，包含10×Buffer(含Mg2+) 2 μL 、dNTP 1.6 μL(2.5 μmol·mL-1)、上下游引物各1 μL(5 μmol· mL-1)、Taq酶0.2 μL(5 U·μL-1) 、模板DNA(50 ng·μL-1) 2.5 μL、超純水11.8 μL。PCR反應(yīng)在PTC-200擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性60 s，退火50 s，退火溫度根據(jù)引物確定，72 ℃延伸1 min，30到35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；12 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)SCAR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照保存。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，硝酸銀染色，NAOH顯色，數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1.4 條銹病鑒定

銘賢169為感病對(duì)照，在拔節(jié)期用抖粉法，把等量的條銹病菌CYR31和CYR32與淀粉混合均勻接種，待銘賢169充分發(fā)病時(shí)參照Ma等[28]方法進(jìn)行抗病反應(yīng)型(IT)鑒定，按照0～4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)為免疫，1為高抗(HR)，2為中抗(MR)，3為中感(MS)，4為高感(HS)。

1.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查

參考李立會(huì)和楊欣明[29]的方法調(diào)查8-2-1、黑麥和W770B的分蘗、株高、穗長、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀并記錄數(shù)據(jù)，每個(gè)重復(fù)調(diào)查10個(gè)單株。

1.6 谷蛋白組成分析和品質(zhì)性狀測(cè)定

高分子量谷蛋白的提取和SDS-PAGE 電泳參考Gupta 和Macritchie[30]的方法，分析高分子量谷蛋白的組成；利用瑞典 Perten 公司生產(chǎn)的近紅外谷物分析儀DA7250，測(cè)定小麥籽粒的粗蛋白干基、面筋濕基、沉降值等指標(biāo)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 8-2-1的細(xì)胞學(xué)特征

對(duì)8-2-1根尖細(xì)胞有絲分裂染色體的鑒定結(jié)果表明，8-2-1染色體數(shù)目為42條。以黑麥基因組DNA為探針進(jìn)行GISH鑒定，結(jié)果顯示，8-2-1含有兩個(gè)黃綠色的染色體臂，W770B不具有此黑麥染色體片段，推斷黑麥染色體片段易位到8-2-1，為易位系(圖1)。

2.2 黑麥基因組特異SCAR標(biāo)記分析

用黑麥基因組SCAR標(biāo)記和各個(gè)同源群SCAR標(biāo)記對(duì)黑麥、W770B和8-2-1進(jìn)行分析，結(jié)果表明，黑麥基因組SCAR標(biāo)記AF1/AF4能夠在黑麥和8-2-1中擴(kuò)增出1 600 bp左右的特異條帶，2個(gè)1RS SCAR標(biāo)記ω-sec-p1/ω-sec-p2與ω-sec -p3/ω-sec-p4在黑麥和8-2-1中能夠擴(kuò)增出1 100 bp左右和400 bp左右的特異條帶(圖2)，說明8-2-1具有黑麥1RS染色體。

A:根尖細(xì)胞; B:根尖細(xì)胞原位雜交。圖中黃綠色信號(hào)為黑麥染色體臂，其他為小麥染色體。A:Root tip cell,2n=42; B:GISH result of root tip cell.Bright yellow green signals indicate rye chromosomes.

2.3 小麥SSR標(biāo)記分析

利用小麥各個(gè)基因組SSR分子標(biāo)記，最終篩選出1BS上的Xwmc230，Xgwm413和Xgwm550三對(duì)引物。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(圖3)顯示，Xwmc230，Xgwm413和Xgwm550為引物不能在黑麥和8-2-1中擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，目的條帶缺失，因此，可以確定8-2-1缺失了小麥1BS染色體。說明8-2-1為小麥-黑麥1BL/1RS易位系。

M:DL2000; 1:黑麥; 2:W770B; 3:8-2-1；A:AF1/AF4; B:ω-sec-p3/p4; C:ω-sec-p1/p2。M:DL2000; 1:Rye; 2:W770B; 3:8-2-1; A:AF1/AF4; B:ω-sec-p1/p2; C:ω-sec-p3/p4.

2.4 8-2-1的條銹病鑒定及農(nóng)藝性狀分析

待對(duì)照品種銘賢169完全發(fā)病時(shí)調(diào)查供試材料的發(fā)病情況，結(jié)果(圖4)表明，銘賢169和W770B表現(xiàn)為4級(jí)高感(HS)，黑麥表現(xiàn)為0級(jí)免疫，8-2-1表現(xiàn)為1級(jí)高抗(HR)，推斷8-2-1可能攜帶墨西哥黑麥抗條銹病基因。

田間調(diào)查黑麥、W770B和8-2-1的農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn)，8-2-1籽粒飽滿且籽粒較大，穗子長、成紡錘形，芒較長(圖5)。由表1可知，8-2-1的株高、穗長和小穗數(shù)均介于黑麥和W770B之間，3個(gè)材料間差異顯著；8-2-1分蘗較少，且與黑麥差異顯著，穗粒數(shù)較高，顯著高于W770B；千粒重顯著高于雙親?？傮w來看，8-2-1的農(nóng)藝性狀介于黑麥和W770B之間，相對(duì)于黑麥降低了株高，和W770B相比，穗長、穗粒數(shù)和千粒重顯著提高，綜合農(nóng)藝性狀好。

2.5 8-2-1的谷蛋白組成和品質(zhì)分析

以中國春為對(duì)照測(cè)定供試材料的HMW-GS發(fā)現(xiàn)，8-2-1亞基組成為Null、7+8、2+12，W770B亞基為Null、7+16、 2+12(圖6)。

M:DL2000; 1:黑麥; 2:W770B; 3:8-2-1; A:Xwmc230; B:Xgwm413; C:Xgwm5500.箭頭所示為小麥1BS標(biāo)記條帶。M:DL2000; 1:Rye; 2:W770B; 3:8-2-1; A:Xwmc230; B:Xgwm413; C:Xgwm5500.Arrows indicate the specific amplification products of 1BS.

1:黑麥; 2:W770B; 3:8-2-1; 4:銘賢169。1:Rye; 2:W770B; 3:8-2-1; 4:Mingxian 169.

A:成株期植株; B:麥穗; C:籽粒; 1:8-2-1; 2:W770B; 3:黑麥。A:Adult plants; B:Spikes; C:Seeds; 1:8-2-1; 2:W770B; 3:Rye.

表1 8-2-1及其親本主要農(nóng)藝性狀Table 1 Main agronomic traits of 8-2-1 and its parents

1:黑麥; 2:W770B; 3:中國春(CS); 4:7-1; 5:8-2-1。1:Rye; 2:W770B; 3:CS; 4:7-1; 5:8-2-1.

由表2可知，8-2-1的粗蛋白含量(干基)、濕面筋含量和Zeleny沉降值與墨西哥黑麥差異顯著，與W770B差異不顯著。

表2 8-2-1品質(zhì)指標(biāo)分析結(jié)果Table 2 Analytic result of quality parameters of 8-2-1

3 討 論

隨著近年來小麥病害的頻發(fā)，小麥育種不再單一的追求高產(chǎn)，培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗病、抗逆和優(yōu)質(zhì)的新品種成為小麥育種的新目標(biāo)[19]。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式從小農(nóng)生產(chǎn)逐步向規(guī)?；较虬l(fā)展，免耕和少耕的耕作方式、秸稈還田的普遍應(yīng)用、大型收獲機(jī)械跨區(qū)作業(yè)等加快了病蟲害的傳播，小麥病害問題日益嚴(yán)重，條銹病菌生理小種的快速變化，使小麥條銹病發(fā)生面積和區(qū)域不斷增加，急需要培育抗病小麥新品種，以適應(yīng)新的生產(chǎn)環(huán)境模式。20世紀(jì)八九十年代，我國大面積推廣含有洛夫林血緣的系列品種，對(duì)我國小麥抗病和增產(chǎn)起到了積極的影響，但也導(dǎo)致抗源的單一和不足。當(dāng)前生產(chǎn)上種植的普通小麥品種對(duì)條銹病的抗性較弱，缺乏有效的抗病種質(zhì)資源，且條銹病生理小種容易變異，產(chǎn)生新的毒性，一般的抗病品種只能維持五年左右[2，31]，發(fā)掘新的抗病種質(zhì)、培育廣譜抗性的新品種成為當(dāng)務(wù)之急。

黑麥作為小麥的近緣屬植物，具有抗病、抗逆等優(yōu)良性狀，常被用來改良小麥遺傳背景。黑麥中的抗條銹病基因Yr9 主要是通過1BL/1RS易位系導(dǎo)入到小麥種的，目前，黑麥中的Yr9 基因被廣泛應(yīng)用到抗條銹病育種當(dāng)中，但由于育種親本的選擇有限和生理小種的不斷變異，使得以Yr9 抗性基因?yàn)橹鞯奈覈蟛糠蛀渽^(qū)的主栽品種抗病性喪失[32-33]，從而增加了條銹病發(fā)生和流行的可能性。本試驗(yàn)通過原位雜交和分子標(biāo)記等多種檢測(cè)方法，能夠確定8-2-1是1BL/1RS易位系，8-2-1對(duì)CYR32表現(xiàn)為抗病，而單獨(dú)的“洛類”血緣種質(zhì)對(duì)CYR32表現(xiàn)為感病[34]，Yr9 基因需要與其他基因共同作用才能抗CYR32[35-36]。因此，推測(cè)墨西哥黑麥中可能攜帶不同與Yr9 的新基因抗源并導(dǎo)入到8-2-1中，也可能是Yr9 基因與其他基因的互作，其抗病機(jī)理還需要更進(jìn)一步的研究。

粗蛋白含量、濕面筋含量、Zeleny沉降值是衡量小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)。本研究中，8-2-1粗蛋白干基含量為12.92%，濕面筋含量26.94%，均達(dá)到中筋小麥標(biāo)準(zhǔn)；Zeleny沉降值為23.22 mL，達(dá)到弱筋小麥的要求(GB/T 17320-2013)。Zhang等[37]認(rèn)為，優(yōu)質(zhì)亞基(17+18，5+10)與面筋品質(zhì)正相關(guān)，2+12亞基與面筋品質(zhì)負(fù)相關(guān)，8-2-1的亞基組成為Null、7+8、2+12，可能是其品質(zhì)下降的主要原因。W770B(Null,7+8,2+12)與8-2-1(Null,7+16,2+12)在Glu-B1位點(diǎn)編碼的HMW-GS 存在差異，可能是黑麥1RS染色體導(dǎo)入或天然異交導(dǎo)致的。黑麥1RS攜帶或小麥自身的、處于沉默狀態(tài)的轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子被激活，從而改變了編碼HMW-GS的基因家族中的DNA高度重復(fù)序列的拷貝數(shù)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物HMW-GS發(fā)生變化，HMW-GS 的變異能夠占到面團(tuán)品質(zhì)相關(guān)變異的 35%～70%[38-39]。8-2-1與W770B在粗蛋白含量、濕面筋含量、沉降值非常接近，說明遺傳背景在小麥育種中的重要性。8-2-1還具有良好的農(nóng)藝性狀，如早熟，粒大，穗大，千粒重優(yōu)勢(shì)明顯，株高較矮，抗倒伏性好，可能與黑麥基因的導(dǎo)入有關(guān)。與附加系和代換系相比，易位系攜帶的不利基因更少，且遺傳穩(wěn)定，是比較理想的育種材料，因此可以作為培育抗病、高產(chǎn)和弱筋小麥新品種的中間材料。