轉(zhuǎn)基因玉米MON88017測(cè)量不確定度的評(píng)定

宋 君, 李 潔, 常麗娟, 王 東,張富麗, 劉文娟, 雍 彬

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心， 四川 成都 610066； 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與農(nóng)業(yè)信息研究所， 四川 成都 610066；3. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 四川 成都 610101)

轉(zhuǎn)基因玉米MON88017品系(商品名稱為YieldGardTMVTTMRootwormTMRR2)是孟山都公司(Monsanto Company)于20世紀(jì)90年代開(kāi)發(fā)的“雙抗”(殺蟲(chóng)兼抗除草劑)轉(zhuǎn)基因玉米.該品系人為構(gòu)建了2個(gè)表達(dá)框：增強(qiáng)啟動(dòng)子eCaMV35S、終止子hsp調(diào)控的殺蟲(chóng)基因Cry3Bb1表達(dá)框和啟動(dòng)子ract、終止子NOS調(diào)控的抗除草劑基因CP4-epsps表達(dá)框.轉(zhuǎn)基因玉米MON88017品系經(jīng)過(guò)安全評(píng)價(jià)后,已有20多年的商業(yè)化種植歷史.1995年美國(guó)首次商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因玉米MON88017,2006年日本和加拿大開(kāi)始種植該轉(zhuǎn)基因玉米品系，2010年巴西和阿根廷也開(kāi)始商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因玉米MON88017,洪都拉斯在2013年批準(zhǔn)商業(yè)化種植該品系[1].轉(zhuǎn)基因玉米MON88017主要用于食品、飼料生產(chǎn)和加工的原材料或直接食用.我國(guó)于2010年批準(zhǔn)進(jìn)口該轉(zhuǎn)基因作物但僅用作加工的原材料，禁止商業(yè)化種植.雖然轉(zhuǎn)基因生物在許多國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)用作食品生產(chǎn)和加工的原材料，但由于種種原因消費(fèi)者不完全接受轉(zhuǎn)基因食品.為了保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益，許多國(guó)家出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因食品的閾值標(biāo)識(shí)管理政策，食品中轉(zhuǎn)基因成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)規(guī)定的閾值必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)[2].因此，對(duì)于國(guó)際貿(mào)易和標(biāo)識(shí)管理，轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的精準(zhǔn)檢測(cè)及測(cè)量不確定度評(píng)定尤為重要.

由于轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)過(guò)程比較復(fù)雜、涉及多個(gè)中間量的測(cè)量以及目標(biāo)片段的(最終)間接測(cè)量，對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響因素較多(多次液體轉(zhuǎn)移、校準(zhǔn)曲線兩次擬合、目標(biāo)片段兩次絕對(duì)定量等).目前，評(píng)估影響測(cè)量因素及大小的方法有多種，但得到學(xué)術(shù)界和計(jì)量領(lǐng)域廣泛認(rèn)可的方法主要有“不確定度傳播”(Law of Uncertainty Propagation,該法文件化為Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement,GUM)和“概率密度分布傳播”(Propagation of Probability Distribution,又名Monte Carlo Method,MCM)2種方法.雖然“GUM”和“MCM”都是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的測(cè)量不確定度評(píng)定方法，但是二者原理不同：前者是對(duì)各影響因子的均值及其不確定度(包括自由度等)通過(guò)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行傳遞，后者是對(duì)各影響因子的整個(gè)概率分布進(jìn)行傳播[3-4].對(duì)于測(cè)量不確定度的評(píng)定，因GUM法存在“輸出量為正態(tài)分布等假設(shè)”的局限[5]，所以GUM法不適用于所有測(cè)量不確定度的評(píng)定.關(guān)于測(cè)量不確定度評(píng)定的研究與應(yīng)用主要集中在物理、化學(xué)和機(jī)械制造等領(lǐng)域[6-10]，在生物領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少[11]，在轉(zhuǎn)基因生物定量檢測(cè)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用更是鮮有報(bào)道,僅見(jiàn)文獻(xiàn)[12-13]，但這些評(píng)定結(jié)果未經(jīng)MCM驗(yàn)證，尚不知GUM法是否適用于轉(zhuǎn)基因生物定量檢測(cè)的不確定度評(píng)定.為了了解“GUM”和“MCM”方法在評(píng)定轉(zhuǎn)基因成分測(cè)量不確定度中的差異及驗(yàn)證“GUM”方法是否適用于轉(zhuǎn)基因成分測(cè)量不確定度的評(píng)定，本文首次采用“GUM”和“MCM”方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定，比較2種方法評(píng)定轉(zhuǎn)基因成分測(cè)量不確定度的差異和確定GUM法在轉(zhuǎn)基因成分測(cè)量不確定度評(píng)定中的適用性.

1 材料與方法

1.1材料、試劑和儀器用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017粉末作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)實(shí)時(shí)熒光PCR儀(擬合校準(zhǔn)曲線).質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017混合樣品(粉末)作為測(cè)試樣品(試樣)；DNA提取和實(shí)時(shí)PCR試劑采用北京TIANGEN生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒和Real Time PCR試劑盒(探針型)；超微量分光光度計(jì)(Thermo，USA)、實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystem Incorporation,Foster city,USA)分別用于DNA質(zhì)量檢測(cè)和測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試樣的內(nèi)源基因zSSIIb和MON88017分子片段的絕對(duì)質(zhì)量(ng或copies);引物和探針采用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、報(bào)道的序列[14].

1.2DNA提取、校準(zhǔn)曲線擬合及PCR體系配制稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017粉末和試樣各100 mg，按照植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作.

將提取到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%轉(zhuǎn)基因玉米MON88017粉末的DNA溶液80 ng/μL，先稀釋到50 ng/μL，然后再以體積比1∶10稀釋成4個(gè)質(zhì)量濃度梯度(濃度點(diǎn))：5、5×10-1、5×10-2、5×10-3ng/μL.根據(jù)Arumuganathan等[15]報(bào)道的玉米基因組大小，100 ng玉米DNA相當(dāng)于3.65×104拷貝DNA.分別取3 μL上述4個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)的DNA溶液作為擴(kuò)增模板校準(zhǔn)PCR儀(擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線)，每個(gè)DNA溶液質(zhì)量濃度點(diǎn)做3次平行校準(zhǔn)試驗(yàn).

25 μL PCR體系中包含 3 μL DNA梯度校準(zhǔn)溶液(或50～100 ng試樣DNA),Taqman?Master mix(2×)12.5 μL，上/下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，補(bǔ)充滅菌水至25 μL.試樣PCR反應(yīng)重復(fù)32次.PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，10 min；95 ℃，15 sec；60 ℃，1 min(40 cycles).

2 數(shù)學(xué)測(cè)量模型

(1)式為轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的校準(zhǔn)曲線

Ct=m×lgA+k，

(1)

式中，A為內(nèi)源、外源基因的絕對(duì)質(zhì)量(單位:ng或copies)，Ct是A的響應(yīng)值(循環(huán)數(shù)閾值)，k和m分別為校準(zhǔn)曲線的截距和斜率.

將試樣內(nèi)源、外源基因的Ct值代入(1)式，計(jì)算獲得試樣內(nèi)源、外源基因的絕對(duì)質(zhì)量.根據(jù)(2)式計(jì)算試樣中外源基因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)C(最終輸出量)

C=A外/A內(nèi)×100%，

(2)

式中,A外、A內(nèi)分別為試樣中外、內(nèi)源基因的絕對(duì)質(zhì)量.

3 不確定度評(píng)定

3.1MCM在轉(zhuǎn)基因玉米MON88017測(cè)量過(guò)程的校準(zhǔn)曲線擬合階段，從校準(zhǔn)子A和Ct(輸入量)的概率分布(probability distribution function,PDF)(根據(jù)已知信息、資料等設(shè)定輸入量的PDF)中分別隨機(jī)抽取M=106個(gè)樣本量，然后將獲得的2個(gè)106個(gè)樣本量(校準(zhǔn)子A和Ct)分別通過(guò)數(shù)學(xué)模型(1)和Sega等[16]報(bào)道的方法獲得模型(1)的中間輸出量m和k.再?gòu)臏y(cè)試樣品Ct的PDF中抽取106個(gè)樣本量，通過(guò)數(shù)學(xué)模型(1)獲得測(cè)試樣品內(nèi)源、外源基因的絕對(duì)質(zhì)量A內(nèi)、A外(中間輸出量)，最后分別從A內(nèi)和A外的PDF中分別抽取106個(gè)樣本量，通過(guò)數(shù)學(xué)模型(2)獲得測(cè)試樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分?jǐn)?shù)C(最終輸出量)的PDF、平均值、標(biāo)準(zhǔn)不確定度以及在95%包含概率下的包含區(qū)間.MCM評(píng)定中的所有計(jì)算由MATLAB程序完成.

3.2GUM法為了與MCM評(píng)定的不確定度成分一致，GUM法只考慮轉(zhuǎn)基因玉米MON88017測(cè)量過(guò)程中不確定度貢獻(xiàn)較大的成分：32次重復(fù)測(cè)量試樣貢獻(xiàn)的不確定度(A類)、用于PCR儀校準(zhǔn)的系列DNA稀釋液產(chǎn)生的不確定度(B類)、校準(zhǔn)曲線擬合的不確定度(B類)以及整個(gè)實(shí)驗(yàn)中液體轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的不確定度.

根據(jù)一階泰勒級(jí)數(shù)近似和GUM法[3]，試樣中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)的測(cè)量不確定度

u(C)=

式中?C/?A88017、?C/?AzSSIIb分別是u(A88017)、u(AzSSIIb)的靈敏度系數(shù)，分別由(4)、(5)式確定.

?C/?A88017=1/AzSSIIb，

(4)

(5)

u(A88017)和u(AzSSIIb)分別是A88017和AzSSIIb的合成不確定度，通過(guò)(6)、(7)式計(jì)算獲得.

u(A88017)=

(6)

u(AzSSIIb)=

(7)

式中,u(rep88017)、u(repzSSIIb)是32次重復(fù)測(cè)量試樣中A88017、AzSSIIb的不確定度(A類),u(cali)是校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度(B類),u(pip)是包括系列DNA稀釋液和PCR體系配制中液體轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的不確定度(B類).

A類不確定度采用Bessel公式計(jì)算:

(8)

根據(jù)GUM法[3]，作為非統(tǒng)計(jì)計(jì)算的B類不確定度u(cali)和u(pip)由(9)和(10)式計(jì)算:

u(cali)=

u(pip)=U(pip)/k，

(10)

式中,U(pip)是測(cè)量中使用的移液器的擴(kuò)展不確定度，k為包含因子.各類量程移液器的不確定度通過(guò)“方和根”[17-18]合成得到整個(gè)實(shí)驗(yàn)中移液器產(chǎn)生的總移液不確定度u(pip).(9)式中的s(Ct)為校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)誤差，由(11)式計(jì)算:

式中,n為校準(zhǔn)測(cè)量次數(shù)，Cti是實(shí)時(shí)PCR儀對(duì)第i個(gè)校準(zhǔn)子的響應(yīng)值(熱循環(huán)數(shù)閾值)，Ai為第i個(gè)校準(zhǔn)子.

轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)C的擴(kuò)展測(cè)量不確定度

U=kp×u(C)，

(12)

式中,kp是特定包含概率下的包含因子，u(C)為轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)C的合成不確定度.

4 結(jié)果

4.1MCM評(píng)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)實(shí)時(shí)定量PCR儀的結(jié)果見(jiàn)表1和表2.校準(zhǔn)子的Ct響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)方差SD都在0.02～0.64范圍內(nèi)，顯示每個(gè)校準(zhǔn)子的三次校準(zhǔn)的平行性較好.測(cè)試樣品中MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果(重復(fù)測(cè)量32次試樣的結(jié)果)見(jiàn)表3.轉(zhuǎn)基因玉米88017測(cè)量過(guò)程中輸入/出量(影響因子)遵守的概率分布和各輸入/出量的平均值、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和95%包含區(qū)間見(jiàn)表4(Ct11～Ct53和Ct11#～Ct53#分別表示zSSIIb基因和88017測(cè)量中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各質(zhì)量濃度點(diǎn)的響應(yīng)值；CtS1～CtS32和CtS1#～CtS32#分別表示試樣32次重復(fù)測(cè)量zSSIIb基因和88017片段獲得的Ct值；AzSSIIb和A88017分別表示試樣中zSSIIb和88017片段的絕對(duì)質(zhì)量；C表示試樣中88017片段的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；mzSSIIb和m88017分別為zSSIIb基因和88017片段的校準(zhǔn)曲線的斜率；kzSSIIb和k88017分別為zSSIIb基因和88017片段的校準(zhǔn)曲線的截距).根據(jù)最小二乘法原理、校準(zhǔn)子與其響應(yīng)值Ct的概率分布，擬合得到的zSSIIb基因和88017片段的校準(zhǔn)曲線方程分別為y=-3.34x+31.81和y=-3.23x+33.06.將試樣Ct的概率分布輸入到zSSIIb基因和88017片段的校準(zhǔn)曲線方程獲得輸出量AzSSIIb和A88017的平均值分別為396.80和5.99 ng，標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為6.62和0.14，95%包含概率的包含區(qū)間分別為383.98～409.92 ng和5.73～6.25 ng.把輸入量AzSSIIb和A88017的概率分布輸入測(cè)量模型(2)式，獲得最終輸出量88017片段質(zhì)量分?jǐn)?shù)C的平均值、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和95%包含概率的包含區(qū)間分別為1.51%、4.23×10-4和1.43%～1.59%.試樣中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.51%，接近理論值(1.50%)，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)偏差為0.7%，不確定度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.1%.在95%的概率下，轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的相對(duì)含量測(cè)量值落在1.43%～1.59%范圍內(nèi).

在所有不確定度成分中，不確定度最大的成分是AzSSIIb(6.62)，其次是第5個(gè)校準(zhǔn)子(0.005 ng/μL及其對(duì)應(yīng)的Ct51、Ct52、Ct53和Ct51#、Ct52#、Ct53#)產(chǎn)生的不確定度(0.64和0.52).此外，除第2個(gè)校準(zhǔn)子(5 ng/μL及其對(duì)應(yīng)的Ct21、Ct22、Ct23和Ct21#、Ct22#、Ct23#)、kzSSIIb和k88017的不確定度較小外(小于0.1)，其余成分的不確定度在0.1～0.3.不確定度最小的成分是最終輸出量C(轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分?jǐn)?shù)).

表 1 zSSIIb內(nèi)源基因校準(zhǔn)曲線擬合

表 2 88017片段校準(zhǔn)曲線擬合

4.2GUM評(píng)定結(jié)果將表1、表2的校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)(B類評(píng)定)、表3的重復(fù)測(cè)量32次試樣的結(jié)果(A類評(píng)定)，代入(3)～(9)、(11)～(12)式計(jì)算得到內(nèi)源基因zSSIIb的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的不確定度uzSSIIb(rep)、校準(zhǔn)不確定度uzSSIIb(cali)以及MON88017片段的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的不確定度u88017(rep)、校準(zhǔn)不確定度u88017(cali)見(jiàn)表5.在本次轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)量過(guò)程中，使用1 000 μL量程的移液器轉(zhuǎn)移625 μL液體2次、320 μL液體2次；使用100 μL量程的移液器轉(zhuǎn)移90 μL液體4次、50 μL液體4次、40 μL液體2次、30 μL液體1次、22 μL液體91次、18 μL液體1次；使用10 μL量程的移液器轉(zhuǎn)移10 μL液體4次、3 μL液體91次.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室1 000、100、10 μL量程的移液器校準(zhǔn)證書(shū)，3種量程移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度(擴(kuò)展不確定度除以包含因子)分別為1.731、0.462和0.069 μL.根據(jù)(10)式和“方和根”方法[17-18]分別計(jì)算得到轉(zhuǎn)移液體625 μL產(chǎn)生的不確定度uV625(pip)、320 μL產(chǎn)生的不確定度uV320(pip)、90 μL產(chǎn)生的不確定度uV90(pip)、30 μL產(chǎn)生的不確定度uV30(pip)、50 μL產(chǎn)生的不確定度uV50(pip)、40 μL產(chǎn)生的不確定度uV40(pip)、22 μL產(chǎn)生的不確定度uV22(pip)、18 μL產(chǎn)生的不確定度uV18(pip)、10 μL產(chǎn)生的不確定度uV10(pip)、3 μL產(chǎn)生的不確定度uV3(pip)以及整個(gè)實(shí)驗(yàn)中移液產(chǎn)生的總不確定度u(pip)(表5).采用GUM法獲得的zSSIIb基因和88017片段的校準(zhǔn)曲線方程分別為y=-3.33x+31.63和y=-3.25x+32.63.試樣中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.54%(表3)，與理論值(1.50%)的相

表 3 測(cè)試樣品中MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

表 4 各輸入/輸出量的分布及不確定度和95%置信度的包含區(qū)間

表 4(續(xù))

對(duì)偏差為3%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.1%(表5).在包含概率為95%時(shí)，kp=2，根據(jù)(12)式獲得轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的擴(kuò)展不確定度為0.2%，即在概率為95%的條件下，轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)量值落在1.34%～1.74%范圍內(nèi).

在GUM法評(píng)定的不確定度成分中，不確定度貢獻(xiàn)最大的成分是u(AzSSIIb)和uzSSIIb(rep)(分別為6.621 0和6.606 4)，其次是u(pip)(0.321 4)，最小的不確定度成分為轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度u(C)(表5).

MATLAB程序運(yùn)行產(chǎn)生的混合樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的概率密度分布為正態(tài)分布,如圖1所示.

表 5 用GUM法評(píng)定MON88017玉米測(cè)量不確定度主要成分的概率分布、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和靈敏度系數(shù)

4.3MCM與GUM法評(píng)定結(jié)果的比較從轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)量結(jié)果來(lái)看，2種方法(MCM為1.51%，GUM法為1.54%)的測(cè)量結(jié)果都接近理論值(1.50%)，但是MCM獲得結(jié)果的相對(duì)偏差(0.7%)小于GUM法獲得的相對(duì)偏差(3%)；MCM計(jì)算得到轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度為4.23×10-4，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于GUM法評(píng)定得到的不確定度2×10-3(0.2%)；在95%的概率下，MCM計(jì)算得到轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)量值分布在1.43%～1.59%范圍內(nèi)，比GUM法評(píng)定得到的范圍1.34%～1.74%窄.這些結(jié)果說(shuō)明，MCM的評(píng)定結(jié)果優(yōu)于GUM法的評(píng)定結(jié)果.此外，轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的概率分布在MCM與GUM法中都呈“鐘型”正態(tài)分布(圖1A和圖1B)，說(shuō)明GUM法適用于轉(zhuǎn)基因生物測(cè)量不確定度的評(píng)定.

5 討論

測(cè)量不確定度是評(píng)估檢測(cè)結(jié)果可靠性的重要參數(shù)，尤其是當(dāng)檢測(cè)結(jié)果位于限量值附近時(shí)，對(duì)產(chǎn)品的符合性判斷必須依靠檢測(cè)結(jié)果的不確定度才能做出正確判斷.本研究的評(píng)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法計(jì)算得到的轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的概率分布都呈正態(tài)分布，充分說(shuō)明了GUM法適用于轉(zhuǎn)基因生物測(cè)量不確定度的評(píng)定.本實(shí)驗(yàn)中盡管GUM法適用于評(píng)定轉(zhuǎn)基因生物測(cè)量不確定度，但由于MCM從每一個(gè)變量的概率分布中隨機(jī)抽取“海量”樣本(106個(gè))進(jìn)行傳遞，所以MCM評(píng)定得到的95%概率下測(cè)量值分布范圍要小于GUM法得到的范圍，不確定度遠(yuǎn)小于GUM法得到的結(jié)果.因此，比較發(fā)現(xiàn)MCM評(píng)定結(jié)果總體優(yōu)于GUM法的結(jié)果.

從本研究采用MCM與GUM法評(píng)定轉(zhuǎn)基因玉米MON88017質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度過(guò)程可以看出，GUM法相對(duì)MCM存在一些局限，如應(yīng)用GUM法需要考慮輸出量的概率分布是否為正態(tài)分布，需要應(yīng)用偏導(dǎo)數(shù)計(jì)算各輸入量的靈敏度系數(shù)等(當(dāng)測(cè)量模型復(fù)雜時(shí)，靈敏度系數(shù)的偏導(dǎo)數(shù)難求).MCM是對(duì)GUM法不確定度評(píng)定的一種補(bǔ)充方法，適用范圍較GUM法大.雖然MCM相對(duì)于GUM法有很多優(yōu)勢(shì)，但是由于MCM是建立在模擬產(chǎn)生“海量”實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上進(jìn)行的測(cè)量不確定度評(píng)定，所以必須依靠計(jì)算機(jī)輔助才能完成.

測(cè)量不確定度的評(píng)定除了可以評(píng)估實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性外，還可以根據(jù)不確定度成分對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)大小，找出影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素.本研究中，MCM與GUM法都發(fā)現(xiàn)AzSSIIb絕對(duì)質(zhì)量的不確定度最大，這可能與特定質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或試樣中細(xì)胞的裂解率、DNA的提取率差異大有關(guān).因此，轉(zhuǎn)基因生物的測(cè)量結(jié)果不采用基因的絕對(duì)質(zhì)量表示，而采用基因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)表示.除此外2兩種方法都顯示液體轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的不確定度對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響較大.事實(shí)上，在轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的定量檢測(cè)中，從配置系列不同質(zhì)量濃度的校準(zhǔn)子、制備PCR混合液、分裝各種液體到添加DNA模板等，累計(jì)使用不同量程的移液器轉(zhuǎn)移各種不同液體上百次.轉(zhuǎn)基因生物定量檢測(cè)中使用的移液器都是微量移液器，維護(hù)和使用不當(dāng)都會(huì)降低移液器的準(zhǔn)確度，加上吸頭可能與移液器不匹配或吸頭對(duì)轉(zhuǎn)移液體的高吸附性等原因?qū)е乱埔涸谵D(zhuǎn)基因生物檢測(cè)過(guò)程中貢獻(xiàn)了較大的不確定度.因此，提高移液的準(zhǔn)確度，降低移液的不確定度是提高轉(zhuǎn)基因生物定量檢測(cè)質(zhì)量的主要因素.