針刺對組胺致癢小鼠5-羥色胺及其受體表達的影響

趙一丁，閆嬋娟，閆小寧

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

瘙癢的定義最早由德國醫(yī)生Samuel Hafenreffer于350年前提出[1]，其是一種可引發(fā)搔抓意愿和搔抓反射的特異性皮膚感覺，是特應(yīng)性皮炎、銀屑病、蕁麻疹等多種皮膚疾病的常見表現(xiàn)。瘙癢的產(chǎn)生涉及復雜的信號傳導通路，主要包括組胺依賴性瘙癢和非組胺依賴性瘙癢2種機制。5-羥色胺(5-HT)是一種重要的內(nèi)源性致癢物質(zhì)，通過組胺依賴性通路傳導激活感覺神經(jīng)元而產(chǎn)生癢覺信號。針刺對瘙癢具有不同程度的抑制作用，但其機制尚不清楚，故本研究通過構(gòu)建組胺依賴性瘙癢小鼠模型，觀察針刺穴位對模型小鼠體內(nèi)5-HT及其受體的表達影響，探討了針刺對瘙癢調(diào)控的作用機制。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康C57B/6J雄性小鼠30只，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供(許可證號：SCXK2012-003)。均飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，室溫控制在18～24 ℃，濕度控制在50%～70%，光照時間8:00—20:00，自由飲水進食。實驗過程中對實驗動物的處置均符合2006年國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。

1.2主要試劑與儀器 98%組胺二磷酸鹽、HTR2B(美國Proteintech公司，26408-1-AP)，Beta-actin(美國Santa Cruz Biotechnology公司，SC-47778)，羊抗鼠二抗(美國PIERCE公司，31430)，羊抗兔二抗(美國PIERCE公司，31460)，考馬斯亮藍R-250、Tween20(均購自美國Amresco公司)，OCT包埋劑(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)，NC膜、BCA kit、Supersignalwest pico(均購自美國PIERCE公司)，RIPA蛋白裂解液(上海邦奕生物科技有限公司)，Cocktail蛋白酶抑制劑(德國Roch公司)，5-HT酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。超低溫冰箱(日本SANYO)，臺式離心機(美國Benchmark)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海生工生物工程股份有限公司)，蛋白垂直電泳槽(美國Biorad公司)，蛋白濕轉(zhuǎn)儀(美國Biorad公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，攝像機(日本SONY)，50 μL微注射器，一次性30號毫針，微計量器，血管鉗，手術(shù)刀，眼科剪。

1.3分組、造模及干預 應(yīng)用隨機數(shù)字表將30只C57B/6J小鼠隨機分為模型組、針刺組和生理鹽水組，每組10只。實驗前所有小鼠放入透明樹脂盒內(nèi)每天適應(yīng)1 h，連續(xù)3 d后開始實驗。實驗第1天，各組小鼠頸背部(肩胛連線中點上方約5 mm處)皮膚刮毛，將小鼠放入透明樹脂盒內(nèi)適應(yīng)1 h后，生理鹽水組于小鼠頸背部刮毛區(qū)注射生理鹽水50 μL，模型組和針刺組于小鼠頸背部刮毛區(qū)皮內(nèi)注射磷酸組胺50 μL，然后立即放入透明樹脂盒子內(nèi)觀察小鼠行為學變化，第2天操作同第1天，同時針刺組開始針刺干預，小鼠穴位定位及針刺深度均參照《實驗針灸學》[2]，將30號毫針直刺雙側(cè)血海、曲池及合谷穴5 mm，采用提插和捻轉(zhuǎn)手法刺激，留針20 min，每天1次，共針刺2 d。各組第3天操作同第2天。

1.4觀察指標

1.4.1行為學觀察 各組小鼠自第1次頸部皮下注射致癢劑/生理鹽水當日起開始行為學觀察，觀察過程中保持室內(nèi)安靜無人，攝像機錄像40 min，實驗結(jié)束后回放錄像觀察小鼠活動情況。瘙癢行為學以搔抓次數(shù)進行評判：以小鼠后爪離開盒子底面并搔抓皮膚，到其后爪落地或舔舐其后爪為一次完整的搔抓動作，在此期間不管搔抓多少次，均記為1次[3]。由2名不參加實驗的工作人員記錄小鼠搔抓次數(shù)。

1.4.2血清5-HT水平 實驗結(jié)束后，取各組小鼠眼球血2 mL，置于對應(yīng)標號的采血管中，在離心機中以1 500 r/min離心20 min，收集血清置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA法、按試劑盒中說明方法測定血清5-HT水平。

1.4.3延髓組織中5-HT受體表達情況 采用Western-blot法檢測。實驗結(jié)束后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉各組小鼠，然后固定在操作臺上，迅速開胸，提拉胸骨柄，完全暴露小鼠心臟，使用6號靜脈輸液器插入左心室后，用血管鉗固定好輸液器進針處，并夾閉心臟，剪開右心耳，打開靜脈輸液器最快滴速注入生理鹽水，觀察小鼠肝臟及腸管，待肝臟由紅色變?yōu)榘咨?、腸管鼓脹后，四肢及尾部僵直，迅速緊貼小鼠枕骨下用剪刀斷頭，剔除多余皮膚、肌肉組織，用彎鉗剪去顱骨，將大腦沿腹側(cè)剝出并置于冰面上，切除小腦后定位延髓上、下界，取延髓置于凍存管內(nèi)迅速放入液氮中凍存，后置于-80 ℃冰箱中保存。檢測時取出-80 ℃冰箱保存的延髓組織，稱質(zhì)量后在研缽中倒入液氮，研碎組織塊后移入EP管中，在管中加入RIPA蛋白裂解液(每克組織3 mL)、蛋白酶抑制劑Aprotinin，充分裂解后取上清液置于新EP管內(nèi)，冰上保存，將各樣品蛋白液1∶50稀釋，參照BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白測定，每個樣品取相同質(zhì)量的蛋白，加入5×loading buffer后沸水煮10 min使蛋白變性；將制備好的10%凝膠板放入電泳槽內(nèi)，倒入1×Running Buffer，用細槍頭加樣，確定加樣順序和計算加樣量；將電泳槽與電源連接好，以90 V穩(wěn)壓狀態(tài)電泳，當溴酚藍進入分離膠時將電壓調(diào)整至100 V，待溴酚藍電泳至分離膠底部停止電泳；按方向依次放好濾紙、膠、膜，直至整個夾板保持緊密，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉，可在室溫封閉4 h；結(jié)合一抗，在4 ℃過夜，HTR2B(1∶1 000)，室溫漂洗3次，每次10 min，結(jié)合二抗，室溫結(jié)合2 h；羊抗鼠二抗(1∶10 000)、羊抗兔二抗(1∶10 000)，室溫漂洗3次，每次10 min，最后一次用TBS漂洗以去除吐溫；化學發(fā)光，于暗室中曝光操作，梯度曝光10 s～5 min。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠搔抓次數(shù)比較 模型組和針刺組小鼠造模第1，2，3天搔抓次數(shù)均明顯多于生理鹽水組(P均<0.05)，模型組小鼠造模第1，2，3天搔抓次數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；針刺組小鼠造模第1，2天搔抓次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但造模第3天搔抓次數(shù)明顯少于第1，2天及模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠搔抓次數(shù)比較次/40 min)

注：①與生理鹽水組比較，P<0.05；②與造模第3天比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05。

2.2各組小鼠血清5-HT及延髓組織中5-HT受體表達水平比較 模型組和針刺組小鼠血清5-HT水平和延髓組織中5-HT受體表達水平均明顯高于生理鹽水組(P均<0.05)，針刺組小鼠血清5-HT水平明顯低于模型組(P<0.05)；針刺組與模型組小鼠延髓組織中5-HT受體表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2及圖1。

3 討 論

瘙癢是許多皮膚疾病常見而棘手的臨床表現(xiàn)，如特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、皮膚瘙癢癥、銀屑病等。中醫(yī)認為瘙癢由風、濕、熱、蟲、毒之邪氣郁于皮膚腠理之間，使其氣血不和，膚失濡養(yǎng)，郁而生微熱所致，或由于血虛風燥阻于皮膚，肌膚失養(yǎng)，內(nèi)生虛熱而發(fā)。針灸可通過穴位刺激激發(fā)機體的自愈能力，達到疏風解表、清熱祛濕、殺蟲止癢、調(diào)和氣血的作用[4]。大量研究證實針刺對瘙癢性疾病具有很好的療效[5]，但對于針刺止癢的機制研究主要圍繞外周瘙癢遞質(zhì)的變化來展開，缺少對高級中樞的研究。

表2 各組小鼠血清5-HT及延髓組織中5-HT受體表達水平比較

注：①與生理鹽水組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

圖1 各組小鼠延髓組織中5-HT受體表達情況

瘙癢與疼痛同為傷害性刺激，對脊髓上中樞組成的下行調(diào)制系統(tǒng)具有激活作用，其中延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核(rostral ventromedial medulla,RVM)作為下行系統(tǒng)的重要組成部分，參與多種神經(jīng)遞質(zhì)對感覺的調(diào)控[6]。5-HT是一種重要的內(nèi)源性致癢物質(zhì)，廣泛存在于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過興奮機械刺激不敏感的無髓鞘C-纖維，這類纖維主要介導組胺依賴性瘙癢信號的傳導；5-HT受體為G蛋白偶聯(lián)受體，其家族中5-HT2受體主要參與癢覺的產(chǎn)生，5-HT2受體通過活化磷脂酶C(phospholipase C,PLC)及絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號通路，誘導背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)儲存的Ca2+釋放和細胞外Ca2+內(nèi)流，增加神經(jīng)細胞興奮性，產(chǎn)生癢覺[7]。Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，破壞RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元可明顯減少組胺誘發(fā)的搔抓次數(shù)。邵鵬[9]報道針刺可降低5-HT致癢大鼠血清IgE含量及5-HT2A受體數(shù)量。本研究通過建立組胺依賴性瘙癢動物模型，以外周5-HT及其中樞受體的表達為研究靶點，以針刺曲池、血海、合谷為干預措施，探討了針刺止癢的可能機制。

曲池、合谷屬手陽明大腸經(jīng)，乃多氣多血之經(jīng)，善于開泄，能疏泄蘊于肌膚之邪，達到開腠理、疏風清熱止癢的作用；血海屬足太陰脾經(jīng)穴，為血會，具有理血活血、散風除濕的作用，取“治風先治血、血行風自滅”之意。本實驗結(jié)果顯示，組胺致癢動物模型的成功建立可以通過行為學研究證實；針刺組小鼠造模第3天搔抓次數(shù)明顯少于第1，2天及模型組；模型組小鼠血清5-HT水平及延髓5-HT受體表達水平均明顯高于生理鹽水組，針刺組小鼠血清5-HT水平明顯低于模型組，針刺組與模型組小鼠延髓5-HT受體表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義。提示針刺對組胺致癢模型小鼠的搔抓行為具有抑制作用，并且可以下調(diào)血清5-HT水平，為針刺治療組胺依賴性瘙癢性皮膚病提供了一定科學依據(jù)。