(河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050017)
血栓致死的法醫(yī)學(xué)案件中血栓形成時(shí)間是法醫(yī)病理學(xué)研究和亟待解決的難點(diǎn)和重點(diǎn)。創(chuàng)傷等外部事件發(fā)生肺栓塞死亡的案例中,法醫(yī)檢案時(shí)面臨的關(guān)鍵問題是判斷此次創(chuàng)傷與肺栓塞是否存在因果關(guān)系,肺內(nèi)血栓如何形成、何時(shí)形成及其來源,血栓形成是否與創(chuàng)傷存在時(shí)間上的先后[1-2]等。在原發(fā)性和(或)繼發(fā)性危險(xiǎn)因素作用下血液纖溶和凝血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡,血液在體內(nèi)異常凝結(jié)形成血栓。因各種原因血栓可由其原始形成部位脫落,隨血液循環(huán)到肺形成肺栓塞。血栓的形成轉(zhuǎn)歸過程為血栓形成、血栓機(jī)化和再通。血栓的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,但針對(duì)血栓動(dòng)態(tài)形成的時(shí)間特異性指標(biāo)還未闡明。血栓形成時(shí)序性變化規(guī)律對(duì)于揭示血栓形成特定時(shí)間變化具有重要意義,這對(duì)于解決涉及創(chuàng)傷、疾病等復(fù)雜肺栓塞法醫(yī)學(xué)案例的血栓形成時(shí)間、來源等問題具有指導(dǎo)意義。
本研究通過建立大鼠下腔靜脈血栓動(dòng)物模型,采用特殊染色觀察血栓形成不同時(shí)期組織結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn),并通過免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察CD61、α-SMA和CD34的表達(dá)變化,研究血栓形成不同時(shí)期特異性變化指標(biāo),以期為血栓形成致死性法醫(yī)學(xué)案件的血栓形成時(shí)間鑒定提供依據(jù)。
健康成年雄性SD大鼠80只(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體質(zhì)量(250±10)g,隨機(jī)分為 10 組:建模術(shù)后 0 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、1 周、2 周、3 周和4周組。每組8只大鼠。
兔來源CD61、CD34抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司],兔來源α-SMA抗體(美國Affinity Biosciences公司),生物素化二抗工作液SP-9000(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);BX61型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。
依據(jù)文獻(xiàn)[3],經(jīng)大鼠腹部正中切口入腹,逐層切開至腹腔,切口長度約2cm(下至凝固腺上葉上緣,上至露出肝組織一角),將小腸撥向腹部?jī)蓚?cè)充分顯露下腔靜脈。打開后腹膜,充分游離下腔靜脈及其各屬支,用1#縫合線結(jié)扎左腎靜脈水平以下下腔靜脈各靜脈屬支。確認(rèn)左腎靜脈下2~3mm處為下腔靜脈結(jié)扎點(diǎn),結(jié)扎點(diǎn)下穿過一條4#縫合線,另沿下腔靜脈走行方向并行放置一條4#縫合線。結(jié)扎縫合線至稍有阻力且恰能抽出并行放置的4#縫合線,謹(jǐn)慎抽出并行的4#縫合線。完成深靜脈血栓“狹窄法”模型。依據(jù)下腔靜脈側(cè)支循環(huán)形成,確定觀察血栓形成最長時(shí)間分組。
建模術(shù)后分別依據(jù)各時(shí)間分組取材。取材時(shí)以10%水合氯醛溶液(0.5mL/kg)腹腔麻醉大鼠,自結(jié)扎點(diǎn)起取長度1 cm下腔靜脈段,取材后以10%中性甲醛溶液固定12h,脫水、透明、浸蠟、包埋,4℃保存?zhèn)溆谩2捎檬炃衅瑱C(jī)將術(shù)后各組分別切片后行HE染色、Perls染色、Von Kossa染色和鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)免疫組織化學(xué)染色。
1.5.1 觀察指標(biāo)
HE染色觀察血栓形成、機(jī)化和再通的大致過程;Perls染色和Von Kossa染色分別觀察各組含鐵血黃素析出及鈣鹽沉積情況;SP免疫組織化學(xué)染色觀察CD61、α-SMA、CD34表達(dá)情況,其抗體濃度分別為1∶300、1∶400、1∶4000。
顯微鏡圖像采集后,運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件分別計(jì)算各組切片含鐵血黃素(Perls染色中呈藍(lán)色)、鈣鹽沉積(Von Kossa 染色中呈黑色)、CD61(血栓組織呈棕黃色)陽性表達(dá)部位的累積光密度(integrated optical density,IOD)值。顯微鏡下每組切片選取10個(gè)隨機(jī)視野,運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算α-SMA陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。顯微鏡Olympus cellSens Dimension軟件計(jì)算新生血管腔面積(CD34陽性表達(dá))與原有血管腔面積百分比。
1.5.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
術(shù)后0h未見血栓形成(圖1A);術(shù)后3h微量血小板血栓形成(圖1B);術(shù)后6h血管壁邊緣少許白色血栓形成(圖1C);術(shù)后12h片狀血小板小梁形成;術(shù)后1d大量血小板小梁形成(圖1D);術(shù)后3d血栓增生樣改變(圖1E);術(shù)后4周血栓組織機(jī)化,血管部分再通(圖1F)。
2.2.1 Perls染色
Perls染色可將含鐵血黃素顆粒染成藍(lán)色,其他組織染成紅色。由圖2可見:建模術(shù)后0h~1d未見含鐵血黃素顆粒;含鐵血黃素顆粒最早見于術(shù)后3d,散落于血栓內(nèi)部;術(shù)后3d~4周含鐵血黃素顆粒呈增多趨勢(shì),至術(shù)后4周機(jī)化的血栓組織中釋放出大量含鐵血黃素顆粒。Perls染色觀測(cè)血栓中含鐵血黃素顆粒的IOD值結(jié)果見表1。
圖1 血栓形成、機(jī)化和再通(HE×100)
圖2 含鐵血黃素顆粒(Perls×100)
表1 Perls染色觀測(cè)血栓中含鐵血黃素顆粒(n=8,±s)
表1 Perls染色觀測(cè)血栓中含鐵血黃素顆粒(n=8,±s)
注:1)與相鄰上組比較,P<0.05
組別 IOD 1d 0 3d 514.23±168.65 1 周 945.16±29.331)2 周 1200.37±223.971)3 周 1620.59±520.031)4 周 2980.67±2080.981)
2.2.2 Von Kossa染色
Von Kossa染色可將鈣鹽沉積染成黑色,其他組織呈紅色。建模術(shù)后0h~3d未見鈣鹽沉積,術(shù)后1周血栓內(nèi)見散在鈣鹽沉積。隨建模時(shí)間的延長,鈣鹽沉積增多,包含大量鈣鹽的異物巨噬細(xì)胞體積增大、數(shù)量增多,未經(jīng)吸收的鈣鹽直接存在于血栓組織中形成血栓鈣化,最終形成靜脈石(圖3)。Von Kossa染色觀測(cè)血栓中鈣鹽沉積顆粒的IOD值結(jié)果見表2。
圖3 鈣鹽沉積(Von Kossa×100)
表2 Von Kossa染色觀測(cè)血栓中鈣鹽沉積顆粒(n=8,±s)
表2 Von Kossa染色觀測(cè)血栓中鈣鹽沉積顆粒(n=8,±s)
注:1)與相鄰上組比較,P<0.05
組別 I O D 3 d 0 1 周 1 7 8 1.7 0±1 6 8.8 0 2 周 1 9 4 2.1 7±3 5 9.3 9 3 周 3 4 4 6.8 3±9 0 5.3 4 1)4 周 4 9 9 8.2 5±7 0 0.9 0 1)
CD61最早于術(shù)后3h在血栓內(nèi)部散在表達(dá)(圖4A);術(shù)后3~6h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后1d達(dá)到峰值(圖4B);隨后開始下降,至術(shù)后2周CD61表達(dá)最低(圖4C);隨后在機(jī)化的血栓與管腔形成的二次狹窄部位新形成的血小板血栓內(nèi)重新表達(dá)(圖4D),但低于其峰值。各組免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中CD61的表達(dá)見表3。
圖4 CD61 的表達(dá)(SP×100)
表3 免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中CD61的表達(dá)(n=8,±s)
表3 免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中CD61的表達(dá)(n=8,±s)
注:1)與相鄰上組比較,P<0.05;2)與 1d 組比較,P<0.05
組別 I O D 0 h 1 5 6.3 5±7 5.4 6 3 h 3 7 1 2.6 2±2 5 1 3.0 9 1)6 h 3 8 7 1.8 9±1 3 8 8.4 2 1 2 h 5 0 9 0.4 0±7 2 6.5 5 1)1 d 6 9 9 8.2 8±2 4 6 9.7 3 1)3 d 3 9 7 4.5 1±2 2 7 2.0 4 1)1 周 3 6 9 2.0 6±3 8 1.2 4 2 周 2 4 7 4.3 3±1 4 4 4.4 6 1)3 周 4 6 2 5.6 1±1 5 7 7.3 2 1)4 周 6 1 0 9.3 4±8 6 9.5 4 1)2)
由圖5可見:α-SMA的陽性表達(dá)最早見于術(shù)后3d的血栓組織邊緣,術(shù)后1周表達(dá)達(dá)到高峰。各組免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中α-SMA的表達(dá)見表4。
CD34最初少量表達(dá)于術(shù)后3d靠近管壁的血栓部位的新生內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)(圖6B);術(shù)后1周開始有相對(duì)較大的新生血管形成,CD34表達(dá)面積(新生血管腔面積)約占原有血管腔面積的7.46%,該新生血管通常位于與管壁緊密連接的血栓外部,但內(nèi)部亦可見(圖6C);術(shù)后2~4周,新生血管融合成較大管腔的血管,術(shù)后4周CD34表達(dá)面積可達(dá)原有血管腔面積的21.61%,其內(nèi)有新鮮血液流動(dòng)(圖6D~F)。各組免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中CD34的表達(dá)(新生血管腔面積)見表5。
圖5 α-SMA 的表達(dá)(SP×100)
圖6 CD34 的表達(dá)(SP×100)
表4 免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中α-SMA的表達(dá)(n=8,±s)
表4 免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中α-SMA的表達(dá)(n=8,±s)
注:1)與相鄰上組比較,P<0.05
組別 陽性細(xì)胞數(shù)1d 0 3d 44.86±15.27 1 周 75.40±35.471)2 周 57.22±16.391)3 周 43.40±16.401)4 周 65.75±14.801)
表5 免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中CD34的表達(dá)(n=8,±s,%)
表5 免疫組織化學(xué)染色觀察血栓中CD34的表達(dá)(n=8,±s,%)
注:1)與相鄰上組比較,P<0.05
組別 新生血管腔面積1d 0 3d 0.44±0.05 1 周 7.46±6.081)2 周 17.73±7.371)3 周 19.74±6.471)4 周 21.61±4.351)
血栓形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,常有血小板、纖維蛋白、紅細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種成分參與,這些成分通過影響血液纖溶和凝血系統(tǒng)引起血栓。血小板黏附于受損血管內(nèi)膜是血栓形成的初始步驟,CD61抗原為整合素的β3鏈,CD41抗原為整合素的 αⅡb 鏈,兩者共同形成 CD41/CD61(GPⅡb/Ⅲa)復(fù)合物,該復(fù)合物在細(xì)胞聚集方面發(fā)揮重要作用,其與纖維蛋白原等的結(jié)合是血小板凝集過程的最后途徑[4]。血小板凝集在血管內(nèi)膜,形成混合血栓的頭部。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD61含量的變化,在術(shù)后3h即可見陽性表達(dá),術(shù)后1d達(dá)到高峰,可見廣泛的血小板小梁形成,而后表達(dá)有所下降,至術(shù)后4周血栓與管腔形成的二次狹窄腔隙內(nèi)新生的白色血栓部位CD61重新表達(dá),但表達(dá)量均低于其峰值。
在血栓形成的過程中,成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)與血栓內(nèi)膠原的形成通常相互并行[5]。成纖維細(xì)胞是一種多形性細(xì)胞,當(dāng)成纖維細(xì)胞合成膠原時(shí),呈典型的星狀或紡錘狀外觀。且成纖維細(xì)胞尚參與體內(nèi)多種器官纖維化的過程,當(dāng)在身體任何部位造成創(chuàng)面時(shí),早期主要是多形核粒細(xì)胞,然后逐漸出現(xiàn)淋巴細(xì)胞,直到第3天才出現(xiàn)成纖維細(xì)胞,然后迅速增多。成纖維細(xì)胞具有分化為平滑肌的能力[6],本研究選取的平滑肌動(dòng)蛋白特異性抗體α-SMA最早可見于術(shù)后3d,這與成纖維細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間相一致。
含鐵血黃素是由于組織內(nèi)發(fā)生出血、長期慢性淤血及其他病變時(shí),紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白分解破壞的產(chǎn)物,或者說是紅細(xì)胞釋放出的血紅蛋白被巨噬細(xì)胞吞噬后,經(jīng)溶酶體降解為含鐵血黃素[7]。資料[8]表明,含鐵血黃素在血紅蛋白釋出后2~3d開始形成,含鐵血黃素可見于組織局部存在陳舊性出血灶、梗死灶內(nèi)的各種出血性病變內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn),含鐵血黃素最早見于血栓形成第3天,通常在血栓形成的1周后或更長時(shí)間檢出量增加,這對(duì)于創(chuàng)傷時(shí)間推斷可提供有效佐證。
新近形成的血栓可被溶解吸收,長久形成的血栓既不被溶解又不被充分機(jī)化時(shí),可發(fā)生鈣鹽沉積,最終可形成靜脈石堵塞血管。Von Kossa染色是一種鈣質(zhì)染色法,可將鈣鹽沉積區(qū)染為黑色。本研究于術(shù)后1周血栓內(nèi)見散在鈣鹽沉積,血栓轉(zhuǎn)歸過程中隨著時(shí)間延長鈣鹽沉積增多。血栓內(nèi)出現(xiàn)鈣鹽沉積可以反映血栓形成處于晚期。
目前廣泛應(yīng)用的血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物有CD31/CD34、Tie2、E9、TEC 等[9-11],CD34 為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞[12-13]。研究[14]發(fā)現(xiàn),CD34參與血管內(nèi)皮損傷部位的血管新生、修復(fù)和保持血管內(nèi)皮完整。一般認(rèn)為,除造血干細(xì)胞表達(dá)CD34外,微血管內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)CD34[15]。熊正文等[16]研究認(rèn)為,CD34相關(guān)抗原更敏感,能突出顯示較小的、不成熟的微血管或單一的內(nèi)皮細(xì)胞。本研究選用CD34作為血管內(nèi)皮的特異性標(biāo)記物,最早于術(shù)后3d在血栓邊緣發(fā)現(xiàn)其少量陽性表達(dá),術(shù)后2周新生小血管數(shù)量大量增加,并可見較大管腔血管。血栓內(nèi)部開始出現(xiàn)新生血管說明已處于血栓機(jī)化再通時(shí)期。
血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞廣泛參與了機(jī)體血栓形成的過程。在血栓形成及轉(zhuǎn)歸過程中,上述成分特定時(shí)間的病理學(xué)形態(tài)特點(diǎn)符合一般規(guī)律,但也有其特征性表現(xiàn)。單純的HE染色因其局限性很難對(duì)血栓形成時(shí)間進(jìn)行細(xì)致劃分。本研究結(jié)果示:術(shù)后3 h可見CD61陽性表達(dá)并于術(shù)后1 d達(dá)高峰;術(shù)后3d見含鐵血黃素析出,α-SMA陽性表達(dá);術(shù)后1周見鈣鹽析出,CD34陽性表達(dá)。含鐵血黃素、鈣鹽和CD34表達(dá)呈時(shí)間依從性的遞增趨勢(shì)。而α-SMA自術(shù)后1周達(dá)到峰值后呈下降趨勢(shì),術(shù)后4周時(shí)表達(dá)重新增多可能由于新生血管的增多,在部分新生成毛細(xì)血管平滑肌內(nèi)表達(dá)。術(shù)后4周血栓與管腔形成的二次狹窄腔隙內(nèi)新生的白色血栓部位CD61重新表達(dá),但表達(dá)量低于其峰值。上述指標(biāo)參與了血栓形成,其起始出現(xiàn)的時(shí)間對(duì)于血栓形成時(shí)間推斷有一定意義:CD61可用于血栓形成3h及血栓再形成時(shí)期(4周)的時(shí)間推斷,含鐵血黃素、α-SMA可用于血栓形成3 d的時(shí)間推斷;鈣鹽、CD34可用于血栓形成1周的時(shí)間推斷。以上血栓形成不同時(shí)間的特異性特點(diǎn)可為血栓形成時(shí)間推斷提供參考依據(jù)。本研究在術(shù)后4周已發(fā)現(xiàn)CD61、α-SMA二次表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì);含鐵血黃素、鈣鹽和CD34自起始表達(dá)后呈時(shí)間依從性的遞增趨勢(shì);且建模4周時(shí)結(jié)扎的大鼠下腔靜脈已有明顯側(cè)支循環(huán)的建立,血管再通明顯;4周后血栓形成時(shí)間推斷尚待進(jìn)一步研究。
綜上所述,以上標(biāo)記物在血栓形成過程中時(shí)序性出現(xiàn)的特點(diǎn)有望對(duì)血栓形成時(shí)間推斷提供新的思路。但由于血栓形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,本研究未進(jìn)行4周后更長時(shí)間的研究,對(duì)于血栓形成時(shí)間的具體推斷仍需進(jìn)行更深入的研究。以上研究所得僅在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到確定,有待于在人體得到進(jìn)一步驗(yàn)證從而用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐過程。