高效液相色譜法測定肉松中的淀粉含量

翁晨輝，陳小珍,*，林衛(wèi)星，吳 紅，金志瑜

（1.浙江工業(yè)大學化學工程學院，浙江 杭州 310014；2.浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究院，浙江 杭州 310013；3.浙江迪恩安正檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310024；4.杭州唯新食品有限公司，浙江 杭州 310052）

淀粉是由葡萄糖聚合而成的可食用、可被生物降解的天然高分子化合物[1]。它是植物光合作用的產(chǎn)物，廣泛存在于不同植物的種子、塊莖和塊根等組織中，是全球膳食結(jié)構(gòu)中最豐富的營養(yǎng)來源[2]。淀粉可應用于造紙業(yè)、紡織業(yè)、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、食品加工業(yè)等[3-6]。在食品加工業(yè)中，淀粉具有改善食品質(zhì)量和稠度的作用，在肉制品中，淀粉可作為增稠劑、賦形劑、乳化劑、填充劑等，以改善肉制品持水性、黏著性和組織形態(tài)等物理性質(zhì)，在肉松中淀粉可以起到改善組織狀態(tài)、提高成品率、節(jié)約生產(chǎn)成本等作用[7-13]。

淀粉作為食品添加劑，其添加量的多少是鑒別肉制品質(zhì)量高低及產(chǎn)品合格與否的指標[14]。近年來，我國一些肉制品加工企業(yè)為了追求經(jīng)濟利益濫用淀粉，即使用劣質(zhì)淀粉、過量使用淀粉或在不得添加淀粉的制品中添加淀粉，達到非法盈利的目的。按照國家標準規(guī)定，干肉制品中，肉脯和肉干制品不得添加淀粉，肉松制品中，油酥肉松和肉松的淀粉添加量應小于2 g，肉粉松的添加量應小于30%。2017年6月23日，GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》[15]代替GB/T 9695.14—2008《肉制品 淀粉含量測定》[16]和GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》[17]，但由于GB 5009.9—2016將現(xiàn)行有效的2 種檢測方法合二為一，根本問題并沒有得到妥善解決。在肉松制品檢測過程中，時常出現(xiàn)假陽性或檢測結(jié)果與實際添加量出入較大的情況，若采用不同國家標準方法對同一種樣品進行檢測，檢測結(jié)果差別較大，甚至出現(xiàn)采用一種國家標準方法檢測結(jié)果為“合格”，另一種為“不合格”的情況，不僅如此，該國家標準方法還存在一定局限性，即不適用于同時含有經(jīng)水解也能產(chǎn)生還原糖的其他添加物的淀粉測定，也不適用于大批量樣品的測試，給檢驗和監(jiān)督工作帶來一定困難，也讓不法商販有機可乘，給社會帶來負面影響[18-19]。因此，作為肉松產(chǎn)品評定的重要指標，淀粉的準確測定至關(guān)重要，其檢測技術(shù)的開發(fā)將對日常監(jiān)管起到推動作用。

本實驗擬利用超聲輔助耐高溫α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶水解肉松中的淀粉，通過高效液相色譜法檢測水解液中葡萄糖含量，以此換算為淀粉含量。該方法在國內(nèi)肉松行業(yè)淀粉指標的檢測中鮮有報道，也未見相關(guān)的國家標準，本實驗方法可有效規(guī)避現(xiàn)有國家標準方法的缺點，保證淀粉測定的準確性，且超聲波可提高酶解效率，減少實驗時間。國內(nèi)外對淀粉的檢測主要集中在滴定法、旋光法、比色法、碘顯色法等，但液相色譜法較這些方法具有高靈敏度、高準確性及高效性等優(yōu)點，不僅可以應用于肉松制品，還可以推廣至其他食品，因此采用高效液相色譜法是近年來的發(fā)展趨勢。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）柱前衍生化法被廣泛應用于藥物糖的分析和提取[20-21]，如當歸[22]、七葉膽[23]、白沙蒿[24]、石莼[25]、決明子[26]等。該方法還可應用于其他植物和食品中多糖的檢測。Dai Jun等[27]研究12 種單糖-PMP衍生物的分離，優(yōu)化了流動相、pH值、反應時間等實驗條件，并將該方法應用于鹽藻多糖中單糖成分的分析。Sun Lijun等[28]利用PMP衍生化法和氣相色譜-質(zhì)譜確定蘋果皮多糖中的單糖組成，并比較了這2 種方法的差異點。目前，關(guān)于PMP衍生化法測定肉制品中淀粉的報道較少。本研究建立高效液相色譜測定肉松中淀粉的分析方法，并采用該方法對9 個不同產(chǎn)品進行分析測定和比較，以期為肉松中淀粉的檢測提供新方法，并為肉松的質(zhì)量評價及監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉松、肉絨等樣品 市購。葡萄糖標準品（純度≥99%） 質(zhì)檢科技股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶、PMP 阿拉丁試劑（上海）有限公司；淀粉葡萄糖苷酶 上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（色譜純）美國Tedia公司；0.45 μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

BSA224S型電子分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ-500DA型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀（附紫外檢測器） 日本島津公司；ST16R型高速冷凍離心機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TDL-80-2B型離心機 上海安亭科學儀器；Milli-Q超純水系統(tǒng) 密理博中國有限公司；SHA-CA型水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 國家標準方法對比

GB 5009.9—2016第2法：稱取2 g（精確到0.001 g）樣品，置于放有慢速濾紙的漏斗中，用50 mL石油醚分5 次洗滌樣品，殘渣用150 mL 85%乙醇溶液分數(shù)次洗滌，濾干，用100 mL水洗滌殘渣至250 mL錐形瓶中，加入30 mL鹽酸（1∶1，V/V），置沸水浴中回流2 h。待試樣冷卻后，調(diào)節(jié)pH值至中性，加入200 g/L乙酸鉛溶液和100 g/L硫酸鈉溶液各20 mL，搖勻，定容至500 mL，過濾，棄去初濾液20 mL，濾液供測定。采用斐林試劑法測定濾液中的葡萄糖含量。

GB 5009.9—2016第3法：稱取試樣25 g（精確到0.01 g，淀粉含量約1 g），置于500 mL燒杯中，加入300 mL熱氫氧化鉀-乙醇溶液（5%），沸水浴加熱1 h，不時攪拌。沉淀用80%熱乙醇溶液洗滌數(shù)次后，用100 mL 1.0 mol/L鹽酸溶液洗入250 mL燒杯中，沸水浴中水解2.5 h，不時攪拌。待試樣冷卻后，調(diào)節(jié)pH值約為6，加入106 g/L鐵氰化鉀溶液和220 g/L乙酸鋅溶液各3 mL，用水定容至200 mL。搖勻，過濾，濾液中加入300 g/L氫氧化鈉溶液1～2 滴。采用碘量法測定濾液中的葡萄糖含量。

1.3.2 雙酶水解高效液相色譜法

1.3.2.1 樣品水解

稱取研磨均勻的樣品1.000 g，置于50 mL離心管中，用50 mL石油醚分2 次洗除脂肪，氮吹干肉松層后再用50 mL超純水分2 次洗去可溶性糖類，殘留物加1 000 μL耐高溫α-淀粉酶，并加入超純水至15 mL，超聲20 min，于100 ℃恒溫水浴中糊化60 min，取出冷卻至60 ℃，加入100 μL淀粉葡萄糖苷酶溶液，于65 ℃恒溫水浴中糖化60 min，取出調(diào)節(jié)pH值至2.2，滅酶30 min，定容至20 mL。

1.3.2.2 衍生化處理

采用葡萄糖與PMP試劑衍生化法[29-31]。旋渦酶解液，離心后取上清液10 μL于10 mL離心管中，加入100 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液及100 μL 2 mol/L氨水溶液，于70 ℃水浴中反應30 min，取出氮吹干，加入2 mL超純水和2 mL三氯甲烷，旋渦離心取上清液，重復提取2 次，上清液過0.45 μm濾膜后供高效液相色譜分析。

1.3.2.3 高效液相色譜分析條件

色譜柱：Kromasil 100-5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙酸銨-乙腈（78∶22，V/V）溶液；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；波長245 nm；進樣量10 μL。

配制不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標準溶液，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 國家標準方法對比結(jié)果

如表1所示，同一種樣品采用不同方法檢測，結(jié)果差異明顯，對產(chǎn)品合格與否的評定影響較大。樣品3采用2 種國家標準方法測定，結(jié)果分別為27.60%和13.00%，兩者結(jié)果相差52.9%，采用GB/T 9695.14—2008方法的結(jié)果接近限量值，若干擾物添加量大于現(xiàn)值或存在其他不確定因素，極有可能導致產(chǎn)品（淀粉實際添加值小于限量）淀粉含量超標。同一樣品采用同一方法由不同的檢測人員檢測，其差異明顯，如樣品7和樣品8所示，兩者結(jié)果分別相差31.0%和37.3%。且采用GB/T 9695.14—2008和GB/T 5009.9—2008方法與淀粉實際添加量相差較大，而采用雙酶水解與實際結(jié)果相近，由此表明超聲輔助雙酶水解法是一種可靠準確的方法，可以有效替代現(xiàn)有國家標準方法。

新實施的標準與原GB/T 5009.9—2008相比，主要增加了低含量樣品和試劑空白測定，修改了第1法中的計算公式以及增加了第3法：肉制品中淀粉含量測定，即把原GB/T 9695.14—2008方法合并。

表1 不同檢測方法對相同樣品的檢測Table 1 Comparison of starch contents of known samples determined by different methods

由于GB 5009.9—2016第1法酶水解法與第2法酸水解法在實際樣品的檢測中，檢測結(jié)果基本相同，且酶水解法重復性稍差[32]，所以現(xiàn)階段實驗室多采用第2法和第3法對肉松樣品進行檢測，故本實驗將著重比較這2 種方法的差別。第2法和第3法的原理相似，都是將樣品去脂及可溶性糖后，用酸水解，測定水解液中還原糖含量，并折算成淀粉。2 種方法的差別主要集中在稱樣量，除脂、除糖方法，以及水解方法、時間和測定方法，如表2所示。

表2 國家標準檢測方法的差別Table 2 Comparison of different starch detection procedures

由于肉類本身含有糖類物質(zhì)，如葡萄糖、核糖、糖原等，它們以游離或結(jié)合的形式廣泛存在于動物組織或組織液中，當稱樣量為25 g時，樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)以及肉本身的含糖量較高，易產(chǎn)生誤差。第3法以熱氫氧化鉀-乙醇溶液300 mL于沸水浴上加熱1 h除去脂肪和蛋白質(zhì)，后續(xù)用熱乙醇除可溶性糖，在此過程中粗纖維以及其他糖類物質(zhì)不溶解，將造成結(jié)果正誤差。水解過程中，糖苷鍵水解是隨機的，所以鹽酸用量及酸水解時間是影響淀粉水解的主要因素，若酸用量少，水解時間短，則水解不完全。第3法加入的鹽酸量（平均每克樣品）較第2法多，且水解過程采用沸水浴水解2.5 h，該方法需不停攪拌，若不攪拌，淀粉將附著在燒杯上，造成水解不完全，第2法則采用冷凝回流2 h，水解過程更劇烈。還原糖的測定第3法采用碘量法，第2法采用斐林試劑法，斐林試劑法的指示劑為次甲基藍，其顏色變化受反應液溫度和持續(xù)沸騰加熱時間影響，若滴定過程并沒有完全在沸騰狀態(tài)條件下進行，將導致滴定終點延后，一般沸騰時間短，消耗糖量多，沸騰時間長，消耗糖量少。且肉松樣品多為深色樣品，常導致滴定終點模糊不清，不同操作人員對終點判斷也不同，最終造成誤差。

雙酶水解法具有取樣量少、特異性強、檢測效率高等優(yōu)點，適用于大批量樣品的檢測。如表1所示，相同樣品采用雙酶水解法比采用國家標準方法更準確，含量更低，因為α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶體系對淀粉的水解具有高效性和專一性，經(jīng)酸水解會產(chǎn)生還原性糖的干擾物質(zhì)在雙酶水解法中不存在干擾作用，所以其準確性可以得到有效保證，也可以反映樣品中淀粉添加量的真實情況。且實驗中采用超純水渦旋洗滌肉松樣品，可以比乙醇水溶液更有效除去可溶性糖類。

2.2 葡萄糖色譜行為、檢出限及線性回歸方程

葡萄糖在紫外檢測其中沒有吸收，故不能直接采用紫外檢測器[33-34]。本實驗對葡萄糖進行衍生化處理，使之與PMP反應，該衍生試劑具有強紫外吸收性，且因產(chǎn)物在反相色譜柱中可以保留，在紫外波長245 nm處有強吸收以及無立體異構(gòu)的特性可建立葡萄糖柱前衍生的方法[35-36]。

配制葡萄糖質(zhì)量濃度為5～50 mg/L系列標準溶液，以質(zhì)量濃度-峰面積計算線性回歸方程，Y=54 053.4X-53 945.9，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8，以儀器響應與基線噪音比（RSN=3）計算，儀器檢出限為0.4 μg/mL，方法檢出限為0.16%。色譜圖見圖1。

圖1 葡萄糖PMP衍生物高效液相色譜圖Fig. 1 Chromatogram of glucose PMP derivative

2.3 方法回收率結(jié)果

表3 加標回收率實驗結(jié)果（n=6）Table 3 Recoveries of spiked meat floss samples (n= 6)

精密稱取已知質(zhì)量濃度葡萄糖肉松水解液6 份，加入已知質(zhì)量濃度的葡萄糖標準品適量，進行3 個水平加標測定回收率，每個水平進行6 個平行測定。如表3所示，樣品回收率在88.0%～96.6%之間，方法的相對標準偏差（日內(nèi)精密度）小于5%（n=6）。說明本方法適用于肉松中葡萄糖的含量測定。

2.4 重復性實驗結(jié)果

表4 樣品重復性實驗結(jié)果Table 4 Repeatability of the HPLC method

稱取攪拌均勻的1 g肉松6 份，按酶解條件：液化酶加入量1 000 μL，液化溫度100 ℃，超聲時間20 min，液化時間60 min，糖化酶加入量100 μL，糖化溫度65 ℃，糖化時間60 min進行水解，按1.3.2.2節(jié)衍生化，按1.3.2.3節(jié)色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算葡萄糖質(zhì)量濃度。如表4所示，相對標準偏差為4.62%，表明方法重復性良好。

2.5 方法精密度實驗結(jié)果

取經(jīng)衍生化后的葡萄糖對照品溶液，按1.3.2.3節(jié)方法連續(xù)進行6 次測定，記錄峰面積，如表5所示，相對標準偏差為0.37%，以此表明方法的精密度符合要求。

表5 樣品精密度實驗結(jié)果Table 5 Precision of the HPLC method

2.6 實際樣品的檢測結(jié)果

表6 肉松樣品測定結(jié)果Table 6 Comparison of actual and measured values of starch content in different real samples

利用1.3.2節(jié)方法，對市場上購買的肉粉松、肉絨樣品進行測定，如表6所示，淀粉質(zhì)量分數(shù)分別為0%、8.6%、9.4%、10.4%、11.6%、12.1%、12.9%、13.4%、18.2%。從而驗證了該方法在實際樣品檢測中具有操作性強、專一性高、檢測靈敏度高等特點。

3 結(jié) 論

淀粉的準確定性定量分析是開展肉松食品加工與檢測的必備技術(shù)基礎。利用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶水解淀粉是國際公認的最佳酶解方法[37]，目前已有一些采用普通理化方法測定肉松中淀粉的研究報道，但采用高效液相色譜進行測定的報道較少[38-40]。本實驗建立基于超聲輔助雙酶水解肉松的高效液相色譜法，考察方法的線性范圍、線性方程、檢出限、加標回收率及相對標準偏差，相關(guān)系數(shù)r大于0.999，回收率在88.0%～96.6%之間，相對標準偏差小于5%（n=6），檢出限為0.16%。不同于國家標準中的方法，本實驗可有效排除大豆可溶性多糖類及其他輔料的干擾，實現(xiàn)了方法回收率及靈敏度提高、檢測結(jié)果定性定量準確、穩(wěn)定性好、分析時間縮短等目的。該方法的建立，是對現(xiàn)有標準的改進，對政府部門開展相關(guān)產(chǎn)品的風險監(jiān)測和檢測部門開展相應的常規(guī)分析檢測具有重要的技術(shù)支持作用。