疑似Amelogenin等位基因丟失的檢測與分析12例

畢 潔，暢晶晶，余純應(yīng)

（1.北京明正司法鑒定中心，北京 100070；2.公安部物證鑒定中心，北京 110000）

釉原蛋白質(zhì)（Amelogenin，AMEL）基因編碼牙釉質(zhì)蛋白，分別位于Xp22.1-Xp22.3（2872bp）和Yp11.2（3272bp）[1-4]。目前最常使用的特異性PCR引物是由英國法庭科學(xué)服務(wù)部（Forensic Science Service，F(xiàn)SS）設(shè)計(jì)的，這些引物可連接位于Amelogenin X內(nèi)含子1內(nèi)6bp丟失的側(cè)翼，同時(shí)PCR擴(kuò)增X和Y染色體可獲得106 bp和112 bp的產(chǎn)物[5-6]，電泳結(jié)果顯示女性個(gè)體為1條譜帶（XX），男性個(gè)體為2條譜帶（XY）。但這種檢驗(yàn)方法有時(shí)會因Amelogenin基因的變異而出現(xiàn)性別誤判[4，7-10]，需引起高度重視。 本研究擬對12例常染色體STR圖譜中，男性個(gè)體出現(xiàn)1條譜帶（X或Y）和女性個(gè)體為1條譜帶但峰面積與相鄰雜合子峰面積一致或低于相鄰純合子峰面積1/2的情形進(jìn)行相關(guān)檢測，以進(jìn)一步明確性別。

1 材料與方法

1.1 樣本的選取及檢驗(yàn)

本中心日常親權(quán)鑒定案件（20 723例）中8名社會性別為男性的血樣（包含一對父子）和4名女性血樣。所用樣本提供者均知情同意。

12例血樣前期均經(jīng)SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)（司法鑒定科學(xué)研究院）擴(kuò)增并檢測STR分型。8名社會性別為男性的血樣中，7名的Amelogenin基因座未檢出Amelogenin Y，1名未檢出Amelogenin X；4名女性血樣的Amelogenin基因座中，Amelogenin X的峰面積與相鄰雜合子峰面積一致或低于相鄰純合子峰面積的1/2。

上述樣本均采用Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)17X試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］進(jìn)行補(bǔ)充檢測，同時(shí)針對8例男性樣本增加Yfiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國AB公司）的檢測。

所用試劑盒的擴(kuò)增體系和熱循環(huán)參數(shù)均按照說明書進(jìn)行操作，擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl基因分析儀（美國AB公司）上電泳，使用GeneMapperTMID-X軟件進(jìn)行基因分型。

1.2 Y染色體性別決定區(qū)及Amelogenin X檢驗(yàn)

出現(xiàn)Amelogenin Y丟失的7例男性樣本，經(jīng)EX20試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）于第五色508bp處對Y染色體性別決定區(qū)（sex-determining region of Y，SRY）進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和熱循環(huán)參數(shù)按試劑盒說明書進(jìn)行，在3130xl基因分析儀上電泳，使用GeneMapperTMID-X軟件進(jìn)行基因分型。

對4例疑似Amelogenin X丟失的女性樣本以及1例未檢出Amelogenin X的男性樣本進(jìn)行擴(kuò)增和測序。引物序列參照宮榮彬等[11]的報(bào)道［該研究使用的是PowerPlex?16試劑盒（美國Promega公司）］，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。正向引物：5′-GACCATTGTTTGCGTTAACAATGC-3′；反向引物：5′-GACAGACTGAGTCAGAGTGGC-3′。擴(kuò)增體系 20μL，包括：DNA 模板 2μL，正向引物 1μL，反向引物 1μL，混合物 10 μL，去離子水 6 μL。擴(kuò)增條件：94℃變性1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，取電泳片段進(jìn)行T載體克隆，在3730xl DNA分析儀（美國AB公司）上完成測序。

1.3 Amelogenin等位基因丟失的確定及丟失率統(tǒng)計(jì)

男性樣本中出現(xiàn)Amelogenin X丟失的，經(jīng)檢測X-STR及Amelogenin X測序，與GenBank中Amelogenin X的序列比對確認(rèn)；出現(xiàn)Amelogenin Y丟失的，經(jīng)檢測Y-STR、SRY及X-STR確認(rèn)。女性樣本中出現(xiàn)Amelogenin X峰值極低的，經(jīng)檢測X-STR及Amelogenin X測序，并與GenBank中Amelogenin X的序列比對確認(rèn)。

20723 例親權(quán)鑒定案件的類型包含三聯(lián)體、父子（女）二聯(lián)體和母子（女）二聯(lián)體，無法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)無關(guān)個(gè)體的數(shù)量，故僅統(tǒng)計(jì)Amelogenin等位基因丟失案例在總體案例中的占比，作為Amelogenin等位基因丟失率，并對所得數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 Amelogenin X等位基因丟失

1例男性樣本經(jīng)SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)檢測，顯示Amelogenin X丟失（圖1）。經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)17X試劑盒檢測，顯示X-STR為單峰。Amelogenin X測序結(jié)果與GenBank中Amelogenin X的序列比對，樣本在第304 bp處發(fā)生了A→G突變（圖2），位于 PowerPlex?16試劑盒中Amelogenin基因座引物正向結(jié)合區(qū)3′端的第2個(gè)堿基。

圖1 男性樣本Amelogenin X丟失（圓圈所示）

圖2 男性樣本與GenBank中的序列比對

4例女性樣本經(jīng)SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)檢測，顯示Amelogenin X峰面積與相鄰雜合子的單峰面積相當(dāng)或低于相鄰純合子峰面積的1/2（圖3）。經(jīng)Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)17X試劑盒檢測，顯示X-STR半數(shù)以上基因座為雙峰。經(jīng)Amelogenin X測序，確認(rèn)其中3例女性樣本的Amelogenin X序列均與GenBank中Amelogenin X的序列一致，1例女性樣本也在第304bp處發(fā)生了A→G突變（圖4）。

圖3 女性樣本Amelogenin X峰值偏低（圓圈所示）

圖4 女性樣本與GenBank中的序列比對

2.2 Amelogenin Y等位基因丟失

7例男性樣本（包含1對父子）經(jīng)SiFaSTRTM23plex DNA身份鑒定系統(tǒng)檢測，顯示Amelogenin Y丟失。經(jīng)EX20試劑盒對SRY檢測，其中5例（包含1對父子）SRY為陽性（在508 bp處見特異性峰，其中1例的圖譜見圖5），2例SRY為陰性。5例SRY檢測陽性的案例中：4例（包含1對父子）出現(xiàn)Y-STR部分丟失，X-STR均檢見單峰；1例未檢出Y-STR分型，XSTR檢見雙峰。Y-STR部分丟失的案例中，3例在DYS576、DYS458、DYS456、DYS570、DYS449 基因座出現(xiàn)等位基因丟失，1 例在 DYS576、DYS627、DYS458、DYS570、DYS449、DYS481基因座出現(xiàn)等位基因丟失，且丟失基因座均位于Yp11.2區(qū)域。2例SRY檢測陰性案例均未檢出Y-STR分型，X-STR均檢見雙峰。

圖5 1例男性Amelogenin Y缺失但SRY檢測陽性（圓圈所示）

2.3 Amelogenin等位基因丟失率

經(jīng)上述檢測確認(rèn)Amelogenin X丟失的有2例，確認(rèn)Amelogenin Y丟失的有5例（包含1對父子），在20 723例親權(quán)鑒定案例中占比0.029%（6/20 723，此處未計(jì)算SRY陽性但未檢出Y-STR分型的1例）。與文獻(xiàn)[4]報(bào)道的奧地利人群 0.018%（5/28 182）、澳大利亞人群0.020%（22/109 000）、中國人群0.023%（3/12915）的Amelogenin變異率接近。

3 討 論

3.1 Amelogenin基因座等位基因丟失的機(jī)制及其對性別檢驗(yàn)的影響

Amelogenin X等位基因定位于Xp22.1-Xp22.3區(qū)域。Amelogenin X丟失的發(fā)生機(jī)制多為引物結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變導(dǎo)致擴(kuò)增失敗[7]。突變類型包括G→A單點(diǎn)突變[6，12]、A→G 單點(diǎn)突變[11-12]、G→R（G+A）多點(diǎn)雜合突變[6，12]、C→G 轉(zhuǎn)換[13]和 C→T 單點(diǎn)突變[7，14]等。本研究檢見2例Amelogenin X丟失，均為引物結(jié)合區(qū)突變所致，突變位置均為Amelogenin X序列第304 bp處，突變類型均為A→G單點(diǎn)突變，與宮榮彬等[11]報(bào)道一致。值得注意的是，本研究檢見1例女性樣本Amelogenin X丟失，而其他相關(guān)報(bào)道[4，6]中未發(fā)現(xiàn)女性樣本Amelogenin變異的情況。張彩虹等[15]對親子鑒定中Amelogenin基因擴(kuò)增X片段缺失的1例進(jìn)行分析，孩子（男性）存在Amelogenin X引物結(jié)合區(qū)突變，而其母Amelogenin X的擴(kuò)增峰高在多套試劑盒檢測中均未達(dá)到期望值[16]，由此推斷其母也存在Amelogenin X擴(kuò)增片段丟失的可能。時(shí)永勝等[17]報(bào)道的1例擴(kuò)增圖譜異常的案例中，父親X染色體存在Amelogenin基因的擴(kuò)增丟失，而女兒的Amelogenin基因座峰高和峰面積為正常對照的一半，說明女兒出現(xiàn)這種圖譜可能是在擴(kuò)增時(shí)由于引物結(jié)合區(qū)突變或真正缺失Amelogenin基因?qū)е?。以上兩篇文獻(xiàn)均推斷女性樣本存在Amelogenin X等位基因引物結(jié)合區(qū)突變導(dǎo)致擴(kuò)增片段丟失的可能，但都未行測序確認(rèn)。Amelogenin X等位基因的丟失不會影響性別判定，但會改變X與Y的峰值比例，從而影響男女混合樣本混合比例的判讀[4]。

Amelogenin Y等位基因定位于Yp11.2區(qū)域，該區(qū)域的丟失是Amelogenin Y丟失的主要原因[7，9]。這種情況可以通過Y-STR分型和擴(kuò)增SRY基因[18]來確認(rèn)是否為男性[19-20]。此外，Amelogenin Y引物結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變、染色體易位、XX性反轉(zhuǎn)綜合征等遺傳性疾病均可導(dǎo)致 Amelogenin Y 等位基因丟失[7，21]。 46，XX男性又稱為de la Chapelle綜合征，1964年由de la Chapelle等首先報(bào)道，屬于性反轉(zhuǎn)綜合征（sex reversal syndrome，SRS）的一種，主要表現(xiàn)為患者染色體性別與性腺性別不相符，男性新生兒發(fā)生率為1∶30 000～1∶20000[22]。根據(jù)性別決定基因的檢測結(jié)果，臨床上可將46，XX男性SRS分為SRY陽性（90%）及SRY陰性（10%）兩類[4，23-27]。 本研究 7例男性中，4例檢出 YSTR分型，但存在5～6個(gè)基因座丟失，且丟失基因座均位于Yp11.2區(qū)域，推斷其Amelogenin Y丟失應(yīng)為包含Amelogenin Y在內(nèi)的Yp11.2區(qū)域的Y染色體微缺失。分析伴隨Amelogenin Y丟失的基因座，4例均伴有 DYS576、DYS458、DYS570、DYS449 基因座丟失，與鄧?yán)^良等[9]報(bào)道一致。此外，4例也均伴有DYS456和（或）DYS458 基因座丟失，與文獻(xiàn)[9，28-30]報(bào)道一致。3例未檢出Y-STR分型的男性，X-STR均檢見雙峰，其中1例SRY陽性，2例SRY陰性，推斷這3例男性存在男性SRS的可能，需進(jìn)行染色體核型分析及性別分化相關(guān)基因檢測[21，31-33]確認(rèn)。Amelogenin Y的丟失可能導(dǎo)致男性樣本檢見女性分型，造成性別誤判。

3.2 應(yīng)對方法

由于女性有兩條X染色體，僅一條X染色體上的Amelogenin發(fā)生變異時(shí)，另一條X染色體仍可指示性別，檢驗(yàn)結(jié)果與表型不矛盾，而兩條X染色體同時(shí)發(fā)生突變的概率非常低，所以女性Amelogenin X等位基因的丟失不容易被發(fā)現(xiàn)，對性別判定的影響也較小。對于男性個(gè)體，若發(fā)生Amelogenin Y等位基因的丟失，容易被誤判為女性，而發(fā)生Amelogenin X等位基因丟失則很容易被發(fā)現(xiàn)，對性別判定的影響也較小。

Amelogenin X等位基因丟失的常見原因是引物結(jié)合區(qū)突變，可通過X-STR初步判斷、Amelogenin X測序驗(yàn)證。包含Amelogenin Y在內(nèi)的Yp11.2區(qū)域的Y染色體微缺失是Amelogenin丟失的主要原因，可能造成性別誤判，可通過檢測Y-STR或SRY來明確性別，對于SRY陰性的疑似46，XX男性SRS案例，建議其行染色體核型分析及性別分化相關(guān)基因檢測以進(jìn)一步確認(rèn)性別。