雞GM-CSF和IL-2增強(qiáng)表達(dá)新城疫病毒F蛋白的重組桿狀病毒疫苗的免疫效果

于航，高冬妮，申燕，劉穎，平文祥，葛菁萍

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雞GM-CSF和IL-2增強(qiáng)表達(dá)新城疫病毒F蛋白的重組桿狀病毒疫苗的免疫效果

于航，高冬妮，申燕，劉穎，平文祥，葛菁萍

黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080

于航, 高冬妮, 申燕, 等. 雞GM-CSF和IL-2增強(qiáng)表達(dá)新城疫病毒F蛋白的重組桿狀病毒疫苗的免疫效果. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(9): 1442–1452.Yu H, Gao DN, Shen Y, et al. Efficacy enhancement of a Baculovirus-vectored Newcastle Disease Virus F protein vaccine by chicken GM-CSF and IL-2. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1442–1452.

為比較雞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF) 及雞白細(xì)胞介素2 (Interleukin 2，IL-2) 對(duì)桿狀病毒疫苗的免疫增強(qiáng)效果，通過(guò)基因工程手段構(gòu)建重組桿狀病毒疫苗 (Recombinant Baculovirus，BV) rBV-LMI-F，并聯(lián)合GM-CSF及IL-2進(jìn)行雞體免疫。對(duì)中和抗體水平及細(xì)胞因子含量比較GM-CSF和IL-2的免疫增強(qiáng)效果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，在第一次免疫28 d或42 d后，GM-CSF聯(lián)合免疫組可誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生更高的抗體和細(xì)胞因子水平 (0.01)。表明雞GM-CSF能更有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體和細(xì)胞因子反應(yīng)，提高重組桿狀病毒疫苗的免疫效果。

新城疫，GM-CSF，IL-2，聯(lián)合免疫，免疫效果

新城疫 (Newcastle disease, ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV) 引起的高度接觸性傳染病，由于該病的暴發(fā)及抗原變異等情況相繼出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)疫苗免疫效果日趨下降而瀕臨于歷史舞臺(tái)“邊緣”[1]。針對(duì)這種情況，開發(fā)基因工程亞單位疫苗成為解決該疫病的方法之一。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種操作簡(jiǎn)便、收益高、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定的高效的真核表達(dá)載體系統(tǒng)，可用于制備新型疫苗以對(duì)抗禽類傳染病的暴發(fā)[2-3]。并且各類疫苗在添加免疫佐劑后其免疫效果得到提高[4-5]。研究表明，F(xiàn)蛋白是NDV感染所必需的蛋白，其在病毒顆粒與宿主細(xì)胞融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。本課題組前期采用DNAMAN、DNAStar和ABCpred等預(yù)測(cè)軟件對(duì)NDV-F蛋白抗原表位指數(shù)、親水性、疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了綜合預(yù)測(cè)，我們根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果選取第1?196位氨基酸與第331?554位氨基酸片段作為抗原片段來(lái)研究基因的抗原性并分別構(gòu)建重組桿狀病毒疫苗。雞體免疫結(jié)果顯示，含有全基因的桿狀病毒疫苗可獲得最佳的免疫保護(hù)效果[7]，因此本研究以全基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建重組桿狀病毒疫苗，以保護(hù)雞體免受病毒攻擊。

但基因工程亞單位疫苗通常因分子量小等因素而不能完全發(fā)揮其免疫效果，因此需要通過(guò)添加一定的免疫佐劑提高其免疫效果[8]。在眾多類型免疫佐劑中，GM-CSF和IL-2對(duì)各類免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫刺激作用。且具有較為廣泛的應(yīng)用前景而逐漸進(jìn)入研究者們的視線。其中，GM-CSF是一種重要的造血生長(zhǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子[9]，不僅能夠促進(jìn)粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞形成集落，還可誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞到達(dá)抗原入侵部位對(duì)抗原進(jìn)行呈遞，同時(shí)也在樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[10]。IL-2作為細(xì)胞因子可增強(qiáng)單核細(xì)胞及NK細(xì)胞的殺傷活性[11]，同時(shí)促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，從而發(fā)揮抗病毒作用[12]。并且研究者們已經(jīng)證實(shí)重組IL-2具有較強(qiáng)的免疫刺激作用和免疫協(xié)同作用[13]。

此外，人們?yōu)樵鰪?qiáng)桿狀病毒疫苗的保護(hù)效率，篩選高效的免疫佐劑亦為重中之重。因此，人們將研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向?qū)γ庖咦魟┑难芯?。本文自主?gòu)建重組桿狀病毒疫苗 (rBV-LMI-F)，并聯(lián)合免疫刺激劑CSF及IL-2進(jìn)行雞體免疫。通過(guò)對(duì)比各組雞只的抗體水平及細(xì)胞因子含量，從GM-CSF和IL-2中篩選出最佳免疫刺激劑，為NDV疫苗免疫刺激劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

SPF雞：80只1日齡白來(lái)航雞均由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，飼養(yǎng)于隔離器中用于雞體免疫試驗(yàn)；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)速發(fā)型NDV強(qiáng)毒株F48E9購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，用于攻毒試驗(yàn)；Sf9昆蟲細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存，用于重組桿狀病毒滴度測(cè)定。

1.2 供試質(zhì)粒

本研究所用的桿狀病毒骨架質(zhì)粒pLMI及攜帶目的基因的原始質(zhì)粒pT-F和pT-IL-2由本實(shí)驗(yàn)室前期自主構(gòu)建，pUC-GM-CSF購(gòu)自哈爾濱金凱瑞公司，上述質(zhì)粒用于構(gòu)建重組桿狀病毒rBV-LMI-F、rBV-LMI-GM-CSF與rBV-LMI-IL-2。

1.3 試劑盒

CellTiter 96?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay購(gòu)自Promega公司；雞新城疫病毒IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒、IFN-gELISA檢測(cè)試劑盒、IL-2 ELISA檢測(cè)試劑盒和雞IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam公司。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)及基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，引物見表1。

表1 本研究所用的引物序列

Enzyme restriction sites are underlined.

1.4.2 桿狀病毒載體的構(gòu)建

將載體pLMI與pT-F/pUC-GM-CSF/pT-IL-2分別進(jìn)行Ⅰ/Ⅰ、Ⅰ/RⅠ和RⅠ/Ⅰ雙酶切，并與pLMI載體相連接，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLMI-F、pLMI-GM-CSF與pLMI-IL-2。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒DNA，并對(duì)其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證正確后將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性重組子提取Bacmid DNA，并命名為rBac-LMI-F、rBac-LMI- GM-CSF與rBac-LMI-IL-2。最后分別以rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF與rBac-LMI-IL-2為模板，以F-up/F-down、GM-CSF-up/GM-CSF-down、IL-2-up/IL-2-down和M13-47為上下游引物進(jìn)行PCR，鑒定桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體是否構(gòu)建成功。

1.4.3 重組桿狀病毒的制備

本研究通過(guò)脂質(zhì)體培養(yǎng)法制備重組桿狀病毒，首先將上述3種桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF與rBac-LMI-IL-2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，當(dāng)80%細(xì)胞病變時(shí)收集共轉(zhuǎn)染上清液，如此重復(fù)3次，以獲得高效價(jià)P3代重組桿狀病毒，并分別命名為rBV-LMI-F、rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2。最后以構(gòu)建完成的桿狀病毒為模板，以F-up/F-down、GM-CSF-up/GM-CSF-down、IL-2-up/IL-2-down為上下游引物進(jìn)行PCR，驗(yàn)證目的基因是否整合至重組桿狀病毒中。

1.4.4 重組桿狀病毒的滴度測(cè)定

本研究通過(guò)測(cè)定重組桿狀病毒滴度確定免疫劑量，將Sf9昆蟲細(xì)胞接種至6孔板中，并向其分別加入經(jīng)10倍連續(xù)稀釋的rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2病毒液，1 h后棄去病毒液，加入含0.9%低熔點(diǎn)瓊脂的Sf900 Ⅱ SFM培養(yǎng)液，27 ℃孵育8 d，最后使用中性紅染色，通過(guò)試驗(yàn)所得蝕斑數(shù)量測(cè)定重組桿狀病毒rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2滴度，并以此滴度進(jìn)行雞體免疫。

1.4.5 免疫及攻毒程序

將14日齡SPF雞隨機(jī)分為4組，每組20只，免疫分組、劑量、接種途徑見表2。當(dāng)免疫雞只日齡為14日齡時(shí)，對(duì)各免疫組雞只進(jìn)行第一次免疫；隔7 d進(jìn)行第二次免疫 (0.2 mL/只)；42日齡時(shí)采用NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9以皮下注射方式對(duì)各免疫組雞只攻毒，攻毒劑量為200 μL/只。攻毒后觀察雞采食量、飲水量、糞便和精神狀況等生理變化。

表2 雞體免疫分組

1.4.6 組織收集及病理組織切片分析

攻毒后7 d，各免疫組隨機(jī)選取一只SPF雞進(jìn)行麻醉并斷頭處死，提取免疫雞只心臟及十二指腸組織，混于多聚甲醛溶液過(guò)夜，然后使用EDTA脫鈣液體脫鈣1周。包埋后通過(guò)切片機(jī)將組織切成8 μm厚的截面，用于病理組織切片分析。

1.4.7 免疫雞血清中和試驗(yàn)

分離免疫雞血清，梯度稀釋NDV強(qiáng)毒株及血清，然后使病毒與血清中和反應(yīng)1 h，接種至雞胚成纖維細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)96 h，每12 h記錄細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench法計(jì)算出每個(gè)血清樣品的中和保護(hù)價(jià) (Protective dose，PD50)，用SSPS軟件計(jì)算每組血清PD50的幾何平均數(shù)，即為該日齡血清的中和抗體效價(jià) (Geometric mean titer，GMT)。

1.4.8 免疫雞血清IgG抗體水平的檢測(cè)

在免疫0、14、28、42、56 d后每組隨機(jī)選取6只采取翅靜脈血，每只0.5?1.0 mL，4 000 r/min離心15 min分離血清，應(yīng)用新城疫IgG抗體ELISA試劑盒檢測(cè)免疫后各組血清樣本中IgG抗體滴度，具體方法按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.9 免疫雞血清細(xì)胞因子的檢測(cè)

所有免疫雞在免疫后0、14、28、42、56 d后隨機(jī)翅靜脈采血6只，每只0.5?1.0 mL，離心分離血清，應(yīng)用IFN-γ、IL-2和IL-4 ELISA試劑盒檢測(cè)各免疫組雞只血清樣本中IFN-γ、IL-2和IL-4濃度，具體方法按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 重組轉(zhuǎn)移載體pLMI-F、pLMI-GM-CSF和pLMI-IL-2的構(gòu)建與鑒定

將載體pLMI、pT-F、pUC-GM-CSF和pT-IL-2分別進(jìn)行酶切后，將載體片段與目的片段連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明重組轉(zhuǎn)移載體pLMI-F、pLMI-GM-CSF和pLMI-IL-2構(gòu)建成功。

2.2 重組穿梭轉(zhuǎn)移載體rBac-LMI-F、rBac- LMI-GM-CSF和rBac-LMI-IL-2的鑒定

將構(gòu)建成功的重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞，提取Bacmid DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，凝膠電泳結(jié)果顯示在預(yù)期處均有明顯條帶 (4 000、2 800、2 800 bp)，表明重組穿梭轉(zhuǎn)移載體rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF和rBac-LMI-IL-2構(gòu)建成功。

2.3 重組桿狀病毒rBV-LMI-F、rBV-LMI- GM-CSF和rBV-LMI-IL-2的PCR鑒定

將構(gòu)建完成的重組穿梭載體rBac-LMI-F、rBac-LMI-GM-CSF和rBac-LMI-IL-2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，收集上清液制備P1代重組桿狀病毒，并進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示在預(yù)期處均有明顯條帶 (1 662、435、430 bp)，表明目的基因已成功整合到重組桿狀病毒基因組中，重組桿狀病毒rBV-LMI-F、rBV-LMI-GM-CSF和rBV-LMI-IL-2構(gòu)建成功。

2.4 重組桿狀病毒滴度測(cè)定

利用空斑分析法測(cè)定P3代重組桿狀病毒滴度，觀察至空斑數(shù)不變后計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)前用中性紅溶液染色2 h，觀察空斑形態(tài)并計(jì)數(shù)，得到rBV-X P3代的重組病毒滴度 (表3和圖1)。

2.5 免疫雞只攻毒保護(hù)率

各免疫組雞只在初次免疫和加強(qiáng)免疫后均表現(xiàn)正常。在攻毒2 d后開始出現(xiàn)死亡，空白對(duì)照組雞只發(fā)病率為71.4%，同時(shí)本課題組在剖檢雞只后發(fā)現(xiàn)各免疫組雞只的心臟及十二指腸均有不同程度的出血和充血現(xiàn)象，說(shuō)明NDV對(duì)免疫雞只具有較強(qiáng)的毒性，并可致其死亡。而rBV-LMI-F單獨(dú)免疫組和rBV-LMI- F+rBV-LMI-IL-2聯(lián)合免疫組在攻毒4 d后才陸續(xù)有少量雞只死亡，而rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM- CSF聯(lián)合免疫組的免疫雞只則全部存活。同時(shí)在攻毒后第8天剖檢GM-CSF和IL-2聯(lián)合免疫組雞只，未發(fā)現(xiàn)其心臟與十二指腸出現(xiàn)大規(guī)模出血與充血現(xiàn)象。并且在GM-CSF和IL-2的免疫協(xié)同作用下，rBV-LMI-F+ rBV-LMI-GM-CSF/IL-2聯(lián)合免疫組攻毒保護(hù)率分別達(dá)到100%和85.7%，與rBV-LMI-F單獨(dú)免疫組 (80%) 相比，差異顯著(0.05)，同時(shí)rBV-LMI- F+rBV-LMI-GM-CSF聯(lián)合免疫組攻毒保護(hù)率較rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2聯(lián)合免疫組提高了14.3%，且差異顯著 (0.05)。表明GM-CSF與IL-2雖均具有較強(qiáng)的免疫協(xié)同作用，但相比于IL-2來(lái)說(shuō)，GM-CSF具有更強(qiáng)的免疫刺激效果 (圖1)。同時(shí)排毒情況顯示，PBS對(duì)照組病毒分離為陽(yáng)性，而rBV-LMI-F單獨(dú)免疫組和rBV-LMI- F+rBV-LMI-GM-CSF/IL-2聯(lián)合免疫組病毒分離均為陰性，且盲傳1代后亦為陰性。

表3 P3代重組桿狀病毒rBV-X滴度測(cè)定

圖1 免疫雞只攻毒保護(hù)結(jié)果

2.6 病理學(xué)分析

2.6.1 免疫雞只病理組織定性分析

根據(jù)病理組織切片結(jié)果顯示，GM-CSF聯(lián)合免疫組雞只的十二指腸則無(wú)明顯病理變化；且IL-2聯(lián)合免疫組雞只的十二指腸的腸黏膜部分有少量脫落，而PBS及rBV-LMI-F對(duì)照組免疫雞只的十二指腸的腸粘膜表面上皮脫落且多處呈棗核狀紫紅色出血點(diǎn)，大部分組織結(jié)構(gòu)被破壞。另外在心肌纖維方面，GM-CSF聯(lián)合免疫組雞只的心肌纖維完好無(wú)損，無(wú)明顯病理變化；同時(shí)IL-2聯(lián)合免疫組雞只的心肌纖維局部有輕微的小灶狀出血，而PBS及rBV-LMI-F對(duì)照組免疫雞只的心肌纖維明顯斷裂，存在大量出血點(diǎn)及出血斑 (圖2、圖3)。表明相對(duì)于IL-2來(lái)說(shuō)，GM-CSF具有較強(qiáng)的免疫協(xié)同作用，可有效增強(qiáng)重組桿狀病毒對(duì)雞體的保護(hù)能力。

圖2 各免疫組雞只的十二指腸病變情況 (200×)

圖3 各免疫組雞只的心肌病變情況(200×)

2.6.2 免疫雞只病理組織定量分析

為深入分析GM-CSF與IL-2在協(xié)助重組桿狀病毒疫苗對(duì)雞體器官組織保護(hù)方面的能力強(qiáng)弱，本研究通過(guò)Image J軟件測(cè)定免疫雞組織內(nèi)腸上皮脫落與心肌纖維斷裂部分面積的大小，對(duì)病理組織切片進(jìn)行定量分析，以評(píng)價(jià)GM-CSF與IL-2的免疫協(xié)同作用。

結(jié)果表明，PBS空白對(duì)照組、rBV-LMI-F、GM-CSF共免疫組及IL-2共免疫組免疫雞只十二指腸內(nèi)場(chǎng)上皮脫落面積分別為25 830、11 541、2 079、5 086 μm2，其中GM-CSF共免疫組十二指腸內(nèi)腸上皮脫落面積最小，且與其余各免疫組相比均差異顯著 (0.05)。同時(shí)，PBS空白對(duì)照組、rBV-LMI-F、GM-CSF共免疫組及IL-2共免疫組免疫雞只心肌纖維斷裂部分面積分別為13 227、9 248、1 058、2 865 μm2，其中GM-CSF共免疫組十二指腸內(nèi)腸上皮脫落面積最小，且與其余各免疫組相比均差異顯著 (0.05)，表明相對(duì)于IL-2，GM-CSF可協(xié)助重組桿狀病毒疫苗對(duì)雞體組織提供更好的保護(hù)。

2.7 免疫雞血清中和抗體效價(jià)測(cè)定

各免疫組雞只免疫血清中中和抗體效價(jià)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且在第一次免疫后28 d達(dá)到最高 (圖4)，rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF及rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2聯(lián)合免疫組免疫雞血清中中和抗體效價(jià)分別為1 575.84及1 457.83，與rBV-LMI-F單獨(dú)免疫組 (1 329.78) 相比，差異極顯著 (0.01)，表明GM-CSF與IL-2均能對(duì)重組桿狀病毒疫苗起到免疫增強(qiáng)的協(xié)同作用。同時(shí)，rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF聯(lián)合免疫組免疫雞血清中中和抗體效價(jià)較rBV-LMI-F+rBV- LMI-IL-2聯(lián)合免疫組高8.1%，且差異極顯著(0.01)，表明與IL-2相比，GM-CSF能夠?qū)χ亟M桿狀病毒疫苗起到更強(qiáng)的免疫增強(qiáng)的協(xié)同作用。

圖4 各免疫組雞血清中中和抗體效價(jià)

2.8 免疫雞血清中特異性IgG抗體水平

自首免后，各免疫組雞血清中IgG水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且于第一次免疫后42 d達(dá)到最高，其中rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF聯(lián)合免疫組雞血清中IgG抗體水平較BV-LMI-F單獨(dú)免疫組提高了25.7%，差異顯著 (0.05)，而rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2聯(lián)合免疫組較rBV- LMI-F單獨(dú)免疫組僅提高了13.8%。同時(shí)GM-CSF聯(lián)合免疫組雞血清中IgG抗體水平較IL-2聯(lián)合免疫組提高了10.49%，且差異顯著 (0.05)，表明相對(duì)于IL-2而言，GM-CSF能夠刺激雞體產(chǎn)生較高水平體液免疫應(yīng)答，此結(jié)果與攻毒保護(hù)率相符 (圖5)。

2.9 免疫雞血清中IFN-γ含量

首免后，各免疫組雞只血清中IFN-γ含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，至第一次免疫后42 d，各組IFN-γ含量達(dá)到最大 (圖6)。其中rBV-LMI-F+ rBV-LMI-GM-CSF/IL-2聯(lián)合免疫組雞只血清中IFN-γ含量 (78.10、73.01 ng/mL) 與rBV-LMI-F單獨(dú)免疫組 (59.53 ng/mL) 相比差異極顯著 (0.01)。而rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF聯(lián)合免疫組雞只血清中IFN-γ含量較rBV-LMI-F+ rBV-LMI-IL-2聯(lián)合免疫組提高了7.0%，且差異極顯著 (0.01)，表明GM-CSF與IL-2均能刺激雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖5 各免疫組雞血清中特異性IgG抗體水平

圖6 各免疫組雞血清中IFN-γ含量

2.10 免疫雞血清中IL-2及IL-4含量

各免疫組雞只血清中IL-2及IL-4含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，至第一次免疫后56 d時(shí)達(dá)到最高，且rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF/IL-2聯(lián)合免疫組與rBV-LMI-F單獨(dú)免疫組相比，差異極顯著 (0.01)。其中，rBV-LMI-F+rBV-LMI- GM-CSF聯(lián)合免疫組血清中IL-2及IL-4含量較rBV-LMI-F+rBV-LMI-IL-2聯(lián)合免疫組分別提高了10.74%和21.4%，且均差異極顯著 (0.01)。結(jié)果表明，相對(duì)于IL-2來(lái)說(shuō)，GM-CSF能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生更強(qiáng)的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，對(duì)雞體提供更好的保護(hù) (圖7、圖8)。

圖7 各免疫組雞血清中IL-2含量

圖8 各免疫組雞血清中IL-4含量

3 討論

目前人們對(duì)于NDV的防控主要以傳統(tǒng)疫苗為主，雖然也開始利用基因工程亞單位疫苗進(jìn)行嘗試，但是也或多或少出現(xiàn)了一些弊病，例如重組桿狀病毒疫苗的免疫效果會(huì)受外源基因表達(dá)時(shí)間的限制[14-15]，并且變異株的出現(xiàn)使疫苗免疫效果下降[16-18]，而單一使用疫苗也很難將病毒根除[19-20]。因此，聯(lián)合免疫刺激劑來(lái)增強(qiáng)重組桿狀病毒疫苗的免疫效果成為有益的選擇[21-22]。

目前，在眾多免疫刺激劑中，GM-CSF和IL-2對(duì)各類免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫刺激作用。王興龍等[23]在探究GM-CSF作用效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，其可刺激雞骨髓細(xì)胞快速形成集落。姜永厚等[24]在構(gòu)建重組質(zhì)粒并聯(lián)合F基因疫苗進(jìn)行雞體免疫研究IL-2的免疫效果作用時(shí)亦得到相似結(jié)論。

雖然雞GM-CSF和IL-2具有作為免疫刺激劑的應(yīng)用前景，但對(duì)于兩者免疫增強(qiáng)效果的比較方面的研究還鮮有報(bào)道，且兩者對(duì)于NDV的響應(yīng)水平及對(duì)桿狀病毒疫苗的免疫協(xié)同效果還不為人所知[25]。因此本研究以此為切入點(diǎn)，以GM-CSF和IL-2為免疫刺激劑進(jìn)行雞體免疫，對(duì)比分析兩者的免疫增強(qiáng)效果。

免疫雞只攻毒保護(hù)率結(jié)果表明，rBV-LMI-F+ rBV-LMI-GM-CSF聯(lián)合免疫組攻毒保護(hù)率和中和抗體含量較IL-2聯(lián)合免疫組提高了14.3%，差異顯著 (0.05)，且Sedegah等[26]在探究GM-CSF與pPyCSP免疫協(xié)同作用時(shí)得出相似結(jié)果，即兩者混合免疫后機(jī)體內(nèi)pPyCSP特異性抗體水平提高了8倍，表明GM-CSF可提高多類基因工程疫苗的免疫效果，且不僅局限于禽類疫苗中，其可突破種屬限制并發(fā)揮較強(qiáng)的免疫刺激作用，同時(shí)本研究也為GM-CSF在其余病例中的應(yīng)用提供新思路。

此外，rBV-LMI-F+rBV-LMI-GM-CSF聯(lián)合免疫組雞只器官并無(wú)明顯病變，而rBV-LMI-F+rBV- LMI-IL-2聯(lián)合免疫組雞只器官有明顯出血點(diǎn)和血斑出現(xiàn)，表明GM-CSF可增強(qiáng)桿狀病毒疫苗對(duì)雞體的保護(hù)效果，GM-CSF可能通過(guò)激活某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以修復(fù)受損組織避免雞體死亡，從側(cè)面提高疫苗的免疫保護(hù)效率。另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)GM-CSF聯(lián)合免疫組雞只免疫血清中中和抗體及特異性IgG抗體水平較IL-2聯(lián)合免疫組分別提高了5.5%和11.8%，且均差異顯著 (0.05)，表明GM-CSF能夠刺激雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，進(jìn)而協(xié)助重組桿狀病毒疫苗提高對(duì)雞體的保護(hù)效率。同時(shí)，GM-CSF聯(lián)合免疫雞血清中IFN-γ、IL-2及IL-4含量均高于IL-2聯(lián)合免疫組，且均差異顯著 (0.05)。Du等[27]在探究GM-CSF的免疫協(xié)同作用時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，GM-CSF可協(xié)助重組疫苗提高機(jī)體內(nèi)IL-2、IL-4和IFN-γ等細(xì)胞因子的含量，另外譚兵等[28]亦得到相似結(jié)果，表明GM-CSF不僅對(duì)免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)刺激作用，對(duì)機(jī)體的體液及細(xì)胞免疫亦具有較強(qiáng)的刺激作用，至于其是否可激活某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究在嘗試構(gòu)建桿狀病毒載體疫苗并進(jìn)行雞體免疫后，明確了GM-CSF作為免疫刺激劑的免疫協(xié)同效果，發(fā)現(xiàn)GM-CSF可不受種屬限制，GM-CSF亦可協(xié)助疫苗突破機(jī)體組織屏障，保護(hù)機(jī)體組織不受病毒侵害以發(fā)揮其較強(qiáng)的免疫協(xié)同作用。本研究不僅為NVD的制備奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為GM-CSF的應(yīng)用領(lǐng)域及免疫增強(qiáng)機(jī)制方面的探究提供新的研究思路。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Efficacy enhancement of a Baculovirus-vectored Newcastle Disease Virus F protein vaccine by chicken GM-CSF and IL-2

Hang Yu, Dongni Gao, Yan Shen, Ying Liu, Wenxiang Ping, and Jingping Ge

Key Laboratory of Microbiology,College of Life Sciences,Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China

To compare with the effects of the GM-CSF and IL-2 used as adjuvants in the baculovirus vaccine, we used genetic engineering to construct the recombinant baculovirus rBV-LMI-F and with GM-CSF and IL-2 to immunized chickens. Then, we compared the concentration of the neutralizing antibody and cytokines to determine the immunostimulatory effects of GM-CSF and IL-2. GM-CSF induced higher levels of antibodies and cytokines in chickens at 28 d and 42 d post-vaccination. In conclusion, GM-CSF could elicit higher serum antibody and cytokines responses and improved the effects of Baculovirus vaccine.

Newcastle disease,GM-CSF, IL-2, co-immunization, immune effect

December 21, 2017;

May 28, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31270143), Colleges and Universities Science and Technology Innovation Team of Heilongjiang Province “Technology of Agricultural Microbial Fermentation” (No. 2012td009).

Jingping Ge. Tel: +86-451-86609016; E-mail: gejingping@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31270143)，黑龍江省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)“農(nóng)業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)” (No. 2012td009) 資助。

2018-06-21

10.13345/j.cjb.170505

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180620.1617.002.html