青蒿素對(duì)人結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞放療敏感性的影響及其機(jī)制

鄧平，陳新文

（1.湖南省張家界市慈利縣人民醫(yī)院 普外科，湖南 張家界 427200；2.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 普外三科，湖南 常德 415003）

結(jié)直腸癌是當(dāng)今最常見的惡性疾病之一，發(fā)病率極高，嚴(yán)重威脅人類健康。盡管結(jié)直腸癌篩查和治療手段的發(fā)展已提高患者預(yù)期壽命，但結(jié)直腸癌患者預(yù)后仍不理想。放射治療常用于結(jié)直腸癌特別是直腸癌的治療，但臨床上結(jié)直腸癌放療抵抗性發(fā)生率高，而無法獲得良好的腫瘤控制率[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallo proteinase-9,MMP-9）、 環(huán) 氧 化 酶 -2（cyclooxygenase-2,COX-2）及缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）等致癌基因的過表達(dá)，能夠引起腫瘤細(xì)胞放療抵抗性，而這些致癌基因表達(dá)與核轉(zhuǎn)錄因子-κβ（nuclear factor-κβ, NF-κβ）活性密切相關(guān)[2]。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κβ激活后可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、血管新生相關(guān)致癌基因表達(dá)[3]。研究表明放化療能夠增加NF-κβ活性，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放化療抵抗，這是由于NF-κβ激活后能夠上調(diào)B-細(xì)胞淋巴瘤基因2（B-cell lymphoma 2, Bcl-2）、細(xì)胞型Fas結(jié)合蛋白樣白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）的轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（cellular FLICE-inhibitory protein, C-FLIP）等抗凋亡基因表達(dá)。此外，還有研究表明抑制NF-κβ活性表達(dá)可以顯著增強(qiáng)前列腺癌、大腸癌及乳腺癌的放療敏感性[4]。

理想放療增敏劑應(yīng)該能夠增加放射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒殺效果，并降低放射線對(duì)正常組織的損傷[5]。青蒿素（artemisinin, ART）是由我國(guó)研制的抗瘧藥，新近研究表明，青蒿素及其衍生物具有明顯抗腫瘤作用[6]。青蒿素可通過抑制Bcl-2和C-FLIP表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。雖然已有研究指出青蒿素能夠增強(qiáng)結(jié)直腸癌放療敏感性，但作用機(jī)制仍不清楚。本研究主要探討青蒿素能否通過抑制NF-κβ活性增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感 性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Lovo購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物所，培養(yǎng)于37℃，5%二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱，所用培養(yǎng)液為DMEM高糖培基（含10%胎牛血清及5%青鏈霉素）。

1.2 細(xì)胞存活試驗(yàn)

將Lovo細(xì)胞以3×104的密度接種至96孔板，培養(yǎng)過夜后，棄去舊培基，用不同濃度青蒿素（0、10、20、30、40、50 μM）分別處理Lovo細(xì)胞培養(yǎng)24和48 h，移除培養(yǎng)液，加入濃度為1 mg/ ml的MTT溶液，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h。接著移除MTT溶液，再加入20 μl DMSO，靜置5 min后，檢測(cè)490 nm值。

1.3 射線照射

本研究使用的直線加速器為Varian 2 100C，以12 MV X射線照射細(xì)胞，射源到表面的距離為100 cm，培養(yǎng)皿上方墊1.5 cm厚的組織補(bǔ)償膠。

1.4 輻射照射存活曲線

將Lovo細(xì)胞以2×106的密度接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜后，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（0.1%DMSO）、單獨(dú)處理放射線組、放射線結(jié)合青蒿素組、放射線結(jié)合NF-κβ抑制劑組，放射劑量分別為 0、2、4、6、8、10 Gy，青蒿素濃度為30 μM，NF-κβ抑制劑6氨基喹唑啉（6-amino-4-quinazoline, QNZ） 濃 度 為 20 nM。細(xì)胞在射線照射后立即加入青蒿素或NF-κβ抑制劑干預(yù)，24 h后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，并根據(jù)放射劑量，調(diào)整種到細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞數(shù)目，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后，固定細(xì)胞液（甲醇/冰醋酸）10 min后清洗，再加入4%結(jié)晶紫并靜置10 min，清洗后用光學(xué)顯微鏡觀察，細(xì)胞克隆中包含的細(xì)胞數(shù)目要大于50個(gè)，根據(jù)下列功能計(jì)算細(xì)胞存活率。種植效率=（觀察到的克隆數(shù)目/植入的細(xì)胞數(shù)量） ×100%，存活率=觀察到的克隆數(shù)目/［植入的細(xì)胞數(shù)量×（種植效率/100%）］。

1.5 DNA碎片化實(shí)驗(yàn)

將Lovo細(xì)胞以2×106的密度接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜后，將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對(duì)照組（0.1% DMSO）、放射線組（6 Gy）、青蒿素組（30 μM青蒿素）、抑制劑組（20 nM QNZ）、青蒿素聯(lián)合放射線組（30 μM青蒿素結(jié)合放射線處理）、抑制劑聯(lián)合放射線組（20 nM QNZ結(jié)合放射線處理），接著培養(yǎng)24或48 h后，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化并收集至1.5 ml離心管中，提取細(xì)胞基因組DNA，行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 細(xì)胞總蛋白提取

將細(xì)胞數(shù)為2×106的Lovo細(xì)胞株培養(yǎng)在的10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)盤中，經(jīng)24 h的細(xì)胞貼附靜置后，細(xì)胞被隨機(jī)分成6組：對(duì)照組（0.1% DMSO）、放射線組（6Gy）、青蒿素組（30 μM青蒿素）抑制劑組（20 nM QNZ）、青蒿素聯(lián)合放射線組（30 μM青蒿素結(jié)合放射線處理）、抑制劑聯(lián)合放射線組（20 nM QNZ結(jié)合放射線處理），接著培養(yǎng)24或48 h后，提取細(xì)胞總蛋白。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

取對(duì)照組、放射線組、藥物組、藥物聯(lián)合放射線組各組蛋白40 μg，行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離不同分子量蛋白質(zhì)，將膠體上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用封閉液（0.12M Tris-base，1.5M NaCl，0.1%Tween-20，和5%w/v脫脂牛奶）作用4 h，再加入一抗并置于冰箱中過夜，第2天以TBST（0.12 M Tris-base，1.5 M NaCl和0.1% Tween-20）清洗，再加入二抗并置于室溫1 h，以TBST清洗，再ECL顯色，Image J軟件定量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一抗包括：NF-κβ、p-NF-κβ、Bcl-2、C-FLIP、β-actin。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素抑制Lovo存活率及pNF-κβ、Bcl-2和C-FLIP的變化

細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以顯著抑制Lovo生長(zhǎng)，且呈時(shí)效性和劑效性（圖1A）。干預(yù)24 h后，青蒿素對(duì)Lovo的半抑制濃度（IC 50）約為30 μM，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所使用的青蒿素濃度均為30 μM。青蒿素通過誘導(dǎo)凋亡抑制Lovo增殖（圖1B）。

為了探討青蒿素影響Lovo細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究分析了轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ蛋白質(zhì)活性及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和C-FLIP的表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示30 μM青蒿素干預(yù)Lovo 24 h后，磷酸化NF-κβ（p-NF-κβ）、Bcl-2和C-FLIP蛋白表達(dá)抑制比率分別為50%、40%與60%；而干預(yù)48 h后，蛋白表達(dá)抑制比分別為80%、70%與90%，結(jié)果同樣顯示30 μM青蒿素顯著抑制Lovo細(xì)胞p-NF-κβ、Bcl-2和C-FLIP表達(dá)（圖1C）。

2.2 抑制NF-κβ增強(qiáng)Lovo細(xì)胞的放療敏感性

為探討NF-κβ活化對(duì)Lovo細(xì)胞放療敏感性的影響，本研究采用NF-κβ抑制劑QNZ藥物干預(yù)Lovo細(xì)胞，結(jié)果顯示與單獨(dú)射線處理相比，聯(lián)合NF-κβ抑制劑處理Lovo細(xì)胞的存活率更低（圖2A），同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖2B）。

與單獨(dú)射線組處理相比，在聯(lián)合NF-κβ抑制劑與放射線組，細(xì)胞色素C（cytochrome-C）與半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）的表達(dá)顯著增加，而Bcl-2與C-FLIP表達(dá)顯著降低（圖2C），提示NF-κβ抑制劑可促進(jìn)放射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的cytochrome-C和casapase-8蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制因放射線刺激而抗凋亡蛋白Bcl-2和C-FLIP表達(dá)。

2.3 青蒿素增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性和抑制NF-κβ活性

進(jìn)一步評(píng)估青蒿素聯(lián)合射線對(duì)Lovo細(xì)胞增殖和NF-κβ調(diào)控抗凋亡機(jī)制。結(jié)果表明，與射線單獨(dú)處理相比，青蒿素聯(lián)合射線處理更顯著地降低Lovo細(xì)胞的存活率（圖3A）。圖3B顯示與NF-κβ抑制劑干預(yù)相似的是，青蒿素干預(yù)能夠增加放射線誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡的DNA斷裂。當(dāng)NF-κβ磷酸化增加時(shí)，提示NF-κβ可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并且調(diào)控下游致癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。圖3C表明射線可以增強(qiáng)p-NF-κβ表達(dá)，而青蒿素具有降低射線誘導(dǎo)NF-κβ磷酸化的能力，且青蒿素也能抑制射線上調(diào)抗凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2和C-FLIP表達(dá)的能力，同時(shí)增加凋亡蛋白cytochrome-C和casapase-8釋放。

圖1 青蒿素對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株（Lovo）增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 NF-κβ抑制劑增加射線對(duì)Lovo細(xì)胞的殺傷效果

圖3 青蒿素增加結(jié)直腸癌細(xì)胞株（Lovo）的放療敏感性，并抑制NF-κβ活性

3 討論

腫瘤產(chǎn)生抗性是目前臨床治療腫瘤的最大挑戰(zhàn)，許多造成腫瘤抗性的致癌基因就是由轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ調(diào)控激活，臨床研究證明，腫瘤組織內(nèi)NF-κβ表達(dá)越高，腫瘤抗性發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高，患者愈后也就越差[7]。青蒿素是從黃芫花植物青蒿中提取的一類倍半萜制劑，主要用于治療對(duì)喹啉耐藥的頑固性瘧疾。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的研究結(jié)果顯示，青蒿素對(duì)白血病、大腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和腎癌細(xì)胞均有抑制作用。文獻(xiàn)指出，青蒿素具有抗NF-κβ活性功能，以往研究表明青蒿素可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性，但并不清楚其作用機(jī)制是否與青蒿素抑制NF-κβ的活性有關(guān)[8]。因此，本研究擬探討青蒿素通過調(diào)控NF-κβ活性對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性的影響。

細(xì)胞內(nèi)NF-κβ分子路徑分為典型和非典型路徑，典型路徑是指由p65和p50兩種亞基組成的異質(zhì)性蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其活性被NF-κβ抑制蛋白激酶（I kappaB）所抑制，而射線能夠引起NFκβ抑制蛋白激酶分解，使NF-κβ活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄激活下游抗凋亡基因。研究表明特異性抑制NF-κβ活性可以顯著增加大腸癌的放療敏感性[9]，本研究也證實(shí)了這一結(jié)果，常見的NF-κβ抑制劑QNZ可以增強(qiáng)放射線對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，特別是4-10 Gy間劑量的射線。

Bcl-2和C-FLIP由NF-κβ調(diào)控的抗凋亡基因，大量表達(dá)于惡性腫瘤，當(dāng)放射線刺激激活腫瘤NF-κβ時(shí)，也能促進(jìn)Bcl-2和C-FLIP表達(dá)[10]。本研究結(jié)果顯示放射線可以上調(diào)Bcl-2和C-FLIP表達(dá)，而NF-κβ抑制劑可以降低放射線誘導(dǎo)Bcl-2和C-FLIP表達(dá)的能力。

細(xì)胞凋亡路徑可以分成線粒體和非線粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑。發(fā)生線粒體凋亡路徑的主要原因是線粒體膜電位下降，導(dǎo)致cytochrome-C和其他造成細(xì)胞凋亡路徑活化調(diào)控因子釋放[11]。而發(fā)生非線粒體細(xì)胞凋亡途徑的主要原因是細(xì)胞膜外死亡受體激活，不同死亡受體被不同配體所激活，但是這些不同的死亡受體啟動(dòng)細(xì)胞凋亡路徑必定會(huì)造成caspase-8裂解而顯示活性[12]。Bcl-2的功能是穩(wěn)定線粒體膜電位，C-FLIP干擾caspase-8裂解，所以這兩種蛋白質(zhì)表達(dá)阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生，反之降低這兩種蛋白質(zhì)表達(dá)則可使細(xì)胞凋亡順利進(jìn)行。本研究顯示，NF-κβ抑制劑抑制Bcl-2和C-FLIP表達(dá)，促進(jìn)放射線誘導(dǎo)cytochrome-C釋放和caspase-8裂解，提示抑制腫瘤內(nèi)NF-κβ活性后，放射線可通過線粒體和非線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而殺傷Lovo細(xì)胞。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)NF-κβ抑制劑聯(lián)合放射線能夠促使Lovo細(xì)胞DNA斷裂，DNA斷裂是細(xì)胞凋亡的特征之一。

青蒿素除了抗瘧疾作用外，還具有抗癌、抗感染及抗氧化等功能，可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)許多不同的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)從而減少疾病發(fā)生。多項(xiàng)研究還表明，青蒿素還可抑制多種癌細(xì)胞內(nèi)NF-κβ活性及NF-κβ調(diào)控的致癌基因表達(dá)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著青蒿素干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，Lovo細(xì)胞中NF-κβ活性及NF-κβ調(diào)控的致癌基因表達(dá)下降越顯著。由于青蒿素的NF-κβ抑制作用，故可聯(lián)合放化療增加放化療的抗癌效果。以往有研究表明青蒿素增強(qiáng)肺癌、乳腺癌及膠質(zhì)瘤等腫瘤的放療敏感性，但是其具體機(jī)制尚不清楚。目前尚未見青蒿素對(duì)結(jié)直腸癌放療敏感性的相關(guān)研究。本研究顯示，Lovo曝露于青蒿素結(jié)合放射線處理組的存活百分率明顯低于單獨(dú)放射線處理組的細(xì)胞。在圖3B中顯示青蒿素可以降低放射線激活Lovo的NF-κB活性，且相似于圖2C中受NF-κB抑制劑處理后而抑制的Bcl-2和C-FLIP的蛋白表達(dá)，同時(shí)通過增加cytochrome-C和caspase-8而增強(qiáng)放射線誘導(dǎo)Lovo產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明青蒿素能夠通過抑制NF-κB活性提高結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo的放療敏感性。