金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001內(nèi)溶素的特性預(yù)測(cè)及克隆表達(dá)

呂曉倩，王靜雪*，林 洪

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種重要的病原菌，不僅能夠引起人的化膿性疾病，同時(shí)也會(huì)引起食源性疾病[1-3]。近年來(lái)由于抗生素的濫用引發(fā)的多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給金黃色葡萄球菌的控制帶來(lái)了極大的困難[4-5]。而噬菌體內(nèi)溶素卻可以很好地解決這一問(wèn)題，噬菌體內(nèi)溶素為噬菌體侵染宿主后期釋放的一種能夠特異性裂解細(xì)胞壁肽聚糖的蛋白[6-7]。已有研究表明內(nèi)溶素能夠有效抑制肺炎雙球菌、炭疽芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯菌、單核細(xì)胞性李斯特菌和沙門(mén)菌等多種病原菌[8-12]。

目前，獲得內(nèi)溶素的方法有兩種，一種是物理提取法[13]，一種是克隆表達(dá)法[14-15]。物理提取法適用于任何噬菌體，但此法獲得的酶液成分復(fù)雜，酶活穩(wěn)定性較差，得率也相對(duì)較低，因此，此方法使用率低，通常制備內(nèi)溶素時(shí)，大多采用的是克隆表達(dá)法?？寺”磉_(dá)法適用于有明確基因序列且基因序列功能明確為內(nèi)溶素的噬菌體[16]?？寺”磉_(dá)的難點(diǎn)在于保證重組蛋白的成功表達(dá)同時(shí)還要保證酶的活性。

在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室分離得到一株烈性金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001[17]，并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，基于相似性分析推測(cè)開(kāi)放式閱讀框56（ORF56）編碼的蛋白為本株噬菌體的內(nèi)溶素。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)多種在線軟件對(duì)ORF56編碼內(nèi)溶素的各項(xiàng)特性進(jìn)行分析[18]，然后選擇用克隆表達(dá)的方法獲得該內(nèi)溶素[19-20]，為下一步內(nèi)溶素裂解特性及應(yīng)用的研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噬菌體為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001，保存號(hào)為CCTCCM 2015553；金黃色葡萄球菌ATCC6538 美國(guó)典型微生物菌種保藏中心；感受態(tài)大腸桿菌TOP10、Rosetta（DE3） 上海生工生物工程股份有限公司；pET-30a質(zhì)粒 德國(guó)Novagen公司。

LB肉湯、LB瓊脂、TSB 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；液體、固體培養(yǎng)基均由成品制劑與純水按規(guī)定比例配制而成；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、咪唑索萊寶生物技術(shù)有限公司；SK3071非干擾型蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒、Ni-IDA填料 上海生工生物工程股份有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、T4連接酶 大連Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F280全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；JY88-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳學(xué)儀器有限公司；DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳槽北京六一儀器廠；Power Wave XS型酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)溶素特性預(yù)測(cè)

1.3.1.1 內(nèi)溶素基因的同源性分析

利用國(guó)際生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的局域相似性比對(duì)工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），采用氨基酸序列比對(duì)，對(duì)ORF56編碼的氨基酸序列進(jìn)行檢索比對(duì)。

1.3.1.2 內(nèi)溶素理化特征預(yù)測(cè)

利用ExPASy Bioinformatics Resource Portal（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)內(nèi)溶素的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等理化特征進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.1.3 內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

采用SMART軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）、InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）和NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)內(nèi)溶素的模塊化結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.1.4 內(nèi)溶素信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)

利用SignalP 4.1服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)內(nèi)溶素是否含有信號(hào)肽。

1.3.1.5 內(nèi)溶素跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）和TMHMM v2.0服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)內(nèi)溶素進(jìn)行跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)。結(jié)合ProtScale程序（http://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)疏水性，輔助判斷跨膜區(qū)預(yù)測(cè)的正確性。

1.3.2 內(nèi)溶素基因的合成與表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.2.1 內(nèi)溶素基因的合成

根據(jù)內(nèi)溶素基因序列設(shè)計(jì)42 條引物（表1），通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出足夠量的目的基因產(chǎn)物。引物設(shè)計(jì)及序列合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 內(nèi)溶素基因擴(kuò)增所需引物Table 1 Primer sequences used for amplification of target gene

續(xù)表1

1.3.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將合成的目的基因純化后用NdeI與XhoI雙酶切，膠回收雙酶切產(chǎn)物，與同樣經(jīng)雙酶切的載體pET-30a連接；利用熱擊法將重組后的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上；挑選陽(yáng)性克隆單菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI與XhoI雙酶切鑒定正確后，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

取1 μL重組pET-30a-lys56質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）表達(dá)菌株，42 ℃熱擊90 s，冰上靜置2 min后涂平板（含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素），37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。

1.3.3 重組蛋白最佳誘導(dǎo)條件的確定

挑取表達(dá)菌株的單菌落于LB培養(yǎng)基（含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素）試管中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將培養(yǎng)的菌液按1∶100比例分別接種于LB培養(yǎng)基中（含30 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL氯霉素），37 ℃、220 r/min培養(yǎng)約3 h。當(dāng)OD600nm值達(dá)到0.6左右時(shí)，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min條件下分別20 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜；37 ℃誘導(dǎo)4 h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的作為陰性對(duì)照。4 000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清液，菌體用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（NaCl 8 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO42.17 g，KCl 0.2 g，配制1 L PBS，pH 7.4）懸浮后，進(jìn)行超聲破碎，分別離心收集上清液和沉淀，沉淀用包涵體溶解液（8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.0）溶解，對(duì)上清液和復(fù)融沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.3.4 重組蛋白的純化及檢測(cè)

將5 mL Ni-IDA填料裝入柱子中，以5 mL/min的流速用10 倍柱床體積的Binding Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）清洗平衡柱子直至基線平穩(wěn)；以2 mL/min的流速上樣并收集穿透液；再以10 mL/min的流速用10 倍柱床體積的Binding Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）清洗柱子后，用Wash Buffer I（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole，pH 8.0）和Wash Buffer II（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Imidazole，pH 8.0）分別以5 mL/min的流速洗脫雜蛋白，最終用Elution Buffer（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L Imidazole，pH 8.0）洗脫目的蛋白。將純化好的目的蛋白透析到蛋白保存液（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）中，0.45 μm濾膜過(guò)濾濃縮分裝，-80 ℃保存，并進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)。

1.3.5 重組蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

利用SK3071非干擾型蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒對(duì)純化好的蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)牛血清白蛋白量為橫坐標(biāo)，用Microsoft Excel軟件繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式；將測(cè)得的待定量蛋白質(zhì)樣品溶液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計(jì)算出所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)溶素特性預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1.1 內(nèi)溶素同源性分析

利用BLAST中氨基酸序列比對(duì)工具BLASTP對(duì)噬菌體qdsa001中的內(nèi)溶素基因編碼的氨基酸進(jìn)行檢索，在公共檢索數(shù)據(jù)庫(kù)中有4 個(gè)同源性非常高的同源蛋白（表2），其中有2 個(gè)均為N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，屬于內(nèi)溶素，并且比對(duì)結(jié)果E值均不大于0，可信度較高。由此可以斷定ORF56編碼的蛋白為噬菌體qdsa001的內(nèi)溶素，并命名為lys56。

表2 噬菌體qdsa001內(nèi)溶素BLAST結(jié)果Table 2 Sequence analysis of endolysin-encoding gene of bacteriophage qdsa001 using BLAST

2.1.2 內(nèi)溶素理化特征預(yù)測(cè)結(jié)果

利用ExPAsy Bioinformatics Resource Portal預(yù)測(cè)內(nèi)溶素的分子質(zhì)量為35.1 kDa，等電點(diǎn)為8.97，氨基酸組成見(jiàn)表3。

表3 氨基酸組成Table 3 Amino acid composition

2.1.3 內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

利用3 個(gè)不同的軟件對(duì)內(nèi)溶素的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)后顯示，內(nèi)溶素中僅存在一個(gè)結(jié)構(gòu)域Ami_2，范圍在18～162 個(gè)氨基酸（圖1）。

圖1 內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 1 Prediction of structural domain of endolysin

2.1.4 內(nèi)溶素信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

利用SignalP 4.1對(duì)內(nèi)溶素信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)Y最大值來(lái)判斷；是否為分泌蛋白通過(guò)S平均值來(lái)判斷，若S大于0.5，則預(yù)測(cè)為分泌蛋白，存在信號(hào)肽。結(jié)果顯示內(nèi)溶素不含有信號(hào)肽。

圖2 內(nèi)溶素信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig. 2 Prediction of signal peptide of endolysin

2.1.5 內(nèi)溶素跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

一般蛋白折疊時(shí)會(huì)在潛在的跨膜區(qū)出現(xiàn)高疏水值區(qū)域，而TMHMM Server v.2.0和TMpred（一般分值大于1 500代表預(yù)測(cè)為跨膜螺旋區(qū)）都未預(yù)測(cè)到跨膜結(jié)構(gòu)（圖3A、C），ProtScale（負(fù)值越大表示親水性越好，正值越大表示疏水性越好）進(jìn)行了疏水性預(yù)測(cè)，也未預(yù)測(cè)到疏水性區(qū)域（圖3B），兩個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。因此，此內(nèi)溶素中并無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)存在。

圖3 內(nèi)溶素基因編碼蛋白跨膜區(qū)以及疏水性預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of transmembrane helices and hydrophobicity of endolysin

2.2 內(nèi)溶素的克隆表達(dá)及純化

2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

由上海生工生物工程有限公司合成的目的基因，通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖4），在1 000 bp左右有一清晰條帶，與預(yù)期的片段大小918 bp相符合（泳道2）。將內(nèi)溶素基因與原核表達(dá)載體pET-30a相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-lys56。利用NdeI與XhoI雙酶切重組質(zhì)粒可以切出預(yù)期大小的片段（泳道3）。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒的插入序列與內(nèi)溶素目的基因一致。

圖4 合成的目的基因及重組質(zhì)粒雙酶切后電泳圖Fig. 4 Target gene and recombinant plasmid double digested by NdeI and XhoI

2.2.2 最佳誘導(dǎo)條件的確定

圖5 重組蛋白SDS-PAGE圖Fig. 5 Endolysin expression detected by SDS-PAGE

由圖5可見(jiàn)，經(jīng)20 ℃過(guò)夜和37 ℃、4 h的條件誘導(dǎo)后，上清液和沉淀中在35.0 kDa處均有明顯的蛋白條帶，最終選擇20 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)作為誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。

2.2.3 目的蛋白純化及檢測(cè)結(jié)果

將表達(dá)菌株在最佳誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)后，超聲裂菌并離心收集上清液，利用鎳瓊脂糖親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。將上清液直接通過(guò)Ni-IDA層析介質(zhì)，用不同濃度的咪唑洗脫，收集不同過(guò)程中流出的液體，并對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE分析。由圖6可見(jiàn)，咪唑濃度為20 mmol/L和50 mmol/L時(shí)，洗脫出大量雜蛋白，當(dāng)咪唑濃度為500 mmol/L時(shí)，有大量的目的蛋白被洗脫。

圖6 鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE圖Fig. 6 Purification of recombinant endolysin by Ni-IDA affinity chromatography

圖7 純化目的蛋白SDS-PAGE（A）及Western Blot免疫印跡（B）圖Fig. 7 SDS-PAGE (A) and Western Blot (B) analysis of purified recombinant protein

將得到的高純度目的蛋白進(jìn)行最終的SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)，最終確定內(nèi)溶素lys56表達(dá)成功（圖7）。

2.2.4 目的蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果

蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-0.005 4x＋0.980 1，R2=0.995 4。通過(guò)計(jì)算得到目的蛋白質(zhì)量濃度為5.77 mg/mL。

3 討 論

與噬菌體相比，內(nèi)溶素在應(yīng)用上具有眾多優(yōu)勢(shì)，尤其是其成分僅為蛋白質(zhì)，因而在食品的應(yīng)用中安全性更具有保障[21-23]。

基于基因序列的分析通常是利用各種生物學(xué)軟件通過(guò)與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)信息的相似性比對(duì)，從而快速了解未知基因的功能，并對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行功能和結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)[24-26]。本實(shí)驗(yàn)利用多種在線軟件對(duì)內(nèi)溶素的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜域和結(jié)構(gòu)域等多個(gè)特性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示內(nèi)溶素lys56分子質(zhì)量為35.1 kDa，等電點(diǎn)為8.97，無(wú)信號(hào)肽和跨膜域，僅擁有一個(gè)結(jié)構(gòu)域Ami_2。

內(nèi)溶素lys56因其編碼基因?yàn)橐阎蛩?，故而選擇克隆表達(dá)的方法獲得內(nèi)溶素。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是開(kāi)發(fā)最早、技術(shù)最成熟的異源蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)；pET系列質(zhì)粒因其克隆表達(dá)融合蛋白的高效性以及帶有多種可選擇的融合標(biāo)簽，是目前應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)載體系統(tǒng)[27-28]。pET-30a質(zhì)粒含有組氨酸標(biāo)簽，通常來(lái)說(shuō)，組氨酸標(biāo)簽肽段相對(duì)親水，不會(huì)對(duì)蛋白的三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此在通常情況下含有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白仍然能表現(xiàn)出完全的活性[29]，并且也可以大大地簡(jiǎn)化后續(xù)的純化步驟[30-31]。本實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌TOP10為表達(dá)宿主菌，pET系列中的pET-30a質(zhì)粒為表達(dá)載體，將合成的目的基因插入原核表達(dá)載體pET-30a中，成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-lys56，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，獲得了表達(dá)穩(wěn)定的基因工程菌，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG于20 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)，獲得較高量目的蛋白的上清液表達(dá)。

總之，本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法快速分析了內(nèi)溶素的各項(xiàng)特性并成功地表達(dá)了金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001的內(nèi)溶素lys56，為其裂解特性、裂解機(jī)制的探究以及應(yīng)用提供了理論支持。