產(chǎn)氨細菌design—expert軟件優(yōu)化浸銅實驗

李廣澤 雷丁丁 周生

摘 要：傳統(tǒng)微生物浸出優(yōu)化方法一般為單因素實驗法和正交設(shè)計法，為了優(yōu)化產(chǎn)氨浸銅細菌的浸出條件，基于一株高浸出率的產(chǎn)氨浸銅突變株，以浸出率為響應(yīng)值，通過Plackett-Burman（PB）設(shè)計法篩選出影響浸出率的重要因素，通過最陡爬坡實驗接近最大響應(yīng)區(qū)域，使用響應(yīng)曲面分析法建立連續(xù)變量曲面模型。分析浸出率預測模型，并結(jié)合初始浸出條件獲得優(yōu)化浸出條件：檸檬酸鈉：15.5g/L，pH：9.25，溫度：30.61℃，硫酸鎂：0.2g/L，磷酸二氫鈉2.1g/L，磷酸二氫鉀：1.4g/L， 搖床轉(zhuǎn)速：120r/min，接種量：20%。分別在優(yōu)化浸出條件和原始浸出條件下進行浸出實驗，二者浸出率分別為：53.26%和42.71%。

關(guān)鍵詞：微生物浸出；design-expert；浸出優(yōu)化

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.16.001

隨著礦產(chǎn)資源的日益緊張，低品位礦石的開采和利用越來越受到人們的關(guān)注。微生物浸礦成本低、浸礦環(huán)境溫和、綠色環(huán)保 [1]，適合處理低品位礦石，但傳統(tǒng)微生物浸礦菌種較單一，主要聚焦在氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacillus ferrooxidans）的研究上[2]，其在處理硫化礦物上具有優(yōu)勢，但一般無法處理其他類型的礦物，同時在處理堿性脈石礦物時，會因為堿性脈石耗酸量大而導致pH波動大，微生物生長環(huán)境難以保證。堿性微生物浸出 [3-4]可以有效解決以上問題，其浸出環(huán)境為堿性，可以避免出現(xiàn)脈石礦物的高耗酸，防止pH大范圍波動。高效堿性浸礦微生物的研究對于降低浸礦成本、實現(xiàn)綠色礦山、豐富微生物浸礦菌種具有重要意義。

浸出條件優(yōu)化對提高微生物浸出率非常重要。鞏冠群等人[5]優(yōu)化了氧化亞鐵硫桿菌的培養(yǎng)基及浸出條件，使菌株活性獲得明顯提高，最高脫硫效率達到76.2%。郭朝暉等人[6]通過正交設(shè)計和搖瓶實驗，優(yōu)化了Pb/Zn冶煉廢渣中有價金屬生物浸出條件，在優(yōu)化條件下，金屬Cu，Zn，In 和Ga 的浸出率分別達到95.5%，93.5%，85.0%和80.2%。通常浸出條件優(yōu)化的方法為單次單因子法和正交實驗設(shè)計法，單次單因子法無法考察各因素間的交互作用，因而無法總是獲得最佳浸出條件[7]。正交實驗注重如何合理科學的安排實驗，可以找到最佳因素水平組合，但無法在整個區(qū)域上找到響應(yīng)值與各因素的回歸方程，從而無法找到整個區(qū)域上因素的最佳組合[8]。響應(yīng)曲面分析法實驗次數(shù)少、周期短，并且可以獲得各因素與響應(yīng)值的回歸方程，從而可以擬補以往實驗方法存在的不足。本實驗在前期工作中通過紫外誘變篩選出一株高浸出率的產(chǎn)氨浸銅突變株，為了進一步提高其浸銅潛力，本文以浸出率為響應(yīng)值，通過Plackett-Burman（PB）設(shè)計法篩選出影響浸出率的重要因素，通過最陡爬坡實驗接近最大相應(yīng)區(qū)域，使用響應(yīng)曲面分析法建立連續(xù)變量曲面模型，對影響浸出率的重要因素進行優(yōu)化。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

菌種：堿性產(chǎn)氨細菌JAT-1，經(jīng)16SRNA鑒定為Providencia sp. （普羅威登斯菌屬）。

培養(yǎng)基成分：檸檬酸鈉：10g/L、尿素：20g/L、K2HPO4：1.4g/L、Na2HPO4：2.1g/L、MgSO40.2g/L。

初始浸出條件：溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，初始pH：7，接種量20%。

礦石：礦樣為云南某礦氧化銅礦石，使用X射線衍射法對礦石進行銅物相分析，結(jié)果如表1，可以看出該礦石脈石礦物主要以硅酸鹽為主，次有碳酸鹽類及氧化物類，該銅礦石含泥量較高，為典型的難處理高堿性氧化銅礦石[9]。浸礦時采用加工至200目以下的礦樣。

1.2 實驗方法

本實驗采用室內(nèi)搖瓶，取對數(shù)期的細菌按一定的接種量接種至液體培養(yǎng)基中，按14%礦漿濃度加入200目礦樣，于溫度可調(diào)節(jié)的恒溫氣浴振蕩器中振蕩培養(yǎng)。不同時刻的浸出率通過取少量浸出液，檢測銅離子濃度計算獲得，取樣后補充相同體積的新鮮培養(yǎng)基，以減少誤差。

2 實驗原理及方案

2.1 產(chǎn)氨細菌浸礦原理

Groudeva 等[10]曾使用尿素分解細菌進行過碳酸鹽型銅礦浸出實驗。研究顯示，堿性產(chǎn)氨菌株通過分解尿素產(chǎn)氨，溶液中存在微生物對脈石的侵蝕作用、氨與銅的各類礦石的絡(luò)合作用、堿性細菌的氧化還原作用、某些大分子蛋白質(zhì)和胞外多聚物（EPS）的絡(luò)合作用，礦漿中主要發(fā)生的反應(yīng)有：

2.2 Plackett-Burman實驗

根據(jù)前期單因素實驗，得到了影響堿性產(chǎn)氨細菌的浸出率可能因素，對包括A-檸檬酸鈉、B-Na2HPO4、C-KH2PO4、D-MgSO4、E-初始pH值、F-搖床轉(zhuǎn)速、G-溫度、H-接種量在內(nèi)的9個因素進行考察，選用N=11的PB設(shè)計，為考慮誤差，設(shè)置3個虛擬組，每個因素取高低兩個水平，+1表示高水平、-1表示低水平。利用design-expert軟件對實驗結(jié)果進行各因素的顯著性分析，選取P<0.05的因素為主要影響因素，得到對浸出率影響最大的幾個因素。

2.3 最陡爬坡實驗

響應(yīng)曲面對方程的擬合只有在所考察區(qū)域相鄰近的區(qū)域內(nèi)才可以充分還原真實情況，而在其他區(qū)域內(nèi)無法獲得響應(yīng)曲面和擬合方程。所以，應(yīng)該在最大浸出率附近區(qū)域內(nèi)建立有效的響應(yīng)曲面方程。本實驗根據(jù)PB實驗結(jié)論確定爬坡方向，根據(jù)各因素響應(yīng)值大小確定爬坡步長。

2.4 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計

在PB實驗得到影響浸出率最顯著因素后，經(jīng)過最陡爬坡實驗確定響應(yīng)曲面實驗區(qū)域，以浸出率為響應(yīng)指標設(shè)計實驗，得到顯著因素與響應(yīng)值的等高線關(guān)系圖與曲面響應(yīng)圖，并用多項式對實驗數(shù)據(jù)進行擬合得到浸出率與顯著因素的經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀?因素3水平Box-Behnken設(shè)計如表2所示：

2.5 優(yōu)化驗證實驗

在最佳浸出條件和原始浸出條件下分別進行實驗，驗證預測模型的準確性與浸礦優(yōu)化效果。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 Plackett-Burman實驗及結(jié)果分析

通過表4方差分析可以看出，8個因素中有3個為顯著因素，其顯著程度為：A-檸檬酸鈉>E-pH值>G-溫度。其中檸檬酸鈉作為浸礦細菌的能源物質(zhì)，起到至關(guān)重要的作用，pH值與溫度則通過影響細菌的生長，從而影響浸出率。

3.2 最陡爬坡實驗結(jié)果及分析

PB實驗擬合出浸出率與8種成分的一階方程為：

Y=-13.97292+2.39633A-0.18556B-0.31500C+0.65833D+1.94958E-0.039042F+0.59183G+0.042500H。一階模型中A、E、G的系數(shù)均為正，可以確定檸檬酸鈉、pH值和溫度的最陡爬坡方向為正，爬坡步長的確定可參考相關(guān)資料[11]。此處確定A步長為2、E的步長為1、溫度步長為5。爬坡實驗結(jié)果表5顯示，浸出率在X+3x到X+4x之間有最高點。因此，選取X+3x為之后中心組合實驗中心點。

3.3 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果及分析

圖1顯示檸檬酸鈉量與pH交互影響的響應(yīng)曲面及等高線圖。由圖可知，在本實驗水平范圍內(nèi)，隨著檸檬酸鈉含量的增大，浸出率隨之提高，最終達到最大值。這是因為檸檬酸鈉為浸礦細菌的能源物質(zhì)，在能源物質(zhì)充足時，可以保證尿素完全水解產(chǎn)氨，并維持細菌活性。檸檬酸鈉超量時，受細菌活性和產(chǎn)氨量的限制，浸出率不會再提升；當檸檬酸鈉量小于14g/L時，無論pH如何變化浸出率都無法達到最高值，當檸檬酸鈉量大于14g/L時，浸出率隨pH增大呈先升高后降低的趨勢，因此應(yīng)該控制檸檬酸鈉量在14g/L以上，浸出率可以達到本實驗最高值。

圖2顯示檸檬酸鈉與溫度的交互影響及響應(yīng)曲面圖，與圖1類似，檸檬酸鈉量對浸出率有決定性影響，當檸檬酸鈉量小于14g/L時無論溫度如何變化都無法達到最高值，當檸檬酸鈉量大于14g/L，溫度在27℃和33℃之間時，浸出率有最高值。

圖3顯示pH與溫度的交互影響及響應(yīng)曲面圖。由圖可以看出，溫度與pH的交互作用明顯，二者存在協(xié)同作用。且在實驗水平范圍內(nèi)，pH值在9～10、溫度在29～33℃時浸出率有最大值。

利用Design Expert軟件進行方差分析和二次多項回歸擬合實驗，以Y（浸出率）為響應(yīng)值，以A（檸檬酸鈉），B（pH），C（溫度）為自變量，擬合得到多元二次回歸方程：

Y=-260.83752+3.08888A+29.53865B+8.25494C-0.45938AB+0.010875AC+0.22450BC+0.12951A2-1.58292B2-0.17152C2

由表7得知，模型的Prob值<0.0001，失擬項（0.0973>0.05），說明該模型回歸極顯著，失擬不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2=99.47%，表明相關(guān)性很好，校正相關(guān)系數(shù)AdjR2=98.87%說明響應(yīng)面98.87%的變化可以由此模型解釋，總體來說，該模型能夠較好的解釋實驗數(shù)據(jù)。

為了獲得最高浸出率，對多元回歸方程模型進行分析，存在穩(wěn)定點：A=15.5，B=9.25，C=30.61，此時模型的預測值為50.8%。

3.4 回歸方程的驗證

為了檢驗?zāi)Ｐ偷念A測的準確性，在最佳浸出條件和原始浸出條件下分別進行實驗，所得實際的浸出率分別為53.26%和42.71%。實際浸出率與模型的預測值較接近，說明模型較好的預測了浸出情況。

4 結(jié)論

（1）采用Plackett-Bruman實驗，得到了對浸出率影響最顯著的三個因素：檸檬酸鈉，初始pH和溫度，并通過最陡爬坡實驗獲得三因素曲面響應(yīng)實驗的中心點：檸檬酸鈉=13.5g/L、pH=11、溫度=35℃。

（2）采用3因素3水平曲面響應(yīng)Box-Behnken設(shè)計，考察了檸檬酸鈉量、初始pH和溫度三個因素對浸出的影響，分析發(fā)現(xiàn)，當檸檬酸鈉大于15g/L、pH在9～10、溫度在29～33℃之間時浸出率有最大值，并獲得了浸出率預測模型。

（3）對浸出模型進行分析，并結(jié)合初始浸出條件獲得優(yōu)化浸出條件：檸檬酸鈉：15.5g/L，pH：9.25，溫度：30.61℃，硫酸鎂：0.2g/L，磷酸二氫鈉2.1g/L，磷酸二氫鉀：1.4g/L， 搖床轉(zhuǎn)速：120r/min，接種量：20%。分別在優(yōu)化浸出條件和原始浸出條件下進行浸出實驗，浸出率分別為：53.26%和42.71%。

參考文獻：

[1]Rohwerder T，Gehrke T，Kinzler K，et al.Bioleaching review part A.J Applied microbiology and biotechnology，2003，63（03）： 239.

[2]Sand W，Gehrke T，Jozsa P G，et al.（Bio） chemistry of bacterial leaching—direct vs.indirect bioleaching.J Hydrometallurgy，2001，59（02）：159.

[3]Willscher S，Bosecker K. Studies on the leaching behaviour of heterotrophic microorganisms isolated from an alkaline slag dump.J Hydrometallurgy，2003，71（01）：257.

[4]熊有為，王洪江，吳愛祥等.堿性微生物浸礦研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].濕法冶金，2012（04）：002.

[5]鞏冠群，陶秀祥，張興等.氧化亞鐵硫桿菌優(yōu)化培養(yǎng)及脫硫的研究[J].中國礦業(yè)大學學報，2006，35（04）：510-514.

[6]郭朝暉，程義，邱冠周等.Pb/Zn 冶煉廢渣中有價金屬生物浸出條件優(yōu)化[J].中國有色金屬學報，2008，18（05）：923-928.

[7]代志凱，張翠，阮征.試驗設(shè)計和優(yōu)化及其在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用[J].微生物學通報，2010，37（06）：894-903.

[8] 郝學財，余曉斌，劉志鈺等.響應(yīng)面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（01）：38-41.

[9]姚高輝，嚴佳龍，王洪江.高含泥氧化銅礦加溫攪拌浸出試驗研究[G].中國科技論文在線，2010，5（11）：855.

[10]Groudeva V I，Krumova K，Groudev S N.Bioleaching of a rich-in-carbonates copper ore at alkaline pH.J Advanced Materials Research，2007（20）：103.

[11]Montgomery D C.實驗設(shè)計與分析[M].人民郵電出版社，2009.

作者簡介：李廣澤（1988-），男，碩士，助理采礦工程師，主要從事采礦工程、巖土力學方面的工作。