濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組分析

李紅婷，魏露陽，李中虎，朱路英，柏新富

(1.魯東大學農(nóng)學院，山東煙臺 264025； 2.魯東大學生命科學學院，山東煙臺 264025)

濱麥(LeymusmollisL.)屬于禾本科小麥族賴草屬，是一種分布于沿海海灘及貧瘠土地上的野生植物。作為小麥的野生近源物種，濱麥具有耐鹽堿、耐干旱、抗病蟲害、秸稈粗壯和大穗多花等優(yōu)良性狀，被認為是小麥遺傳改良的重要資源[1-2]。同時，濱麥還是一種典型的鹽生植物，在沿海沙地生長旺盛。因此，濱麥也是研究植物耐鹽機理的良好材料。

將野生近源物種的優(yōu)良基因引入小麥從而培育性狀優(yōu)良的小麥品種，已成為多年來小麥育種工作的重要任務之一。近年來，人們先后將濱麥與普通小麥進行雜交，以期獲得具有濱麥優(yōu)良性狀的普通小麥種質(zhì)。傅 杰等[3-4]、陸文輝等[5]先后利用野生濱麥與普通小麥雜交的方法選育出了表現(xiàn)濱麥優(yōu)良特性的附加系、代換系和易位系。Forsstrom等[6]將波斯小麥與濱麥的雜交種再與普通小麥進行雜交，在后代中鑒定出6個抗白粉病的純合系。王金平等[7]將普通小麥與八倍體小濱麥雜交，在雜交后代中鑒定出了兼具抗白粉病和條銹病的種質(zhì)材料山農(nóng)6343。Pang等[8]在普通小麥和濱麥的雜交后代中篩選出了抗葉銹病的代換系，利用分子細胞遺傳學進行鑒定，證實普通小麥和濱麥的雜交后代中含有濱麥的部分染色體；和普通小麥親本相比，雜交后代的部分農(nóng)藝性狀得到改善[9-11]。這些研究成果積極推進著小麥的遺傳育種工作進程。盡管濱麥在豐富小麥遺傳基因資源和提高小麥的抗病性、抗逆性等方面具有巨大的利用價值，但人們對濱麥的基因信息和相關功能了解卻非常少，濱麥響應多種生物脅迫和非生物脅迫的生理生化反應的遺傳基礎還不清楚。

轉(zhuǎn)錄組是指某一條件下或某一時刻，生物體細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測序是將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過高通量測序技術，快速全面地獲得某個特定樣本中幾乎所有cDNA的序列信息及含量[12]。通過轉(zhuǎn)錄組測序得到的信息能夠?qū)蚪M功能元件、剪切方式、轉(zhuǎn)錄后修飾、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分類以及脅迫條件的基因差異表達進行研究。因此，轉(zhuǎn)錄組測序已成為研究基因表達的重要手段。目前，植物、動物和微生物的轉(zhuǎn)錄組研究均有報道[13-15]。本研究利用Illumina HiSeqTM2000 高通量測序技術，首次對生長在海濱沙地的濱麥葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，對測序組裝的轉(zhuǎn)錄本進行分類統(tǒng)計、功能注釋和Pathway分析，并對Na+轉(zhuǎn)運相關蛋白基因和氧化脅迫響應基因進行挖掘，以期為進一步研究濱麥的基因信息和耐鹽機理提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料濱麥葉片采集于山東省煙臺市煙臺大學東鄰的海濱沙地(東經(jīng)121°46′，北緯37°47′)，采集時間在5月下旬，此為濱麥的旺盛生長期。選取20株生長健壯的野生濱麥植株的中部葉片為試驗材料，采摘后立即置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA文庫的構(gòu)建

將濱麥葉片在液氮里研磨成細粉狀，用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA。分別通過瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸定量儀檢測提取RNA的完整性和濃度，將符合轉(zhuǎn)錄組RNA的檢測標準(濃度≥400 ng·μL-1，OD260/280=1.8～2.1，rRNA Ratio (28S:18S)≥2.0，RIN≥7)的樣品用于后續(xù)試驗。用Illumina Gene Expression Sample Prep Kit(Illumina，美國)中的Oligo(dT)磁珠富集mRNA，隨后將mRNA片段化處理，再用隨機引物和SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，美國)合成cDNA第一鏈，然后采用Super Script II Reverse 試劑盒(Invitrogen，美國)合成cDNA第二鏈。經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒(Qiagen，德國)純化后做末端修復和3′端加poly(A)并連接到測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳選擇200 bp的片段，用高通量測序平臺Illumina Hiseq 2000進行PE100測序。上述測序工作在深圳華大基因股份有限公司完成。

1.2.2 數(shù)據(jù)拼接

測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)首先經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)獲得raw reads，通過FastQC檢查raw reads的質(zhì)量，去除含有帶接頭的、重復的以及測序質(zhì)量低(N的比例大于5%、質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個read的20%以上)的reads后，獲得clean reads。使用短reads 組裝軟件Trinity進行從頭組裝[16]。首先將具有一定長度重疊的reads拼接成Contig，然后利用paired-end reads確定同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig及其距離，將這些Contig連接，獲得兩端不能延長的序列Unigene，即轉(zhuǎn)錄本。

1.2.3 功能注釋

通過BlastX軟件將獲得的轉(zhuǎn)錄本序列分別比對到NCBI-NR(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/nr/)、Swiss-Prot (http://www.gpmaw.com/html/swiss-prot.html)、KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)和COG(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)，得到與給定轉(zhuǎn)錄本具有最高相似度的蛋白(E-value<10-5)，利用 InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對蛋白功能進行注釋，從而獲取該轉(zhuǎn)錄本的蛋白功能注釋信息。根據(jù)NR的注釋信息，使用Blast2GO軟件得到轉(zhuǎn)錄本的GO (http://www.geneontology.org/)注釋信息，再使用WEGO將所有轉(zhuǎn)錄本做GO功能分類統(tǒng)計。

1.2.4 熒光定量PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機選取了12個基因(包括2個轉(zhuǎn)錄因子基因NAC和DREB，3個Na+轉(zhuǎn)運蛋白相關基因 NHX2、 SOS1和H+-ATPaseI，2個氧化脅迫響應基因 POD21和TRX，1個熱脅迫響應基因HSP，1個光合作用相關基因RcaB，1個信號轉(zhuǎn)導相關基因PP，1個脫水素基因Dehydrin和1個水通道蛋白基因TIP)進行實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)驗證。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的基因序列，采用Premier Premier 5.0軟件設計特異性的qRT-PCR引物(表1)。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，日本)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以之為模板，按照 SYBR Premix ExTaqTM Kit(TaKaRa，日本)說明書在ABI 7300 熒光PCR儀(ABI，美國)進行qRT-PCR。以β-actin基因為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析濱海野生濱麥葉片各基因的相對表達水平，每個反應進行3次生物學重復。

表1 qPCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 測序序列De novo組裝

對濱麥葉片樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，總計獲得46 406 704條clean reads，Q20 比值為96.96%，GC含量為55.29%，說明測序結(jié)果準確度較高，可用于后續(xù)分析。采用Trinity將clean reads進行組裝，得到228 637條Contigs，N50長度為438 bp；再將Contig進一步組裝，得到112 846條Unigene，其中屬于聚類的Unigene 45 563條，獨立的Unigene 67 283條，N50長度為1 319 bp(表2)。Unigene的長度分布情況見圖1，超過1 kb的Unigene有25 878 條，占22.93%；超過2 kb的有8 031條，占7.12%。測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已提交至NCBI-SRA(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)(登錄號為SRP109343)。

表2 測序產(chǎn)量和組裝質(zhì)量統(tǒng)計Table 2 Statistics of sequencing and assemble quality

圖1 組裝的Unigene長度分布

2.2 Unigene功能注釋

將上述Unigene分別在NCBI-NR、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO進行注釋，成功注釋的Unigene數(shù)目依次為41 358、26 184、18 550、15 786和20 350。去除重復注釋后的Unigene共計59 380條，占Unigene總數(shù)的52.62%。因為濱麥及濱麥所屬的賴草屬植物基因組信息比較缺乏，因此，濱麥Unigene在與NCBI-NR進行比對時，所注釋的基因信息主要來自同為小麥族的大麥(40.69%)、二穗短柄草(23.88%)和小麥(20.05%)。

2.3 轉(zhuǎn)錄組Unigene的COG分類

將濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組Unigene與COG進行比對，得到15 786條注釋結(jié)果，歸屬于25個大類(圖2)。其中，歸屬于“一般功能預測(General function prediction only)”類的Unigene數(shù)量最多，達7 644條，占48.42%；其次是“功能未知(Function unknown)”類，有6 444條；“翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源(Translation，ribosomal structure and biogenesis)”類有5 689條；“轉(zhuǎn)錄(Transcription)”類有5 467條；“復制、重組和修復(Replication，recombination and repair)”類4 755條；“細胞周期控制、細胞分裂和染色體分區(qū)(Cell cycle control，cell division，chromosome partitioning)”類4 267條。Unigene數(shù)量較少的組類分別是“核結(jié)構(gòu)(Nuclear structure)”(14條)、“胞外結(jié)構(gòu)(Extracellular structure)”(32條)、“RNA加工與修飾(RNA processing and modification)”(149條)和“核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(Chromatin structure and dynamics)”(187條)。

A：RNA加工和修飾；B：核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學；C：能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化；D：細胞周期控制，細胞分裂和染色體分隔；E：氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝；F：核酸轉(zhuǎn)運和代謝；G：碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝；H：輔酶轉(zhuǎn)運和代謝；I：脂類轉(zhuǎn)運和代謝；J：翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源；K：轉(zhuǎn)錄；L：復制,重組和修復；M：細胞壁/膜/包膜生物合成；N：細胞遷移；O：翻譯后修飾，蛋白翻轉(zhuǎn)和分子伴侶；P：無機離子轉(zhuǎn)運和代謝；Q：次生代謝物合成,轉(zhuǎn)運和代謝；R：一般功能預測；S：功能未知；T：信號轉(zhuǎn)導機制；U：胞內(nèi)運輸，分泌和膜泡運輸；V：防御機制；W：胞外結(jié)構(gòu)；Y：核結(jié)構(gòu)；Z：細胞骨架。A:RNA processing and modification; B:Chromatin structure and dynamics; C:Energy production and conversion; D:Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning; E:Amino acid transport and metabolism; F:Nucleotide transport and metabolism; G:Carbohydrate transport and metabolism; H:Coenzyme transport and metabolism; I:Lipid transport and metabolism; J:Translation,ribosomal structure and biogenesis; K:Transcription; L:Replication,recombination and repair; M:Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N:Cell motility; O:Post-translation modification,protein turnover,chaperones; P:Inorganic ion transport and metabolism; Q:Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism; R:General function prediction only; S:Function unknown; T:Signal transduction mechanisms; U:Intracellular trafficking,secretion and vesicular transport; V:Defense mechanisms; W:Extracellular structures; Y:Nuclear structure; Z:Cytoskeleton.

2.4 轉(zhuǎn)錄組Unigene的GO分類

濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組Unigene注釋到GO數(shù)據(jù)庫，共有20 350條Unigene被注釋分類到“生物學過程(Biological process)”、“細胞組件(Cellular component)”和“分子功能(Molecular function)”三個大類中(圖3)。其中，歸屬“生物學過程”的Unigene數(shù)量最多，占總數(shù)的43.56%。在“生物學過程”大類中，參與“代謝過程(Metabolic process)”和“細胞過程(Cellular process)”的Unigene數(shù)量最多，分別為11 070條和10 922條；其次是“單有機體過程(Single organism process)”(6 153條)、“刺激響應(Response to stimulus)”(4 838條)和“生物調(diào)控(Biological regulation)”(3 399條)。在“細胞組件”大類中，歸屬于“細胞(Cell)”(14 589條)、“細胞區(qū)域(Cell part)”(14 589條)以及“細胞器(Organelle)”(12 630條)的Unigene數(shù)量較多；在“分子功能”大類中，Unigene歸屬較多的類別是“結(jié)合活性(Binding)”(10 230條)和“催化活性(Catalitic activity)”(10 024條)。

B:生物學過程大類；C：細胞組件大類；M：分子功能大類；B1：生物附著；B2：生物調(diào)控；B3：細胞成分組織或發(fā)生；B4：細胞過程；B5：發(fā)育過程；B6：定位建立；B7：生長過程；B8：免疫系統(tǒng)過程；B9：定位；B10：代謝過程；B11：多有機體過程；B12：多細胞有機體過程；B13：生物過程的負調(diào)控；B14：生物過程的正調(diào)控；B15：生物過程調(diào)控；B16：再生；B17：再生過程；B18：刺激響應；B19：節(jié)律性過程；B20：信號；B21：單有機體過程；C1：細胞；C2：細胞結(jié)合；C3：細胞區(qū)域；C4：胞外區(qū)域；C5：大分子復合體；C6：生物膜；C7：膜部分；C8：包膜腔；C9：類核；C10：細胞器；C11：細胞器部分；C12：共質(zhì)體；M1：抗氧化活性；M2：結(jié)合活性；M3：催化活性；M4：電子轉(zhuǎn)運體活性；M5：酶調(diào)節(jié)活性；M6：分子傳感器活性；M7：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；M8：營養(yǎng)庫活性；M9：蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；M10：受體活性；M11：結(jié)構(gòu)分子活性；M12：運輸活性。B:Biological process category; C:Cellular component category; M:Molecular function category; B1:Biological adhesion; B2:Biological regulation; B3:Cellular component organization or biogenesis; B4:Cellular process; B5:Developmental process; B6:Establishment of localization; B7:Growth;B8:Immune system process; B9:Localization; B10:Metabolic process; B11:Multi-organism process; B12:Multicellular organism process; B13:Negative regulation of biological process; B14:Positive regulation of biological process; B15:Regulation of biological process; B16:Reproduction; B17:Reproductive process; B18:Response to stimulus; B19:Rhythmic process; B20:Signaling; B21:Single-organism process; C1:Cell; C2:Cell junction; C3:Cell part; C4:Extracellular region; C5:Macromolecular complex; C6:Membrane; C7:Membrane part; C8:Membrane-enclosed lumen; C9:Nucleoid; C10:Organelle; C11:Organelle part; C12:Symplast; M1:Antioxidant activity; M2:Binding activity; M3:Catalytic activity; M4:Electron carrier activity; M5:Enzyme regulator activity; M6:Molecular transducer activity; M7:Nucleic acid binding transcription factor activity; M8:Nutrient reservoir activity; M9:Protein binding transcription factor activity; M10:Receptor activity; M11:Structural molecular activity; M12:Transporter activity.

2.5 轉(zhuǎn)錄組Unigene的代謝途徑分析

將濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組所有的Unigene比對到KEGG，有18 550條Unigene得到注釋，共涉及到128條代謝途徑。其中，Unigene數(shù)量歸屬最多的代謝途徑是“代謝通路(Metabolic pathways)”，涉及到的Unigene占總數(shù)的27.86%；其次是“RNA運輸(RNA transport)”、“mRNA監(jiān)控通路(mRNA surveillance pathway)”、“次生代謝物的合成(Biosynthesis of secondary metabolites)”、“甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolic)”和“內(nèi)吞作用(Endocytosis)”途徑，其涉及到的Unigene數(shù)量分別占總數(shù)的17.48%～10.11%。另外，“植物病原互作(Plant-pathogen interaction)”和“植物激素信號轉(zhuǎn)導(Plant hormone signal transduction)”途徑涉及的Unigene數(shù)量也較多，分別為1 367條和861條(表4)。這些結(jié)果暗示，以上途徑在濱麥的生理代謝中處于比較活躍的狀態(tài)。

表4 濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組主要的KEGG通路分析Table 4 Summary of KEGG pathway for Leymus mollis leaf transcriptome

2.6 Na+轉(zhuǎn)運蛋白相關基因和氧化脅迫響應基因的挖掘

基于本研究的材料取自濱海沙地這種高Na+的鹽漬環(huán)境，故對濱麥葉片轉(zhuǎn)錄譜進行了與Na+轉(zhuǎn)運相關的幾種蛋白基因的分析，包括液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因(NHX)、質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因( SOS1)、以及為這兩種蛋白轉(zhuǎn)運離子提供能量的液泡膜及質(zhì)膜上的H+-ATP酶基因(H+-ATPase)或H+-焦磷酸化酶基因(H+-PPase)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組Unigene比對幾個數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，最終檢索到與其他物種NHX序列具有高度相似性的Unigene有15條(表5)，其中，以擬南芥做參照注釋為 NHX1、 NHX2、 NHX6、 NHX7(即 SOS1)和 NHX8( SOS1類似蛋白基因)的Unigene分別有2條、4條、2條、5條和1條。另外，還有1條Unigene與短芒大麥草(Hordeumbrevisubulatum)的 NHX1序列有高度的相似性。檢索到注釋為液泡膜H+-ATP酶B亞基基因的Unigene 3條、液泡膜H+-PPase的Unigene 4條、質(zhì)膜H+-PPase8條。這些結(jié)果暗示，濱麥葉片細胞中向液泡內(nèi)轉(zhuǎn)運Na+以及細胞外排Na+的行為較為活躍，這可能是濱麥耐鹽的一種策略。

鹽漬環(huán)境中，植物根際周圍過多的Na+會導致植物產(chǎn)生滲透脅迫和離子脅迫，進而引發(fā)過氧化脅迫[17-18]，因此，本研究對濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組中的氧化脅迫相關基因進行了分析，共搜索到了175條響應氧化脅迫的Unigene。其中，注釋為過氧化物酶(EC:1.11.1.7)的Unigene 數(shù)量最多，為50條；其次是谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(EC:1.8.1.7)和硫氧還蛋白，分別為40條和37條；注釋到谷胱甘肽過氧化物酶(EC:1.11.1.9)12條，L-抗壞血酸過氧化物酶(EC:1.11.1.11)11條，超氧化物岐化酶(EC:1.15.1.1)10條，過氧化物還原酶(EC:1.11.1.15)8條，過氧化氫酶(EC:1.11.1.6) 7條(表5)。這說明，濱麥葉片細胞中過氧化物酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和硫氧還蛋白在抗氧化過程中發(fā)揮著重要作用。

表5 濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組中耐鹽相關基因的挖掘Table 5 Analysis of salt-tolerance genes in Leymus mollis leaf transcriptome

2.7 熒光定量PCR結(jié)果分析

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，本研究隨機挑選了12個基因進行qRT-PCR驗證。結(jié)果表明，這12個基因的相對表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果基本一致。其中，位于液泡膜上的水通道蛋白基因TIP表達量最高，轉(zhuǎn)錄因子NAC基因和質(zhì)膜H+-ATPase Ⅰ基因的表達量次之，而轉(zhuǎn)錄因子DREB基因和過氧化物酶 POD21基因的表達量相對較低(圖4)。

3 討 論

近幾年發(fā)展起來的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術，因其具有高通量、高靈敏度等優(yōu)點已成為大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學研究的一種全新且更為有效的方法。目前，RNA-Seq不僅在基因轉(zhuǎn)錄水平和SNP標記物開發(fā)等領域廣泛應用，而且在完善基因組結(jié)構(gòu)信息和挖掘新基因方面也發(fā)揮著重要作用[19-21]。本研究中濱麥葉片經(jīng)Illumina HiSeq 2000高通量測序后，共獲得了46 406 704條過濾后的測序序列。堿基質(zhì)量及組成分析顯示，Q20比值為96.96%，GC含量為55.29%，說明文庫構(gòu)建成功且測序質(zhì)量良好。經(jīng)組裝和拼接后，共獲得了112 846條非冗余Unigene，其中52.62%的Unigene在NR、GO和Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫中獲得功能注釋。

對濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組Unigene進行GO功能注釋，在“生物學過程”大類中共涉及21個分類,其中歸屬于“代謝過程”類的Unigene所占比例最多，其次為“細胞過程”類和“單有機體過程”類，這些均為常規(guī)的生物學過程。此外，“生物學過程”大類中還包含“刺激響應”和“生物調(diào)節(jié)”這兩個與環(huán)境適應性相關的類別，且涉及到的Unigene數(shù)量比例也較大，共有8 237條。這個結(jié)果與本研究中供試材料的生長環(huán)境濱海沙地相符合。在“細胞組件”大類中共涉及12個分類,除了“細胞”和“細胞區(qū)域”類所占比例最多外，“細胞器”和“膜”類別也占有重要比例。說明參與濱麥葉片生理活動的分子組分主要集中在細胞的細胞器和膜系統(tǒng)上，這暗示濱麥葉片的膜組分在環(huán)境適應性方面發(fā)揮著重要作用。在“分子功能”大類共涉及 12個分類,其中“結(jié)合”類別和“催化活性”類別所涉及的Unigene數(shù)量最多，這說明這兩類活動在濱麥葉片的生理活動中比較活躍。KEGG分析表明，濱麥葉片表達基因共涉及128個通路,其中所含Unigene最多的是“代謝通路”和“RNA運輸”這兩個通路，Unigene數(shù)量分別為5 168條(27.86%)和3 243條(17.48%)。另外，“次生代謝物的生物合成”、一些有機分子的代謝途徑(包括甘油磷脂代謝、醚脂代謝、淀粉與蔗糖代謝和苯丙烷生物合成等)、“植物病原互作”和“植物激素信號轉(zhuǎn)導”等途徑在濱麥葉片細胞的生理活動中占有重要地位，所涉及到的Unigene數(shù)量也較多，這些次生代謝途徑及信號途徑均為植物體內(nèi)重要的抗逆途徑，能減輕或消除因干旱、鹽堿和病蟲害等逆境引起的活性氧傷害[13]。

NAC：NAC轉(zhuǎn)錄因子基因；DREB：DREB轉(zhuǎn)錄因子基因； NHX2：液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基； SOS1：質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白基因；H+-ATPase I：質(zhì)膜H+-ATP酶I亞基基因； POD21：過氧化物酶基因；TRX：硫氧還蛋白基因；HSP：熱激蛋白基因；RcaB：二磷酸核酮糖羧化酶活化酶B基因；PP：蛋白磷酸化酶基因；Dehydrin：脫水素基因；TIP：液泡膜水通道蛋白基因。NAC:NAC transcription factor gene; DREB:Dehydration responsive element binding protein gene; NHX2:Vacuolar Na+/H+ antiporter 2 gene; SOS1:Plasma membrane Na+/H+ antiporter gene; H+-ATPase I:Plasma membrane H+-ATPase submit I gene; POD21:Peroxidase gene; TRX:Thioredoxin gene; HSP:17 kDa class I small heat shock protein gene; RcaB:Ribulose bisphosphate carboxylase activase B gene; PP:Protein phosphatase 2C gene; Dehydrin:Dehydrin gene; TIP:Tonoplast intrinsic protein.

濱海沙地鹽漬化程度很高，其中Na+是主要的有害離子[22]。過多Na+的吸收會降低植物細胞中K+/Na+比例而引發(fā)離子脅迫[18,23]。降低根部對Na+的吸收、減少對地上部Na+的運輸以及將地上部細胞中的Na+區(qū)隔化至液泡是植物常見的耐鹽策略[24,25]。葉片液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白(NHX)能將細胞質(zhì)基質(zhì)中過多的Na+區(qū)隔化至液泡中，從而降低細胞質(zhì)中Na+的濃度。這個過程由位于液泡膜上的H+-ATP酶或H+-焦磷酸化酶提供能量[23]。位于質(zhì)膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白(SOS1)依靠質(zhì)膜上的H+-ATP酶水解ATP產(chǎn)生的能量將細胞基質(zhì)中的Na+外排至胞外[26]，減少Na+在胞質(zhì)中的積累。在濱麥葉片轉(zhuǎn)錄譜中檢索到注釋為液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白的Unigene 9條、質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白Unigene 6條，暗示濱麥可能通過區(qū)隔化Na+至液泡及外排Na+至胞外這兩種途徑降低葉片細胞基質(zhì)中Na+的含量，減少Na+的毒害。

鹽漬環(huán)境中，離子脅迫和滲透脅迫會進一步引發(fā)氧化脅迫[18,23]?？寡趸?或蛋白)是植物體內(nèi)消除活性氧、應對氧化脅迫的一類重要的抗氧化劑。本研究在濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了175條響應氧化脅迫的Unigene，暗示濱麥葉片中的過氧化作用和抗氧化作用都比較活躍。其中，注釋為過氧化物酶和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶的Unigene數(shù)量多達50條和40條，硫氧還蛋白達37條，說明濱麥葉片細胞中過氧化物酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和硫氧還蛋白在抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，本研究選擇了12個基因進行qRT-PCR驗證。結(jié)果顯示，12個基因在濱麥葉片中均有表達，其中，TIP基因、轉(zhuǎn)錄因子NAC基因和質(zhì)膜H+-ATPaseⅠ基因的表達水平相對較高，而轉(zhuǎn)錄因子DREB基因和 POD21基因的表達水平相對較低，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果基本一致，證明了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性。

綜上所述，本研究采用Illumina HiSeq 2000 高通量測序技術，首次對生長于濱海沙地的耐鹽植物濱麥葉片進行了轉(zhuǎn)錄組分析，在無參考基因組的情況下，采用De novo測序策略構(gòu)建了濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得了大量的轉(zhuǎn)錄組信息。通過與已知的核酸、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對，得到功能注釋成功的Unigene有59 380條，其中發(fā)現(xiàn)了大量參與Na+轉(zhuǎn)運和抗氧化作用的基因。本研究獲得的濱麥葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為進一步研究濱麥基因信息和功能、分析濱麥的耐鹽機理提供了重要參考。