KIBRA基因多態(tài)性對(duì)健康年輕志愿者海馬亞區(qū)體積影響的研究

梁雪，王芳芳，王坤，張慶雷，吳思楚，青釗，張?chǎng)?，李茗，張?/p>

作者單位：

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，醫(yī)學(xué)影像科，南京 210008

基因?qū)W研究表明腎腦表達(dá)蛋白(kidney and brain expressed protein，KIBRA) rs17070145位點(diǎn)基因與人類記憶功能密切相關(guān)[1]。雖然先前研究認(rèn)為KIBRA作為一種突觸后支架蛋白，涉及囊泡運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)和突觸發(fā)生等過程[2]，但其確切潛在神經(jīng)機(jī)制還并不清楚。研究表明KIBRA的多態(tài)性對(duì)記憶功能影響與海馬的結(jié)構(gòu)和功能變化有密切的聯(lián)系[1，3-4]。功能磁共振研究顯示CC純合子攜帶者與T基因攜帶者間海馬功能激活程度存在差異[1，3]，結(jié)構(gòu)磁共振研究結(jié)果顯示T基因攜帶者較非T基因攜帶者海馬體積增大[5-6]，并且在健康老年人中的研究顯示CA2和CA4/齒狀回海馬亞區(qū)的體積也有差異[6]。這些研究中，大部分研究對(duì)象都是西方人群，對(duì)中國漢族人群的研究還較少。目前發(fā)現(xiàn)一篇功能磁共振關(guān)于KIBRA基因多態(tài)性和腦默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)及執(zhí)行網(wǎng)絡(luò)影響的研究[7]，還有一篇磁共振擴(kuò)散峰度成像的研究[8]。但還未見關(guān)于磁共振海馬亞區(qū)研究的報(bào)道。因此，本研究采用磁共振海馬亞區(qū)體積自動(dòng)分割方法，研究KIBRA基因多態(tài)性對(duì)健康年輕人海馬亞區(qū)體積的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究志愿者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1) 20～30歲；(2)中國國籍；(3)漢族；(4)右利手；(5)無神經(jīng)及精神系統(tǒng)疾病；(6)無腦創(chuàng)傷、藥物及酒精依賴史或其他可能影響腦結(jié)構(gòu)與功能的疾?。?7)無MR檢查禁忌證。本研究經(jīng)過南京鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有志愿者均自愿參加實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)前簽署知情同意書。

根據(jù)上述入組標(biāo)準(zhǔn)，共招募志愿者63名，其中由于3名缺少血液樣本及基因型數(shù)據(jù)被排除；最終60名志愿者納入本研究。

1.2 基因分型

所有被試均留取外周靜脈血約2 ml，ED-TA抗凝，-80℃冰箱存儲(chǔ)。利用EZgeneTM血液gDNA小量提取試劑盒，從1 ml全血中提取受試者的基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligation detection reaction，LDR)的方法[9-10]，檢測(cè)受試者KIBRA基因rs17070145位點(diǎn)C/T等位基因多態(tài)性；一共分為3種基因型：C/C、C/T和T/T。根據(jù)不同基因型將受試者分成兩組，一組為C等位基因攜帶者(包括C/C和C/T)，另一組為TT純合子攜帶者。

本研究中60名志愿者中，有2名C/C純合子，21名C/T雜合子和37名T/T純合子，其中CC純合子分布頻率為3.3%，TT純合子分布頻率為61%，與先前研究相似[7-8]，并且基因分布頻率也符合Hardy-Weinberg分布(χ2=0.22，P=0.64)。KIBRA基因多態(tài)性由于rs17070145位點(diǎn)由T突變?yōu)镃所致，基因型分組實(shí)際情況是按照KIBRA等位基因在人群中的比例來劃分的。由于國內(nèi)CC純合子攜帶者在人群中的比例較小，TT純合子攜帶者比例較大，而西方人群CC純合子攜帶者在人群中的比例約為50%，TT純合子攜帶者比例較小。因此，為避免一組樣本過少導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)模型失效，通常西方人研究中按CC純合子和T攜帶者分組進(jìn)行對(duì)比，而在中國人群中則相反將C等位基因攜帶者和TT純合子進(jìn)行對(duì)比。以往研究結(jié)果顯示無論是按照“CC純合子攜帶者和T等位基因攜帶者”還是按照“C等位基因攜帶者(包括C/C和C/T)和TT純合子攜帶者”來分組，含CC純合子攜帶者組記憶力表現(xiàn)更差，并且相應(yīng)的腦結(jié)構(gòu)和功能區(qū)表現(xiàn)相類似[3-7，11-12]。因此，考慮樣本數(shù)限制，本研究延續(xù)以往中國人群研究中的方法，對(duì)KIBRA基因按C等位基因攜帶者(包括C/C和C/T)和TT純合子攜帶者來分組的方案。

1.3 神經(jīng)心理學(xué)相關(guān)測(cè)試

本研究采用了記憶功能評(píng)估相關(guān)的神經(jīng)心理學(xué)量表。包括簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination，MMSE)、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)、數(shù)字連線試驗(yàn)-A (number connection test type A，NCT-A)和數(shù)字連線測(cè)驗(yàn)-B (number connection test type B,NCT-B)、以及韋氏記憶量表中的邏輯記憶測(cè)驗(yàn)和數(shù)字廣度(順背和倒背)。隨機(jī)抽取23名被試，在磁共振檢查前3 d內(nèi)進(jìn)行了所有的神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試。

1.4 磁共振數(shù)據(jù)采集

使用荷蘭Philips公司生產(chǎn)的Achieva 3.0 T TX雙梯度雙射頻源磁共振成像系統(tǒng)，SENSE-8-HEAD線圈(Achieva 3.0 T TX dual-source parallel RF excitation and transmission technology，Philips Medical Systems，The Netherlands)。所有受試者均先行常規(guī)MRI檢查以除外其他引起腦結(jié)構(gòu)改變的疾病。采用三維超快速場(chǎng)回波(3D-TFE) T1WI序列矢狀位掃描，掃描參數(shù)：重復(fù)時(shí)間(repetition time，TR) 7.7 ms，回波時(shí)間(echo time，TE)3.4 ms，視野(field of view，F(xiàn)OV) 256 mm×256 mm×178 mm，voxle size 1×1×1，層間距為0，反轉(zhuǎn)角90°。海綿固定受試者頭部，用橡膠耳塞塞耳，盡可能保持頭部不動(dòng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

海馬體積分析采用美國哈佛大學(xué)FreeSurfer v5.3.0 (http://surfer.nmr.mgh.harvard/ freesurfer/)軟件完成。Freesurfer將原始的dicom圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成.mgz格式后，通過計(jì)算每個(gè)體素與神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相匹配的概率，按概率配準(zhǔn)到已經(jīng)集成的人工模板，對(duì)皮質(zhì)和皮層下結(jié)果進(jìn)行全自動(dòng)分割。主要步驟包括運(yùn)動(dòng)矯正，混合區(qū)域變形或表面變形去除非腦組織，Talairach變換，分割皮層下白質(zhì)和深部灰質(zhì)結(jié)構(gòu)，最后獲得海馬亞區(qū)的腦結(jié)構(gòu)體積[13]。

FreeSurfer5.3.0軟件將海馬分為CA1、CA2_3、CA4_DG、下托(subiculum)、前下托(presubiculum)、海馬裂(fissure)、海馬傘(fimbria)以及無法分割的尾區(qū)(標(biāo)記為 hippocampus) 8個(gè)亞區(qū)(圖1)。在其完成之后，人工檢查FreeSurfer對(duì)海馬體積的分割結(jié)果，筆者將分割嚴(yán)重超出海馬區(qū)域的腦區(qū)進(jìn)行手動(dòng)分割，然后再次計(jì)算海馬體積。同時(shí)，利用FreeSurfer估算的顱內(nèi)容積(estimated total intracranial volume，eTIV)作為協(xié)變量來校正海馬體積，以去除每個(gè)人頭部大小不一所導(dǎo)致的海馬體積差異。

由于海馬傘和海馬裂為腦白質(zhì)部分，海馬尾部為不能再分割為任何亞區(qū)的結(jié)構(gòu)，因此，本研究只關(guān)注CA1、CA2_3、CA4_DG亞區(qū)、下托、以及前下托的體積。

圖1 海馬亞區(qū)示意圖，不同顏色代表不同海馬亞區(qū)Fig. 1 Schematic hippocampal subfields, different colors represent different hippocampal subfields.

表1 所有受試者一般特征資料Tab. 1 Demographic data of subjects

表2 23名受試者神經(jīng)心理學(xué)量表測(cè)試結(jié)果及一般資料Tab. 2 Demographic data and neuropsychological tests of 23 subjects

表3 C等位基因攜帶者組與TT純合子攜帶者組海馬亞區(qū)體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab. 3 Volumes of the hippocampal subfields in different groups (mm3,

表3 C等位基因攜帶者組與TT純合子攜帶者組海馬亞區(qū)體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab. 3 Volumes of the hippocampal subfields in different groups (mm3,

注：以eTIV為協(xié)變量的一般線性模型試驗(yàn)

CC+CT (23名) TT (37名) P值CA1左325.65±34.97 308.24±36.82 0.032右355.53±40.49 349.33±34.64 0.323 CA2_3左 1012.87±136.45 1009.73±108.09 0.399右 1085.86±125.87 1078.13±115.05 0.223 CA4_DG左572.96±74.98 575.53±57.72 0.624右612.67±69.46 607.98±57.52 0.260前下托左507.77±50.53 509.45±44.12 0.786右493.91±54.18 507.32±48.57 0.520下托左636.26±73.50 636.55±59.13 0.778右650.12±59.50 660.44±55.19 0.781

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，定性資料采用相對(duì)比或百分比表示；其中性別屬于定性資料，采用χ2檢驗(yàn)。將eTIV作為協(xié)變量，去除每個(gè)被試頭部大小不一所導(dǎo)致的海馬體積差異，采用線性回歸檢驗(yàn)對(duì)兩組受試者進(jìn)行組間比較。然后，再將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的海馬亞區(qū)體積與神經(jīng)心理學(xué)量表進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。

表4 Pearson相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果Tab. 4 Relationship between neuropsychological tests and left CA1 hippocampal subfields volume

圖2 在23名受試者中，左側(cè)海馬CA1區(qū)體積與NCT-B完成時(shí)間呈正相關(guān)Fig. 2 Of the 23 subjects, volume of the left hippocampal CA1 region was positively correlated with NCT-B completion time.

2 結(jié)果

2.1 受試者一般特征資料

C等位基因攜帶者組與TT純合子攜帶者組年齡、性別及受教育程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。并且兩組間顱內(nèi)總體積eTIV也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.192)。另外，其中23名志愿者行神經(jīng)心理學(xué)量表測(cè)試，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示NCT-A和NCT-B時(shí)間兩組被試間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001、P=0.006)。

2.2 關(guān)于C等位基因攜帶者組與TT純合子攜帶者組海馬亞區(qū)體積統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由于顱內(nèi)總體積有個(gè)體差異，并且顱內(nèi)總體積與海馬體積有一定相關(guān)性，盡管C等位基因攜帶者組與TT純合子攜帶者組顱內(nèi)總體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，為了減小每個(gè)被試頭部大小不一所導(dǎo)致的海馬體積差異，本研究采用線性回歸檢驗(yàn)，將eTIV做為協(xié)變量，來探討兩組間海馬亞區(qū)體積的差異。

研究結(jié)果顯示與TT純合子攜帶者組相比，TT純合子攜帶者組左側(cè)海馬CA1區(qū)體積增大(P=0.032)，而其他各亞區(qū)體積組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

2.3 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的海馬亞區(qū)體積與神經(jīng)心理學(xué)量表Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果

Pearson相關(guān)結(jié)果顯示，在23名受試者中，左側(cè)海馬CA1區(qū)體積與NCT-B完成時(shí)間呈顯著正相關(guān)(r=0.459，P=0.028)，結(jié)果表4和圖2。而左側(cè)海馬CA1區(qū)體積與其他神經(jīng)心理學(xué)量表無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在健康年輕受試者中，C等位基因攜帶者組與TT純合子攜帶者組相比左側(cè)CA1區(qū)海馬亞區(qū)體積增大，并且C等位基因攜帶者組神經(jīng)心理學(xué)量表NCT-A和NCT-B完成時(shí)間明顯大于TT純合子攜帶者組。另外左側(cè)CA1區(qū)海馬亞區(qū)體積與神經(jīng)心理學(xué)量表NCT-B完成時(shí)間呈正相關(guān)。

海馬位于大腦半球的內(nèi)側(cè)面，是組成大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，與記憶以及空間定位相關(guān)，并且參與注意的調(diào)節(jié)[14]。組織病理學(xué)研究和動(dòng)物模型表明，海馬不是一個(gè)整體的結(jié)構(gòu)，而是由幾個(gè)具有不同組織學(xué)特征的亞區(qū)組成，如下托，cornu ammonis (CA1-3)和齒狀回(dentate gyrus，DG)[15]。本研究結(jié)果顯示，與TT純合子攜帶者組相比，C等位基因攜帶者組只有左側(cè)海馬CA1區(qū)體積明顯增大，而右側(cè)海馬及左側(cè)海馬其他亞區(qū)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明在健康年輕受試者中，左側(cè)CA1區(qū)海馬亞區(qū)體積受到KIBRA基因多態(tài)性的影響，而其他海馬亞區(qū)并未受到影響。本研究結(jié)果與先前磁共振研究結(jié)果[5-6]并不吻合，主要原因可能有以下幾個(gè)方面：第一，研究對(duì)象種族差異，本研究對(duì)象是中國人，而先前研究為西方人群。第二，研究對(duì)象年齡差異，本研究對(duì)象是年輕人，而先前研究為老年人[6]。先前研究表明T等位基因攜帶者較C/C純合子攜帶者海馬亞區(qū)體積增大，而本研究結(jié)果是C等位基因攜帶者組較TT純合子攜帶者組海馬亞區(qū)體積增大，有研究表明漢族人群中KIBRA等位基因頻率在不同年齡段有差異[16]，筆者猜測(cè)KIBRA等位基因不同年齡段對(duì)海馬的影響機(jī)制不同，然而這一結(jié)果需要不同年齡段的人群研究來驗(yàn)證。第三，由于本研究樣本量的限制，可能抽樣誤差增大所導(dǎo)致，今后還需要大樣本量及多個(gè)年齡段人群的研究來完善。

大量研究表明KIBRA基因與情景記憶之間存在相關(guān)性[1，3，5-6，11]。一項(xiàng)基于8000人的Meta分析表明KIBRA T等位基因?qū)η榫坝洃浘哂斜Ｗo(hù)性作用[12]，TT純合子攜帶者組情景記憶得分高于C等位基因攜帶者組。本研究結(jié)果顯示，NCT-A和NCT-B完成時(shí)間明顯大于TT純合子攜帶者組，而完成時(shí)間越長(zhǎng)，表明認(rèn)知功能越差，這與先前研究結(jié)果相吻合[7]。并且，左側(cè)海馬CA1區(qū)體積與NCT-B完成時(shí)間呈正相關(guān)。連線測(cè)試主要檢測(cè)空間知覺、注意廣度和視覺運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能。海馬CA1區(qū)的功能主要與空間記憶和中間記憶過程相關(guān)。海馬CA1區(qū)體積與NCT-B完成時(shí)間呈正相關(guān)，即C等位基因攜帶者組海馬CA1區(qū)體積越大，NCT-B完成時(shí)間越長(zhǎng)，說明空間記憶和執(zhí)行功能越差，表明KIBRA C等位基因攜帶者左側(cè)CA1區(qū)海馬亞區(qū)體積的增加可能是對(duì)空間記憶和執(zhí)行功能減低的一種代償作用。

本研究條件下，在健康年輕受試者中，左側(cè)CA1區(qū)海馬亞區(qū)體積受到KIBRA基因多態(tài)性的影響，KIBRAC等位基因攜帶者左側(cè)CA1區(qū)海馬亞區(qū)體積的增加可能是對(duì)空間記憶和執(zhí)行功能減低的一種代償作用，該研究結(jié)果有助于KIBRA基因多態(tài)性與健康年輕人空間記憶和執(zhí)行功能關(guān)系神經(jīng)機(jī)制的研究。