傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包面團微生物菌群結構分析

趙烜影，苑秀娟，郭 鸰,*，董艷如，孫 琦

（1.東北農業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.安達市畜牧獸醫(yī)局，黑龍江 安達 151400）

發(fā)酵食品是指以微生物發(fā)酵為基礎而制作的一類食品的總稱，常見的發(fā)酵食品按原料來源可以分為發(fā)酵豆類制品、發(fā)酵谷類制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵蔬菜類制品、發(fā)酵乳制品以及發(fā)酵茶制品[1]。在中國谷類發(fā)酵食品是最常見的主食，主要有饅頭、醪糟、面包、醋、酒、發(fā)酵米粉、面醬及發(fā)面餅類等[2]。饅頭、面包、包子、發(fā)面餅和黏豆包等需要將粉碎的面粉與其他成分（液體）揉捏形成面團作為發(fā)酵的基礎，因此酵母和乳酸菌發(fā)酵的面粉與水的混合物構建了一個生態(tài)系統(tǒng)[3-6]。世界范圍內的典型面團生態(tài)系統(tǒng)有[7]：埃及Balady-Soltani酸面團，發(fā)酵微生物主要是乳桿菌（約占63%～64%）；印度南部Idli酸面團，其優(yōu)勢菌是腸系膜明串珠菌，其次為糞腸球菌，這種面團與傳統(tǒng)以酵母菌起發(fā)的面團不同，主要是由腸系膜明串珠菌起發(fā)產(chǎn)生；中歐式面團Lindneri酸面團中的代表微生物為從啤酒中分離得到的短乳桿菌；美國舊金山地區(qū)的San Francisco面團中產(chǎn)酸主要微生物是異型發(fā)酵乳桿菌；伊朗Sangak酸面團里產(chǎn)酸發(fā)酵的主要微生物是約占微生物數(shù)量77%以上的腸系膜明串珠菌、短乳桿菌和植物乳桿菌。在穩(wěn)定的面團中，通常含有特定的酵母菌和乳酸菌。多項相關研究報道指出，單一面團在特定時間內一般只含有一種或兩種酵母菌，其中矮小假絲酵母（Candida humilis）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的出現(xiàn)較為頻繁[8]。Desiye等[9]應用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術對埃塞俄比亞主食之一煎餅Enjera中的乳酸菌和酵母菌進行了分離、鑒定和識別，在34 種樣品中得到107 株乳酸菌和68 株酵母菌。

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一種不依賴于純培養(yǎng)的分離技術[10]，而且DGGE技術相較于瓊脂糖電泳和聚丙烯酰氨凝膠電泳分辨率高[11]，分析微生物群落可以獲取其高分辨率圖譜并對圖譜的信息進行生物學上的合理解釋[12]。因其快速、靈敏、分析全面等特點已被廣泛應用于微生物生態(tài)學的研究中[13-14]。近年來，聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術已經(jīng)直接應用于食品領域[15-16]。烏日娜等[17]利用PCR-DGGE技術成功研究了酸湯子面團中的微生物菌群多樣性。Ercolini等[18]應用此技術純化天然乳清培養(yǎng)基的DNA片段，從中鑒定出德氏乳桿菌和乳球菌。Yoshikawa等[19]用活菌計數(shù)和DGGE分別監(jiān)測了小麥和酸面團中菌群的動態(tài)變化。

黏豆包又稱黃豆包或豆包，由大黃米或江米與玉米按一定比例混合經(jīng)自然發(fā)酵后，包裹紅豆餡蒸制而成的冷凍類面制食品。具體做法是把大黃米或江米泡12 h，適當晾干后磨面，將黃米或江米與玉米適度混合，冷水和面，進行發(fā)酵（一般1～3 d），待有酸味飄出，用手揉面，此步?jīng)Q定黏豆包制作的成功與否，及口感與色澤。將紅豆制餡，用揉好的面團將豆餡包入，蒸制20 min即可。將這種易于儲藏、食材易得、營養(yǎng)豐富的滿族特色美食推廣開來，豐富多樣化飲食餐譜，對黏豆包加工進行升級與產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

目前國內對傳統(tǒng)黏豆包的研究較少，僅有李琦等[20]對采用低溫長時間發(fā)酵的自然發(fā)酵糯玉米黏豆包中優(yōu)勢乳桿菌進行了純培養(yǎng)分離鑒定的研究，然而應用分子生物學方法對其產(chǎn)品的研究鮮見詳細報道。其中黏豆包發(fā)酵面團的微生物菌群結構是影響產(chǎn)品功能特性的重要因素之一[21-24]，并且微生物菌群組成是發(fā)酵條件受限的關鍵節(jié)點，同時也是黏豆包工業(yè)化生產(chǎn)受到阻礙的主因。本實驗采用傳統(tǒng)黏豆包原料大黃米和江米，通過高溫過夜發(fā)酵，并利用16S rDNA V3區(qū)和26S rDNA D1區(qū)通用引物進行PCR-DGGE指紋技術分析，對傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包面團中微生物菌群組成進行快速、深入的探索，以期為實現(xiàn)黏豆包產(chǎn)品的工業(yè)化、規(guī)?；?、自動化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機抽取2012年11月份東北地區(qū)黑龍江省安達市不同家庭的傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包發(fā)酵終點面團樣品5 種，其中3 種樣品為大黃米黏豆包發(fā)酵面團，標記為P1、P2、P3；另外2 種樣品為江米黏豆包發(fā)酵面團，標記為G1、G2；樣品P4為同一時間段實驗室條件下模擬制備的大黃米黏豆包發(fā)酵面團，無菌操作取樣并收集于已滅菌的收集盒中，保存于-20 ℃。

2×Taq PCR Master Mix（含染料）雙丙烯酰胺、過硫酸銨、F338-G、引物 北京博奧拓達科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PL203型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TCL-16C離心機 上海安亭科學儀器廠；ABI-9700型PCR擴增儀 美國ABI公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；UVP凝膠呈相系統(tǒng)、DGGE儀 美國Bio-Rad公司；紫外-可見透射反射儀 上海精科實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黏豆包發(fā)酵面團的收集

實驗室條件下，模擬傳統(tǒng)黏豆包自然發(fā)酵面團的制備流程如下：

原料取用市售大黃米與玉米面，大黃米用清水先淘洗以淘凈沙子，開水浸洗，浸泡大約10 h后，晾至大半干后用粉碎機磨成面。設定玉米面-大黃米面按質量比1∶3混合均勻，再用熱水和面，摻水量約是面量的80%。先用少量開水燙面，再加溫水混合到面團黏合而不黏手為合適。和好的面置42 ℃溫箱內發(fā)酵12 h，取出翻新揉面揣平，再繼續(xù)醒發(fā)2 h。

1.3.2 黏豆包發(fā)酵面團中微生物總DNA提取

按1∶9（g/mL）的比例將面團樣品與滅菌的0.9%食鹽水振蕩混勻，參照十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）-溶菌酶法[24]對樣品微生物總DNA提取。將得到DNA沉淀自然風干，然后加入40 μL TE緩沖液（含10 μg/mL的RNaseA）溶解，37 ℃保溫2 h后，-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 PCR擴增

細菌16S rDNA V3區(qū)采用表1中的通用引物對338f-GC和518r進行擴增[22-23]。PCR體系50 μL：4 μL（約50 ng）模板DNA，1 μL 338f-GC1，1 μL 518r，25 μL 2×Taq PCR Master Mix（含染料），去離子水補足總體系為50 μL。反應參數(shù)：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，65～56 ℃（-1 ℃/ 2 個循環(huán)）退火1 min，72 ℃延伸1 min，20 個循環(huán)；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。對所得的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對符合要求的PCR產(chǎn)物進行后續(xù)實驗。

酵母菌26S rDNA D1區(qū)采用表1中的通用引物對NL1-GC2和LS2進行擴增[25-26]。PCR體系50 μL：4 μL模板DNA，1 μL的NL1-GC2，1 μL的LS2，25 μL的2×Taq PCR Master Mix（含染料）用去離子水稀釋至50 μL。反應參數(shù)：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。對所得的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對符合要求的PCR產(chǎn)物進行后續(xù)實驗。

表1 PCR引物和GC夾序列Table 1 PCR primers and GC clamps used in this study

1.3.4 黏豆包發(fā)酵面團16S rDNA V3區(qū)和26S rDNA D1區(qū)DGGE分析

電泳采用The DCodeTM Universal Mutation Detection System系統(tǒng)，基因片段大小在200 bp左右，選用8%的DGGE變性凝膠，16S rDNA V3區(qū)變性梯度為35%～60%，26S rDNA D1區(qū)變性凝膠梯度為35%～70%。電泳條件：上樣量為40 μL，1×TAE電泳緩沖液，60 ℃（DNA的最適變性溫度），電壓130 V，電泳時間8 h。電泳結束后，膠樣用GeneFinder核酸染料染色30 min。UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Quantity One軟件進行相應分析。所得到的DGGE圖譜中，在紫外割膠儀中用無菌手術刀將清晰、亮度較高且分離較明顯的優(yōu)勢帶切下，裝入無菌的EP管中。將切好的膠塊用100 μL去離子無菌水清洗2～3 次，然后再加入50 μL去離子無菌水將膠塊搗碎，4 ℃過夜后取其上清液作為模板，16S rDNA V3區(qū)去掉“GC夾”的338f和518r引物對其進行PCR擴增，26S rDNA D1區(qū)采用去掉“GC夾”的NL1和LS2引物對對DNA樣本進行PCR擴增，PCR體系及條件同1.3.3節(jié)。最后，將PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智測序公司進行基因測序，測序結果對比GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA V3區(qū)和26S rDNA D1區(qū)的擴增結果

2.1.1 黏豆包發(fā)酵面團細菌16S rDNA V3區(qū)擴增結果

采用細菌16S rDNA V3區(qū)通用引物（表1），以提取獲得的6 種樣品的總DNA為模板，按照1.3.3節(jié)的體系及相應的降落式PCR程序進行擴增，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，得到圖譜見圖1，Marker I標記顯示其DNA片段對應大小約為200 bp，而且獲得的條帶完整一致，無明顯雜帶，可認定為目標條帶。

圖1 不同黏豆包樣品16S rDNA V3區(qū)PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 PCR fingerprints of V3 region of bacterial 16S rDRNA genes from sticky bean stun samples

2.1.2 黏豆包發(fā)酵面團酵母菌26S rDNA D1區(qū)擴增結果

采用酵母菌26S rDNA D1區(qū)通用引物（表1），對提取獲得的6 種樣品的總DNA按照1.3.3節(jié)的體系及相應的PCR程序進行擴增，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到圖譜見圖2，D2000標記顯示其DNA片段大小約為250 bp，獲得的條帶清晰均一，無明顯雜帶，因此可認定為目標條帶。

圖2 26S rDNA V3區(qū)PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 PCR fingerprints of D1 region of 26S rDNA genes of yeasts from different sticky bean bun samples

2.2 黏豆包發(fā)酵面團中菌群組成DGGE指紋圖譜分析

2.2.1 黏豆包發(fā)酵面團細菌DGGE指紋圖譜分析

表2 細菌和酵母菌DGGE條帶測序結果Table 2 Sequencing results of the bands selected from the bacteria and yeast DGGE profiles

DGGE圖譜條帶數(shù)目可以直觀地反映黏豆包發(fā)酵面團樣品中細菌組成的多樣性。表2顯示，黏豆包面團6 種樣品的細菌DGGE圖譜總共發(fā)現(xiàn)7 個特異性擴增條帶，其條帶數(shù)量和細菌分布情況各不相同，說明黏豆包面團樣品中細菌分布有著較大的差異性。樣品G1、G2和P4中條帶數(shù)目與其他3 種樣品相比較多，說明采用江米為原料制作黏豆包的樣品中細菌的種類比較豐富；P1的條帶數(shù)目最少，說明原材料的選擇與制作人的技巧及環(huán)境對細菌多樣性有一定影響。對7 個特征條帶繼續(xù)回收和測序，測序結果進行BLAST同源性比對，結果如表2所示。

黏豆包面團6 個樣品中共檢測出5 種細菌，他們分別屬于4 個菌屬。食竇魏斯氏菌和腸膜明串珠菌在6 個樣品中均檢測出，且在多個樣品中條帶明亮，更寬，說明二者無論是大黃米或江米為原料面團中都存在很多。融合魏斯氏菌僅在大黃米和玉米混合的黏豆包面團樣品中檢出，說明為大黃米發(fā)酵面團的特有菌屬。此外，乳桿菌屬中的羅氏乳桿菌、乳酸乳球菌也在黏豆包面團中檢出。由此推斷，食竇魏斯氏菌和腸膜明串珠菌為黏豆包發(fā)酵面團樣品中所占比例最高，屬于黏豆包的優(yōu)勢細菌菌群；且不同谷物為原料制作的黏豆包面團可能存在獨有的特有菌屬。

從條帶分布結合鑒定結果可知，即使同一地區(qū)采集的相似原料加工的黏豆包樣品中細菌結構也存在差異，這一發(fā)現(xiàn)與同為東北滿族谷物發(fā)酵食品“酸湯子”的細菌結構分析結果一致。烏日娜等[17]發(fā)現(xiàn)遼寧丹東地區(qū)3 個不同人家的酸湯子中細菌菌群分布差異明顯，植物乳桿菌和類腸膜魏斯氏菌為酸湯子樣品的優(yōu)勢細菌菌群。李曉紅[30]運用傳統(tǒng)分離鑒定方法，從自然發(fā)酵小麥面粉面團中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢菌。而對5 份中國傳統(tǒng)小麥面粉發(fā)酵面團的高通量測序結果顯示明串珠菌屬、乳酸桿菌和魏斯氏菌屬是其中的優(yōu)勢菌屬[31]。以江米為原料的黏豆包發(fā)酵面團中還鑒定到了作為國際公認益生菌的羅氏乳桿菌，該菌曾在一種發(fā)酵食品Ting中分離得到，早在2003年中國衛(wèi)生部即批準它為可用于人類健康的保健產(chǎn)品，具有很高的理論研究和生產(chǎn)應用價值[32-33]。

圖3 不同黏豆包樣品的細菌DGGE指紋圖譜Fig. 3 DGGE profiles of V3 fragments of bacterial 16S rDNA genes from sticky bean bun samples

2.2.2 黏豆包發(fā)酵面團中酵母菌DGGE指紋圖譜分析

圖4 不同黏豆包樣品的酵母菌DGGE指紋圖譜Fig. 4 DGGE profiles of D1 fragments of 26S rDNA genes of yeasts from sticky bean bun samples

黏豆包發(fā)酵面團樣品中酵母菌PCR鑒定后所得對應的DGGE圖譜及其各條帶基因測序后在NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對后的結果分別見圖4和表2。結果顯示，酵母菌DGGE圖譜中獲得5 個優(yōu)勢條帶，每個樣品的擴增條帶呈現(xiàn)出較大的差異性，得到的條帶數(shù)量、酵母分布情況以及清晰度較細菌相比，都有較大下降。其中發(fā)現(xiàn)的誕沫假絲酵母在6 個樣品中均有條帶顯現(xiàn)，傳統(tǒng)手工家庭制作的黏豆包面團中都發(fā)現(xiàn)了卡利比克畢赤酵母，普蘭久浩酵母中以大黃米和玉米為原料發(fā)酵的黏豆包面團中出現(xiàn)的條帶明亮而清晰。此外在實驗室模擬加工的黏豆包面團里出現(xiàn)了一種不能培養(yǎng)的酵母菌。

由此推測，黏豆包面團中的優(yōu)勢酵母菌屬為誕沫假絲酵母。不同原料發(fā)酵的黏豆包存在各自的特征條帶，暗示可能存在機會發(fā)酵菌種，專一利用特有的酵母進行發(fā)酵，本研究中的卡利比克畢赤酵母就可能屬于其中之一。本研究還鑒定出的普蘭久浩酵母屬于耐冷酵母，黏豆包的加工多為冬天，而普蘭久浩酵母能高產(chǎn)乳糖酶，東北極冷條件下也保有很高活性。以玉米為原料發(fā)酵制成的酸湯子中的優(yōu)勢真菌也有普蘭久浩酵母。將普蘭久浩酵母的產(chǎn)低溫乳糖酶分離用于食品加工領域具有較高的應用價值[34]。陶東婭等[35]研究黑龍江牡丹江市東寧縣以大黃米-玉米質量比3∶1的黏豆包酸面團的真菌菌群發(fā)現(xiàn)米根霉、熱帶假絲酵母、釀酒酵母和異常畢赤酵母為優(yōu)勢菌屬；同時也發(fā)現(xiàn)不同地域黏豆包面團中細菌的多樣性比真菌的豐富。

3 結 論

本研究對黑龍江省傳統(tǒng)自然發(fā)酵黏豆包面團微生物菌群組成進行探究，發(fā)現(xiàn)菌群結構與面團的原料組成有關，揭示了可能在黏豆包發(fā)酵過程中起關鍵作用的菌群，了解東北地區(qū)利用傳統(tǒng)方法自然發(fā)酵的黏豆包中微生物的種類。結果發(fā)現(xiàn)黏豆包面團中細菌較酵母相比種類更為多樣，明串珠菌屬、魏斯氏菌和假絲酵母為優(yōu)勢菌群，乳桿菌屬為優(yōu)勢細菌菌屬。今后可以通過純培養(yǎng)從黏豆包中獲得相關菌株研究其功能特性，以期找出黏豆包發(fā)酵的具體功能菌，進一步為改良黏豆包品質，實現(xiàn)黏豆包工業(yè)化、規(guī)?；⒆詣踊峁├碚撘罁?jù)。