Toll樣受體9基因多態(tài)性與湖北漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的關(guān)系

邢亞瓊 吳雪菁子 宋繼權(quán)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，常累及人體多個器官及系統(tǒng)，預(yù)后較差[1]。SLE病因復(fù)雜，經(jīng)大量研究顯示與遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌、感染等各種內(nèi)外因素均相關(guān)[2]，但一般認(rèn)為其他因素均是在遺傳因素異常的基礎(chǔ)上發(fā)生，遺傳因素在疾病的易感性和臨床表現(xiàn)上起著不可替代的作用。因此，在研究SLE易感性時，對人體全基因組易感基因位點的分析不容忽視。SLE的致病機制與以B淋巴細(xì)胞的活化、增值、功能亢進(jìn)為中心的體液免疫及細(xì)胞免疫紊亂息息相關(guān)[3]。Toll樣受體(TLRs)是一種識別先天免疫模式的蛋白質(zhì)家族。它們廣泛地表達(dá)在人體的各種組織和細(xì)胞中，并且能夠識別并結(jié)合保守的病原體相關(guān)分子，繼而觸發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，從而激活獲得性免疫。TLRs被認(rèn)為是先天免疫和后天免疫之間的橋梁[4]。日本學(xué)者Hemmi等[5]在2000年通過BLAST搜索、實驗等首次發(fā)現(xiàn)TLR9。隨后相繼有研究證實B淋巴細(xì)胞僅表達(dá)TLR9和TLR10。其中，TLR9通過與DNA中胞嘧啶磷酸鳥苷基因序列(CPG DNA)特異性結(jié)合進(jìn)而激活免疫細(xì)胞B淋巴細(xì)胞并使其快速增殖，產(chǎn)生大量抗雙鏈DNA抗體；同時調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[6,7]。綜上可見TLR9在SLE發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。然而，查閱近年來的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對TLR9基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的研究報道數(shù)量并不多，且統(tǒng)計結(jié)果缺乏一致性[8-11]。因此，本文通過對人外周血DNA測序分析在湖北漢族人口中Toll樣受體9基因多態(tài)性(rs187084、rs352140)與SLE的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 80例SLE患者資料收集于2015年6月至2017年12月武漢大學(xué)中南醫(yī)院及湖北省人民醫(yī)院門診及住院部患者，均為湖北漢族女性，平均年齡為36歲。納入標(biāo)準(zhǔn)符合1997年美國風(fēng)濕協(xié)會修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對照組84人，收集于我院體檢中心，各項檢查指標(biāo)均正常的人群，平均年齡為32歲，且排除了SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等自身免疫性疾病及相關(guān)家族史。所有研究對象間均無血緣關(guān)系。本研究已通過武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并在實施過程中遵守赫爾辛基宣言，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 5424臺式離心機(Eppendorf公司)，S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)，Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);2xTsingKe Master Mix(武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司DP318)。

1.3 實驗方法 收集受試者清晨空腹靜脈血5 mL于EDTA紫色抗凝管中于4℃保存。采用苯酚-蛋白酶K法提取外周血基因組DNA，采用紫外分光光度計測定DNA含量及濃度，A260/A280>1.8，并于-20℃保存。選取并合成位于rs187084、rs352140位點的目的基因合成引物，合成引物(見表1)由武漢擎科創(chuàng)新生物科技合成。擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35次循環(huán)，72℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含溴乙啶)電泳，驗證擴增結(jié)果后由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司通過SNaPshot法測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用直接計數(shù)法分別對實驗組和對照組進(jìn)行等位基因和基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計，用SPSS 21.0軟件進(jìn)行χ2檢驗。SLE實驗組及正常對照組間的等位基因頻率及基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對SLE實驗組及對照組各基因型的頻數(shù)及理論頻數(shù)進(jìn)行H-W平衡檢驗，2個位點在兩組的分布均符合H-W平衡定律(P>0.05)，表明此次選取的樣品符合遺傳平衡定律，具有很好的代表性，可以代表總體人群。

2.2 基因型頻率及等位基因頻率 rs187084 AA,GG,AG基因型頻率在實驗組及對照組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。A,G等位基因頻率在實驗組及對照組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。rs352140 AA,GG,AG基因型頻率在實驗組及對照組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。A,G等位基因頻率在實驗組及對照組無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖1。

表1 PCR擴增引物序列

表2 rs187084、rs352140位點基因型及等位基因在實驗組與對照組間的分布 例(%)

a b c d e f

注：a、b、c為rs352140位點測序結(jié)果，基因型分別為AG、AA、GG；d、e、f為rs187084位點測序結(jié)果，基因型分別為AG、AA、GG

圖1 基因測序圖

3 討論

SLE的發(fā)病機制及病因并不十分明確。然而統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)SLE有家族聚集性，且同卵雙生子與異卵雙生子的發(fā)病率不同。眾多研究者經(jīng)全基因組關(guān)聯(lián)分析(Gemone wide associated studies，GWAS)發(fā)現(xiàn)超過60個與SLE相關(guān)的易感基因位點，其中一些基因位點對早期B細(xì)胞的發(fā)育及B細(xì)胞表面受體的信號傳導(dǎo)有重要影響[12,13]，表明遺傳因素在SLE的發(fā)生及發(fā)展中起到了一定的作用。另有研究者將SLE患者功能障礙的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)在體外培養(yǎng)仍顯示免疫調(diào)節(jié)功能受損，然而基因敲除候選易感基因后，MSC相應(yīng)的功能恢復(fù)[14,15]，由此進(jìn)一步證實了遺傳因素與SLE的相關(guān)性。

TLR9在自身免疫性疾病發(fā)病機制中的作用得到了人們越來越多的關(guān)注。TLR9是toll樣受體家族中的重要一員，主要表達(dá)于漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)、記憶性B細(xì)胞等免疫細(xì)胞[16]。一直以來，人們認(rèn)為TLR9僅能與細(xì)菌、病毒等微生物中的DNA胞嘧啶磷酸鳥苷基因序列(CPG DNA)形成的配體結(jié)合。近來，研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)人類真核細(xì)胞線粒體DNA(mtDNA)中保留著類似細(xì)菌DNA的分子序列，其中不被甲基化修飾的CPG序列可以作為TLR9的配體，經(jīng)結(jié)合后作用于免疫細(xì)胞，繼而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[17]。也有研究證實，SLE患者體內(nèi)凋亡和/或清除缺陷的血漿DNA與自身抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物結(jié)合pDCs表面的FcγRIIa,繼而與胞內(nèi)的TLR9結(jié)合，刺激pDCs釋放干擾素IFN-α，激活pDCs更高效的對自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行抗原提呈。同時免疫復(fù)合物在BCR/TL9的參與下激活B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體。這些自身抗體又參與了免疫復(fù)合物的形成，產(chǎn)生的免疫復(fù)合物又可以充當(dāng)TLR9的激動劑從而繼續(xù)下一個循環(huán)[18-21]。Chow等[22]通過小鼠動物實驗發(fā)現(xiàn)TLR9是toll樣受體9/轉(zhuǎn)化生長因子β1/血小板源性生長因子B(TLR9/TGF-β1/PDGF-B)通路的重要角色，介導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞的一種信號級聯(lián)反應(yīng)。隨后Yuan等[23]為探討TLR9/TGF-β1/PDGF-B通路在SLE患者原代細(xì)胞中的是否存在，及與健康人群是否存在差異，實驗發(fā)現(xiàn)CpG序列可誘導(dǎo)SLE患者細(xì)胞中TGF-β1mRNA和PDGF-BmRNA水平明顯高于健康人群組。有研究說明TLR9在TLR9/TGF-β1/PDGF-B炎癥通路中扮演著重要角色，并且與SLE相關(guān)。Liu等[24]將表達(dá)Epstein Barr病毒膜抗原BLLF1的21只轉(zhuǎn)基因雌性小鼠隨機分為空白對照組、B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLYS)抑制組和TLR-9抑制組，持續(xù)治療10天后，采集外周靜脈血，檢測TLR-9 mRNA的相對水平，BLYS和IL-10蛋白濃度水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLYS抑制與TLR9抑制組比較，TLR9 mRNA和BLYS蛋白濃度這兩項指標(biāo)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，由此推測TLR9及其相關(guān)的信號通路可能對BLYS誘導(dǎo)的SLE和炎癥免疫水平的調(diào)節(jié)有重要意義。Benigni等在實驗中發(fā)現(xiàn)在狼瘡性腎炎小鼠模型中TLR9與尿蛋白及腎小管損傷程度正相關(guān)，并認(rèn)為可以通過外周B細(xì)胞TLR9的表達(dá)情況作為判斷SLE患者疾病活動性及臨床預(yù)后的指標(biāo)[25-28]。以上這些研究及相關(guān)發(fā)現(xiàn)提示TLR9不僅參與免疫應(yīng)答，并且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡致病的相關(guān)炎癥通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

遺傳，對決定疾病的易感性及臨床表型起著關(guān)鍵作用，這是不可否認(rèn)的事實。近年來研究表明TLR9多個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的基因多態(tài)性參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，包括腫瘤性疾病、感染性疾病、免疫相關(guān)性疾病等[29,30]。人類TLR9基因位于3號染色體p21.3,是SLE的易感基因位點之一，在TLR9的單核苷酸多態(tài)性基因位點中，rs187084位于啟動子區(qū)，rs352140位于第2個外顯子區(qū)，故其多態(tài)性可能影響TLR9的功能，參與SLE疾病的發(fā)生、發(fā)展。Huang等[8]研究發(fā)現(xiàn)rs187084基因多態(tài)性，與臺灣系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人相關(guān)。Tao等[9]研究發(fā)現(xiàn)rs352140位點基因多態(tài)性與中國人口中系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感性相關(guān)。然而，有研究發(fā)現(xiàn)在韓國SLE患者中TLR9基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡無相關(guān)性[10]。Piotrowski等[11]在波蘭籍人群中隨機抽取254例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者及521例健康志愿者，檢測其外周血中TLR9 的rs352140位點基因多態(tài)性，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。綜上說明，目前對Toll樣受體9基因?qū)用娴难芯枯^少，且研究結(jié)果不一致。

本次研究中為探究TLR9基因位點多態(tài)性與湖北漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病易感性的關(guān)系，我們通過觀察80例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和84名健康對照，選擇2個SNP位點(rs187084、rs352140),采用SNaPshot方法對DNA樣本SNP位點進(jìn)行分析，結(jié)果顯示 rs187084、rs352140位點基因型頻率和等位基因在實驗組和對照組中均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。本實驗結(jié)果提示可能上述兩個SNP位點與SLE的發(fā)病機制不相關(guān)。

本次實驗初步探討了TLR9基因多態(tài)性與SLE疾病易感性的關(guān)系。結(jié)果提示rs187084、rs352140位點的單核苷酸多態(tài)性與湖北漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感性可能不相關(guān)。另外，本實驗在TLR9的基因位點中僅選擇了2個位點，不排除其他位點在實驗組及對照組中表達(dá)有差異的可能。同時本次實驗中選取的樣本量小，地域范圍較局限，故在基因?qū)用孢€有待于進(jìn)一步探討。