西洛他唑?qū)Υ笫笮氖壹to及ICa-L離子通道的影響

吳英樂，李廣平，何 蓉，李 健，董平栓

西洛他唑(cilostazol)是一種抗血小板聚集藥物，最初是作為治療間歇性跛行的藥物，于1999年被美國FDA批準(zhǔn)上市，其藥理活性成分為其代謝產(chǎn)物3，4-二氫-西洛他唑和4’-順式-羥基-西洛他唑，其通過高效選擇性抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)Ⅲ的活性，維持腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)活性，防止AC降解，使具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管等作用的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量升高[1]，達(dá)到抗血小板聚集及防止血管堵塞的目的。在治療慢心率房顫、病竇綜合征及二度Ⅰ型房室傳導(dǎo)阻滯的過程中，研究者發(fā)現(xiàn)西洛他唑可使心率有所提升，可明顯改善心臟的自律性[2-7]。也有研究認(rèn)為給予Brugada綜合征患者西洛他唑藥物治療后，室顫的發(fā)生概率顯著降低[8]，而具體機(jī)制并不清楚。本研究通過不同給藥方式，給予大鼠西洛他唑，監(jiān)測大鼠心肌細(xì)胞瞬間外向鉀電流(Ito)以及其L型鈣離子流(ICa-L)的變化，探討該藥物在治療心律失常方面的作用。

1 對(duì)象及方法

1.1對(duì)象

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性Spraque-Dawley大鼠(北醫(yī)動(dòng)物中心)20只，體質(zhì)量300～350 g。

1.1.2實(shí)驗(yàn)分組雄性SD大鼠隨機(jī)分組：對(duì)照組10只，正常喂養(yǎng)3～4周；觀察組10只，在正常喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，使用灌胃法給予西洛他唑每日10 mg·kg-1(西洛他唑正常成人常規(guī)用量為100 mg·d-1，按照等效劑量換算，大鼠用量約為10 mg·kg-1)，喂養(yǎng)3～4周。

1.2單個(gè)細(xì)胞分離方法

1.2.1溶液配制500 mL無鈣臺(tái)式液：10倍臺(tái)式液母液50 mL，1 360 mM NaCl母液50 mL，HEPES 1.192 g，Glucose 0.901 g，pH值7.40(NaOH)，50 mL無鈣液2份、冷藏/凍存。 100 mL KB液：母液10 mL，Taurine 0.125 g，L-Glutamic Acid 1.029 9 g，EGTA 0.38 g，Glucose 0.18 g，pH用KOH調(diào)至7.40，后加入BSA 0.5 g。生理臺(tái)式液500 mL：母液50 mL，1 360 mM NaCl 50 mL、HEPES 1.192 g、Glucose 0.901 g，1 M CaCl20.9 mL，pH用NaOH調(diào)至7.40。60 mL酶液：膠原酶Ⅱ0.02 g(worthington)、BSA 0.12 g、50 mM CaCl20.1 mL (Ca2+濃度50～80 μM)，定容。西洛他唑(cilostazol)溶于二甲亞砜配制成母液，使用時(shí)再次稀釋，西洛他唑濃度分別達(dá)到2 μmol·L-1及50 μmol·L-1。西洛他唑在人體內(nèi)環(huán)境可達(dá)的最大血藥濃度為2 μmol·L-1。

1.2.2心室肌細(xì)胞分離采用膠原酶Ⅱ酶解法：喂養(yǎng)3～4周后的兩組大鼠使用10%水合氯醛300 mg·kg-1腹腔注射麻醉后開胸取心，主動(dòng)脈插管，在通100%O2條件下進(jìn)行灌流。依次用無鈣臺(tái)氏液(5～6 min )、含0.033%膠原酶Ⅱ(worthington)的無鈣臺(tái)式液(13～15 min)進(jìn)行灌流。之后，取右心室心肌組織，將其置于KB溶液中剪碎、吹打并過濾，將濾出液用KB液稀釋2倍后進(jìn)行離心，后將細(xì)胞沉渣以KB液稀釋至40 mL，置于50 mL小燒杯中，室溫靜置1h備用。高質(zhì)量的單細(xì)胞標(biāo)本可供8～12 h的膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.3心肌細(xì)胞離子通道記錄方式①將大鼠右心室肌單細(xì)胞標(biāo)本導(dǎo)入灌流池，使用膜片鉗技術(shù)記錄兩組大鼠的心室肌細(xì)胞的Ito和ICa-L。②將濃度為50 μmol·L-1或2 μmol·L-1的Cilostazol溶液注入細(xì)胞外灌流液，進(jìn)行灌流—洗脫實(shí)驗(yàn)，記錄給藥及洗脫后的Ito離子通道的變化。

1.4心肌細(xì)胞離子通道記錄方案①Ito：鉀電流電極內(nèi)液及NMDG無鈉液為細(xì)胞外液。HP：-40 mV失活鈉電流，TP：-50 mV～+60 mV，階躍+10 mV，Time 300 ms，刺激0.5 Hz，采樣20 kHz，低通濾波頻率5 kHz。②ICa-L記錄方案：鈣電流電極內(nèi)液及生理臺(tái)式液為細(xì)胞外液，HP：-40 mV，TP-50 mV～+60 mV，階躍+10 mV，Time 200 ms，刺激0.2 Hz、采樣20 kHz，低通濾波頻率5 kHz，采用P/N漏減(n=4，濾波時(shí)間180 ms)。

2 結(jié)果

2.1急性藥理學(xué)試驗(yàn)

2.1.150μmol·L-1西洛他唑?qū)to的影響將濃度為50 μmol·L-1的西洛他唑加入灌流池，可以迅速阻滯大鼠心室肌的瞬間外向鉀電流(Ito)，3 min內(nèi)達(dá)穩(wěn)態(tài)，洗脫藥物后，其可基本恢復(fù)到對(duì)照水平，見圖1。

2.1.250μmol·L-1西洛他唑灌流前后對(duì)Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響將50 μmol·L-1西洛他唑加入細(xì)胞外液后數(shù)分鐘的Ito變化(n=7)，與對(duì)照組相比，自指令電壓+10 mV至最大+60 mV測試電壓范圍內(nèi)，西洛他唑灌流后瞬間外向鉀電流(Ito)電流密度均小于灌流前，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=7)，在+60 mV時(shí)，兩組Ito的電流密度分別為(21.55±2.61) pA/pF和(5.36±2.16) pA/pF(P<0.001)，自指令電壓+10 mV～+60 mV西洛他唑均可明顯抑制Ito，見圖2。

西洛他唑可逆性抑制Ito電流：A：給藥前Ito基線；B：50 μmol·L-1西洛他唑加入3 min；>西洛他唑灌流—洗脫實(shí)驗(yàn)對(duì)一個(gè)大鼠右心室肌細(xì)胞(Cm=90 pF)Ito的影響

圖2 50 μmol·L-1西洛他唑灌流前后對(duì)Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響(n=7)

2.1.32μmol·L-1西洛他唑灌流前后對(duì)Ito的影響將濃度為2 μmol·L-1的西洛他唑加入灌流池，此濃度為成人口服常規(guī)劑量的西洛他唑可達(dá)到的最大血藥濃度，觀察到西洛他唑可以阻滯大鼠右心室肌的瞬間外向鉀電流(Ito)，2 min內(nèi)達(dá)穩(wěn)態(tài)，藥物洗脫后，Ito可部分恢復(fù)到正常水平，見圖3。

A：給藥前Ito基線；B：2 μmol·L-1 西洛他唑加入2 min；C：洗脫9 min；D:曲線圖。圖3 2 μmol·L-1西洛他唑灌流—洗脫實(shí)驗(yàn)對(duì)一個(gè)大鼠右心室肌細(xì)胞(Cm=140 pF)Ito的影響

2.1.42μmol·L-1西洛他唑灌流前后對(duì)Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響可見與對(duì)照組相比，自指令電壓+30 mV至最大+60 mV測試電壓范圍內(nèi)，給予西洛他唑灌流后，大鼠右心室肌瞬間外向鉀電流(Ito)電流密度均小于灌流前，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，n=5)，在+60 mV時(shí)，兩組電流密度分別為(18.64±7.89) pA/pF和(7.63±1.78) pA/pF(P=0.02)，自指令電壓+30 mV～+60 mV西洛他唑均可明顯抑制Ito，見圖4。

2.2西洛他唑?qū)﹄x子通道的影響

2.2.1西洛他唑?qū)to的影響舉例繪制觀察組Ito電流圖樣，見圖5。

圖4 2 μmol·L-1西洛他唑灌流前后對(duì)Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響(n=5)

A：對(duì)照組(Cm=90 pF) ，B：觀察組(Cm=100 pF)。圖5 舉例Ito電流圖樣

2.2.2西洛他唑?qū)to平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響在+60 mV時(shí)，對(duì)照組Ito電流密度為(20.23±5.64) pA/pF，觀察組為(21.74±8.56) pA/pF，P>0.05，兩組Ⅰ～Ⅴ曲線無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖6。

2.2.3西洛他唑?qū)型鈣電流(ICa-L)的影響舉例繪制對(duì)照組及觀察組ICa-L電流圖樣，見圖7。

圖6 對(duì)照組及觀察組Ito平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線

A: 對(duì)照組(Cm=90pF)；B：觀察組(Cm=100pF)。 圖7 舉例ICa-L電流圖樣

2.2.4西洛他唑?qū)Ca-L平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響在+10 mV時(shí)，對(duì)照組ICa-L電流密度為(-6.24±2.64) pA/pFh，觀察組為(-5.18±1.35) pA/pF，西洛他唑?qū)山M大鼠心肌的L-型鈣通道電流(ICa-L)的Ⅰ～Ⅴ曲線的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(P>0.05)，見圖8。

圖8 對(duì)照組及觀察組ICa-L平均電流密度的Ⅰ～Ⅴ曲線

3 討論

Antzelevitch等[9-12]提出了2相折返(phase 2 reentry)的概念，研究提示室性心律失常可由2相折返引起，即心肌動(dòng)作電位平臺(tái)期局部電流可引起折返激動(dòng)而誘發(fā)心律失常。Ito在心外膜和心肌層的密度比心內(nèi)膜高，當(dāng)Ito在心肌的這種異質(zhì)分布因某種病理因素或藥物的干預(yù)而出現(xiàn)變化時(shí)，引起心肌電異質(zhì)性的增加，心外膜細(xì)胞動(dòng)作電位圓頂消失、時(shí)程縮短、平臺(tái)期消失，進(jìn)而導(dǎo)致心室肌跨壁復(fù)極離散度增大，導(dǎo)致2相折返。目前研究認(rèn)為Brugada綜合征、特發(fā)性室速及心肌缺血再灌注性心律失常等多種心律失常均可能與2相折返關(guān)系密切。

在對(duì)Brugada綜合征的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞內(nèi)膜和外膜的Ito密度差異顯著，外膜Ito密度顯著高于心內(nèi)膜，使得其電壓梯度差增加，導(dǎo)致跨壁電流形成，反映在心電圖上呈J波和J點(diǎn)抬高，ST段抬高。而后形成跨壁折返微環(huán)路正是由跨壁局部電流的作用導(dǎo)致局部的心肌細(xì)胞興奮，外膜層細(xì)胞再次激動(dòng)即2相折返，誘導(dǎo)惡性心律失常的發(fā)生。然而在目前的臨床治療中，對(duì)此類惡性心律失常唯一可靠的治療方法仍是安置植入型除顫儀，相關(guān)藥物治療的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。理論上，通過減少Ito離子通道電流或增強(qiáng)ICa-L增加內(nèi)向電流，抑制2相折返的發(fā)生，即可維持心外膜動(dòng)作電位的正常形態(tài)[8,13-14]，達(dá)到預(yù)防此類惡性心律失常發(fā)生的目的。

有研究表明Brugada綜合征患者的惡性心律失?？梢员晃髀逅蛴行У仡A(yù)防[8,15]，其機(jī)制可能是：①在起搏細(xì)胞中，ATP和腺嘌呤衍生物有潛在的增強(qiáng)負(fù)性變時(shí)作用，西洛他唑有提升心率的正性變時(shí)作用，其機(jī)制是使心肌細(xì)胞對(duì)腺苷攝取減少，在此基礎(chǔ)上有效抑制了瞬間外向鉀電流(Ito)。②瞬間外向鉀電流(Ito)被抑制后，緊隨其之后開放的離子通道都會(huì)延遲開放，達(dá)到延遲ADP的作用。③細(xì)胞內(nèi)的磷酸二酯酶(PDE)Ⅲ的活性可被西洛他唑選擇性抑制，PDEⅢ降解AC的作用減弱，維持細(xì)胞內(nèi)較高的cAMP濃度又可通過cAMP/PKA通路增強(qiáng)鈣離子電流；同時(shí)通過提升心率抑制Ito，也可以增強(qiáng)竇房結(jié)的ICa-L(8)。綜上，西洛他唑一方面抑制 Ito，另一方面增強(qiáng)ICa-L，維持心肌動(dòng)作電位同質(zhì)性，預(yù)防2相折返的發(fā)生，預(yù)防此類惡性心律失常的發(fā)生。

但國內(nèi)外對(duì)于使用膜片鉗技術(shù)觀察西洛他唑?qū)to和ICa-L影響的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過急性藥理試驗(yàn)(灌流—洗脫實(shí)驗(yàn))，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，監(jiān)測Ito和ICa-L在西洛他唑影響下的變化情況，結(jié)果證明將濃度為50 μmol·L-1及2 μmol·L-1的西洛他唑加入細(xì)胞外灌流液，均可明顯降低Ito的幅度值。分別由給藥前的(21.55±2.61) pA/pF降至(5.36±2.16) pA/pF，及給藥前的(18.64±7.89) pA/pF降至(7.63±1.78) pA/pF，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且西洛他唑洗脫后，Ito幅值均可恢復(fù)，證明大鼠心室肌細(xì)胞Ito的幅值大小可直接受到西洛他唑的影響。其機(jī)制可能是直接作用于離子通道(降低活性、減少數(shù)量)，改變其生物學(xué)功能。這說明西洛他唑通過抑制心肌細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，在提升心率的同時(shí)抑制Ito，只是其抑制Ito的繼發(fā)原因之一。而由于大鼠右心室肌ICa-L自身衰減較快，且用全細(xì)胞膜片鉗記錄ICa-L通道所用的電極內(nèi)液具有細(xì)胞毒性，不能確切記錄西洛他唑?qū)﹄x子通道的影響，故本實(shí)驗(yàn)未通過急性藥理試驗(yàn)來觀察西洛他唑?qū)Υ笫笥倚氖壹Ca-L的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組與對(duì)照組相比，兩組Ito及ICa-L差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析可能是因?yàn)椋孩贁?shù)據(jù)樣本量不足，數(shù)據(jù)可能存在一定不穩(wěn)定性，存在假陰性的可能。②藥物作用于離子通道，改變其生物學(xué)功能，發(fā)揮其調(diào)控作用，是一個(gè)長期慢性的過程。本實(shí)驗(yàn)給予藥物時(shí)間為3至4周，可能給藥時(shí)間不足夠長久，離子通道未發(fā)生顯著的功能變化。③急性藥理試驗(yàn)西洛他唑加入細(xì)胞外灌流液，直接作用于大鼠心肌細(xì)胞，影響其離子通道的開放；臨床上患者口服用藥在藥物效能和作用時(shí)間上均達(dá)不到基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中直接作用于心肌細(xì)胞的效果，存在較大的差異性，因此仍需要大量臨床及基礎(chǔ)研究驗(yàn)證和探討。

本研究存在一些局限性：①數(shù)據(jù)樣本量不足，結(jié)論誤差大，不排除假陰性的可能；②本實(shí)驗(yàn)僅使用正常大鼠心室肌細(xì)胞來觀察西洛他唑?qū)to和ICa-L離子通道的影響，未模擬心?；蛐穆墒С５葘?shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，仍需進(jìn)一步完善。③本研究只觀察了西洛他唑?qū)Υ笫笥倚氖壹to和ICa-L兩個(gè)離子通道的影響，探討其可能的抗心律失常作用，然而心房肌細(xì)胞的離子通道很可能另有特點(diǎn)，因此仍需要大量科學(xué)論據(jù)來論證西洛他唑?qū)π募〖?xì)胞離子通道的影響和機(jī)制。

總之，本實(shí)驗(yàn)證明將西洛他唑加入細(xì)胞外灌流液，使用膜片鉗技術(shù)觀察其直接作用于大鼠右心室肌細(xì)胞，可以抑制Ito，提示西洛他唑可能通過抑制Ito而恢復(fù)心肌動(dòng)作電位平臺(tái)期和維持動(dòng)作電位的同質(zhì)性，從而抑制以2相折返為基礎(chǔ)惡性心律失常的發(fā)生。