UPLC-MS-MS法檢測獸用中成藥中非法添加利巴韋林、阿昔洛韋和嗎啉胍的研究應(yīng)用

張志遙

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

近年來隨著抗生素的濫用，動物機體耐藥性不斷升高，畜禽產(chǎn)品中抗生素殘留也時刻威脅著食品安全[1-2]。因此獸用中成藥憑借著其低毒副作用與不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢，在市場中的越來越受到重視。但是，一些不法商家為提高療效并降低成本，在獸用中成藥中非法添加抗生素從而謀取暴利，嚴重擾亂市場秩序，危害動物食品安全[3-5]。本試驗中，以利巴韋林、阿昔洛韋和嗎啉胍3種典型的非法添加抗病毒藥物為研究對象，建立檢測這3種物質(zhì)的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS-MS）方法，以期為相關(guān)產(chǎn)品非法添加抗病毒類藥物的監(jiān)督檢驗提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國WATERS公司；Nanopure超純水系統(tǒng)，Thermo Scientific公司；海爾BCD-649WE雙開門冰箱，青島海爾集團；KQ 500超聲波提取儀，上海波龍電子有限公司；AG-285電子天平，METTLER TOLEDO公司；TDL 240離心機，上海安亭科學儀器廠；漩渦混勻器，鼎昊源科技有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗藥品利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍，批號均為101116-201102，中國食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸，Across Organics公司；三乙胺（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技中國有限公司；豐舒（荊防敗毒散）（100 g/袋）、黃連敗毒散（200 g/袋），均為市場隨機選購。

1.3 試驗方法

1.3.1 相關(guān)溶液的制備

1.3.1.1 標準溶液的配制準確稱量利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍3種藥物的標準品各10 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容，顛倒混勻，濃度為1 mg/mL。取無非法添加的各制劑1 g，置于100 mL容量瓶中，用水充分溶解稀釋100倍。

1.3.1.2 陰性空白溶液的配制取無非法添加的各制劑1 g或1 mL，置于100 mL容量瓶中，用水充分溶解，超聲10 min，在添加至刻度處，來回顛倒數(shù)十次至充分混勻，接著再按照上述步驟稀釋100倍，作為陰性空白溶液。

1.3.1.3 待測樣本溶液的配制稱取藥品粉末1.00 g，緩慢加入50 mL離心管中，加10 mL乙腈，漩渦混勻，80 w超聲10 min。將超聲波后的溶液經(jīng)濾紙過濾至潔凈燒杯中，用5 mL乙腈清洗濾紙上的殘渣，后將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，清洗定容待測。

1.3.2 質(zhì)譜條件的確定由于阿昔洛韋、嗎啉胍（病毒靈）、利巴韋林均具有氨基，容易得到H+而形成較為穩(wěn)定的[M+H]+準分子離子，所以首先確定正離子電離模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）。參考相關(guān)文獻[6-8]以及對實際離子掃描結(jié)果的優(yōu)化，確定阿昔洛韋、嗎啉胍（病毒靈）、利巴韋林監(jiān)測離子對。

表1 質(zhì)譜條件Table 1 Results of mass spectrometry conditions

其他質(zhì)譜條件如下：毛細管電壓：1.0 KV；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：50 L/h。

1.3.3 液相條件的建立以50 mm×2.1 μm×1.7 μm的BEHC 18柱為分離柱，0.2%甲酸水溶液和乙腈為流動相，0.2 mL/min流速梯度洗脫，能夠?qū)㈦s質(zhì)峰分開，實際分離效果很好，詳細液相條件如表2。

1.3.4 定性方式的確定 本次試驗中每種組分的定性均采用保留時間和離子比率2個因素。

1.3.5 檢出限和定量限的確定將信噪比為3:1時的藥物濃度定為檢測限，將信噪比為10:1的時待檢測樣品中的濃度為定量限。

取1±0.2 g荊防敗毒散樣品，分別制備成一系列濃度的利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍陽性樣品，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.6 標準添加曲線的建立將抗病毒類藥物標準品配成混合標準工作液，分別制成10、20、50、100、500和1 000 μg/L的標準品溶液，依次從低濃度到高濃度進樣，每濃度進樣2針，按其所得峰面積的平均值與對應(yīng)的標準溶液濃度作標準曲線，并計算標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

表2 液相梯度洗脫程序Table 2 Liquid phase gradient elution procedure

1.3.7 添加回收試驗取適量的荊防敗毒散樣本，根據(jù)10、20、40 μg/kg的比例分別添加利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍，配制成樣品溶液，送入機器中進行檢測。每個藥品需要進行6次平行檢測，記錄檢測結(jié)果。

1.3.8 精密度與準確度相對標準偏差（RSD）=標準偏差（SD）/計算結(jié)果的算術(shù)平均值（X）×100%。

1.3.8.1 精密度取空白樣品荊防敗毒散18份，每份稱取1.00±0.02 g，分別加入100.0 μg/L的混合標準工作液100.0、200.0、500 μL，制成低、中、高3個濃度（溶液濃度分別為10.0、20.0、50.0 μg/kg）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每一濃度6樣本分析，計算QC樣品的測得濃度。

1.3.8.2 準確度取適量的混合標準工作液，配制成10 μg/L，重復(fù)測定濃度10.0 μg/L的混合標準工作液6次，通過峰面積的平均值和標準差求得變異系數(shù)，記錄并計算試驗結(jié)果。

1.3.9 測定低限添加回收分別取空白樣品荊防敗毒散、黃連敗毒散2份，每份稱取1.00±0.02 g，分別加入100.0 μg/L的混合標準工作液100 μL，制成濃度為10 μg/kg的質(zhì)量控制（QC）樣品，進行平行樣品分析，計算QC樣品的測得濃度，根據(jù)QC樣品測定結(jié)果計算本法的回收率。

1.3.1 0穩(wěn)定性試驗檢測按照方法要求，取1±0.2 g空白樣品荊防敗毒散樣品，制備成含量為40 ppb的利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍樣品，連續(xù)3 d進行檢測。

1.3.1 1檢測方法的應(yīng)用試驗方法確立后，于市場中隨機抽檢36種抗病毒類中成藥應(yīng)用試驗確立方法進行結(jié)果檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限和定量限的確定結(jié)果結(jié)果表明，10 μg/kg的利巴韋林樣品，其檢測圖譜定量離子的信噪比總能大于3以上；20 μg/kg的利巴韋林樣品，其信噪比在10以上，且其圖譜清晰，分離效果較好，所以將利巴韋林檢出限和定量限分別定為10 μg/kg和20 μg/kg。用同樣方法確定阿昔洛韋的檢出限和定量限分別為10 μg/kg和20 μg/kg，嗎啉胍（病毒靈）的檢出限和定量限分別為10 μg/kg和20 μg/kg。

2.2 標準添加曲線檢測結(jié)果結(jié)果表明，利巴韋林標準曲線在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，利巴韋林的線性方程為：A=58.69C+3616.04；阿昔洛韋標準曲線在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)均達到0.99以上，阿昔洛韋的線性方程為：A=557.384C+96.8.76；嗎啉胍標準曲線在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)均達到0.99，嗎啉胍的線性方程為：A=135.735C+2400.12。以上符合確證試驗相關(guān)要求。結(jié)果見表3和圖1。

表3 抗病毒類藥物標準曲線結(jié)果表Table 3 Standard curve of Antiviral drugs during method

圖1 利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍標準品圖譜Fig.1 Standard atlas of Ribavirin,acyclovir,morpholine

2.3 添加回收試驗結(jié)果對分別添加10、20、40 μg/kg利巴韋林的荊防敗毒散樣品進行6平行檢測，測得平均回收率分別為105.50%、111.75%、98.67%。對分別添加10、20、40 μg/kg阿昔洛韋的荊防敗毒散樣品進行6平行檢測，測得樣品中平均回收率分別為105.17%、106.75%、116.75%。對分別添加10、20、40 μg/kg嗎啉胍的荊防敗毒散樣品進行6平行檢測，測得樣品中平均回收率分別為87.91%、86.25%、107.19%。

2.4 精密度檢測結(jié)果試驗結(jié)果表明，10 μg/kg的利巴韋林、阿昔洛韋與嗎啉胍的相對標準偏差分別為18.53%、4.46%和2.49%；20 μg/kg的利巴韋林、阿昔洛韋與嗎啉胍的相對標準偏差分別為1.65%、0.69%和1.27%；50 μg/kg的利巴韋林、阿昔洛韋與嗎啉胍的相對標準偏差分別為1.87%、1.21%和0.55%；據(jù)QC樣品測定結(jié)果計算本法的精密度，均小于20%。結(jié)果見表4。

2.5 準確度檢測結(jié)果重復(fù)測定濃度10.0 μg/L的混合標準工作液6次，通過峰面積的平均值和標準差求得變異系數(shù)，利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的變異系數(shù)分別為0.72%、1.47%、2.93%，變異系數(shù)均小于3%。

2.6 測定低限添加回收結(jié)果根據(jù)QC樣品測定結(jié)果計算本法的回收率，在86.25%～116.75%之間，其中荊防敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限結(jié)果中顯示：利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的結(jié)果平均值分別為97.35%、101.15%、99.40%；黃連敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限結(jié)果顯示：利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的結(jié)果平均值分別為97.30%、100.30%、99.40%。詳細結(jié)果見表5和表6。

2.7 穩(wěn)定性試驗檢測結(jié)果按照方法要求，取1±0.2 g空白樣品荊防敗毒散樣品，制備成含量為40 ppb的利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍樣品，連續(xù)3 d按照本方法操作進行檢測，結(jié)果見表7。相對標準偏差分別為7.23%、10.5%、11.3%，穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品檢測結(jié)果方法建立以后隨機抽取了市售抗病毒類中成藥進行監(jiān)測，共監(jiān)測了36批次藥品，其中檢測到21號樣品檢測到添加了利巴韋林，33號樣品添加了阿昔洛韋和嗎啉胍，其余均為陰性。結(jié)果見表8。

3 討論

我國現(xiàn)階段對中成藥的非法添加監(jiān)測并不是特別完善，亟需建立完善的檢測技術(shù)及監(jiān)測手段。張雪嬌等[9]、田曉玲等[10]利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法對鎮(zhèn)靜安神藥中的非法添加化學物質(zhì)進行了相應(yīng)的檢測，并取得一定的效果。

表 4 荊防敗毒散中抗病毒類藥物精密度統(tǒng)計表Table 4 Precision statistics of antiviral drugs

表 5 荊防敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限統(tǒng)計表Table 5 Table of low limit for testing of antiviral drugs

表 6 黃連敗毒散中抗病毒類藥物檢測低限統(tǒng)計表Table 6 Table of low limit for testing of antiviral drugs

本次試驗中主要以50 mm×2.1 μm×1.7 μm的BEHC18柱為分離柱，0.2%甲酸的水溶液及乙腈作為UPLC的流動相，甲酸在其中的作用是能夠改善色譜結(jié)果中的峰值，使樣品在質(zhì)譜中的電離更加的充分，提高電離的效果。本次試驗中UPLC采用梯度洗脫程序，提高結(jié)果的分辨率及準確度，并且能夠使系統(tǒng)在檢測的時候具有更高的靈敏性，大大地縮短了檢測所需要的時間。流速為0.2 mL/min能將雜質(zhì)峰充分分開。本次試驗UPLC通過梯度洗脫能夠在4.5 min內(nèi)完成全部成分的分離過程，且分離效果良好。一般的HPLC方法進行分離的試驗平均分離時間為20 min左右，與HPLC相比本次試驗應(yīng)用的方法在檢測效果較高的基礎(chǔ)上能夠大大地提高分離時間。

從利巴韋林、阿昔洛韋、嗎啉胍的結(jié)構(gòu)和文獻報道中可以發(fā)現(xiàn)，利巴韋林可以生成[M+H]+（m/z245），阿昔洛韋可以生成[M+H]+（m/z226），嗎啉胍可以生成[M+H]+（m/z172）的分子離子峰，分別對其進行離子掃描，最終確認利巴韋林245＞113和245＞96為定量和定性離子對；阿昔洛韋226.06＞152.01和226.06＞135.05為定量和定性離子對；嗎啉胍171.94＞113.04和171.94＞88.01為定量和定性離子對。由于利巴韋林極性較強，在反相C18色譜柱上的保留較弱，采用高比例的水相作為梯度洗脫的初始比例，同時添加0.2%的甲酸促進正離子的電離，從而使檢測結(jié)果更加準確、可靠。本次試驗中通過對獸用中成藥中抗病毒類藥物非法添加的檢測技術(shù)的建立，可為相關(guān)產(chǎn)品非法添加抗病毒類藥物的監(jiān)督檢驗提供技術(shù)支撐。

表 7 荊防敗毒散中抗病毒類藥物穩(wěn)定性試驗結(jié)果統(tǒng)計表Table 7 Statistical Table for Stability Test Results of Antiviral Drugs

表 8 抗病毒類中獸藥中非法添加利巴韋林阿昔洛韋嗎啉胍的檢測陽性結(jié)果Table 8 Positive results of illegal addition of Ribavirin,acyclovir,morpholine to antiviral drugs