莪術(shù)莖尖玻璃化法超低溫保存技術(shù)

吳怡 顧雅坤 符麗 曾琳

摘 要 為莪術(shù)種質(zhì)資源穩(wěn)定保存提供一條新途徑。 以莪術(shù)組培苗莖尖為試材，用玻璃化法進行超低溫保存后， 于25℃用0.1% TTC溶液培養(yǎng)24 h后檢測生活力。結(jié)果表明，切取2～3 mm長、繼代培養(yǎng)60 d的莪術(shù)組培苗莖尖，避光條件下，用含0.3 mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)7 d，室溫下，莖尖用60%的PVS2裝載液裝載10 min，0℃用100%的PVS2玻璃化保護液對莖尖脫水處理30 min，快速投入液氮中進行超低溫保存16 h；取出莖尖于40℃水浴中解凍2 min，室溫下用US溶液洗滌20 min，立即用0.1% TTC溶液于25℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，莪術(shù)莖尖的生活力最高可達100%。表明該方法可用于莪術(shù)種質(zhì)資源的保存。

關(guān)鍵詞 莪術(shù) ；莖尖 ；種質(zhì)資源 ；玻璃化法 ；超低溫保存

中圖分類號 S567.239 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.010

Abstract Shoot tips of tissue cultured Curcuma zedoaria were subcultured， vitrified and cryopreserved to get a new approach for stable conservation of C. zedoaria. The test-tube plantlets of C. zedoaria were subcultured for 60 d， and their shoot tips were cut 2～3 mm long and cultured in the MS solid medium supplemented with 0.3 mol/L sucrose for 7 days in the dark. Then the shoot tips were loaded with 60% PVS2 for 10 min at 25℃， dehydrated for 30 min at 0℃ with 100% PVS2 as vitrification protection solution and placed immediately into liquid nitrogen for cryopreservation for 16 h. The cryopreserved shoot tips were thawed in aqueous bath for 2 min at 40℃， and rinsed with US solution for 20 min at the room temperature. The survival rate of the shoot tips was measured by using 0.1% TTC solution and the highest survival rate was up to 100.00%. This indicates that the vitrified cryopreservation may be used for preservation of germplasm resources of C. zedoaria.

Keywords Curcuma zedoaria ； shoot-tips； germplasm resources ； vitrification ； cryopreservation

莪術(shù)[Curcumazedoaria （Christm.） Rosc.]是姜科（Zingiberaceae）姜黃屬（Curcuma）多年生草本植物[1]。根莖為中藥莪術(shù)，有消食、行氣解郁、止痛破淤及治療婦女血淤閉經(jīng)等功效，其所含姜黃素和揮發(fā)油還具抗氧化和抗腫瘤等作用[2]，姜黃素已被美國國立腫瘤所（NCI）列為第三代癌癥化學預(yù)防藥物[3]；而莪術(shù)中揮發(fā)油主要成分萜類化合物可誘導(dǎo)細胞周期停滯或者凋亡、抑制癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲等[4]。由此可見，莪術(shù)的開發(fā)前景非?？捎^。目前莪術(shù)種質(zhì)資源的保存方法主要為傳統(tǒng)田間種植保存和組織培養(yǎng)保存。但傳統(tǒng)田間種植保存需要占用大面積種植地[5]，易受自然災(zāi)害、病蟲害影響，耗費大，且長期種植將引起種質(zhì)資源退化、變異，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源丟失等；組織培養(yǎng)則需頻繁進行繼代培養(yǎng)，易造成樣品污染、試管苗變異等[5]。因此，探索一種適用于莪術(shù)種質(zhì)資源長期保存的新途徑具有十分重要的意義。

超低溫保存是指在-196℃液氮中保存生物材料的方法[6]。早在1897年，就有人嘗試用-192℃的液態(tài)空氣作為冷凍介質(zhì)保存植物種子，后來由于液氮具有價格便宜、容易制得且性質(zhì)穩(wěn)定等特點而成為常用的超低溫保存冷凍介質(zhì)。超低溫保存具有設(shè)備簡單、容易操作、穩(wěn)定性好及一次處理可以長期保存等諸多優(yōu)點，在保存植物種質(zhì)資源方面，有著無可比擬的優(yōu)勢[5]。目前，已有用液氮保存植物繁殖器官、營養(yǎng)器官、組織培養(yǎng)物、頑拗性或中間型種子等的先例[6]。在藥用植物、果樹以及園藝作物等方面也有諸多研究，如白木香[7]、益智[8-9]、高良姜[10]、降香黃檀、決明[11]、菊芋[12]；蘋果、梨[13]、大蒜[14]、生姜[15]、土豆[16]等。不同植物，其取材、保存、前期處理等各不一樣，但尚未見莪術(shù)種質(zhì)資源玻璃化超低溫保存的相關(guān)研究。本試驗以莪術(shù)莖尖為材料，通過系統(tǒng)的超低溫保存研究，擬建立一套適用于莪術(shù)種質(zhì)資源的保存技術(shù)體系，為莪術(shù)種質(zhì)資源長期穩(wěn)定保存提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

切取溫州莪術(shù)[Curcuma zedoaria （Christm.） Rosc.]（由國家南藥基因資源庫提供）地下莖塊的幼芽進行組織培養(yǎng)，選取無污染、生長狀況良好的試管苗，取莖尖作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 繼代培養(yǎng)

將莪術(shù)試管苗置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含3.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤、1.0 mg/L吲哚乙酸、30 g/L蔗糖、1.0 g/L活性炭、6.5 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基）中分別繼代培養(yǎng)15、30、45、60 d。

1.2.2 預(yù)培養(yǎng)處理

切取長2～3 mm莪術(shù)試管苗莖尖，避光的環(huán)境下用含0.3、0.5、0.7 mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基分別預(yù)培養(yǎng)0、1、3、5、7 d。

1.2.3 裝載液處理

用LS（含2 mol/L甘油、0.4 mol/L蔗糖的MS溶液）或60% PVS2（含0.15 mol/L蔗糖的MS溶液與100% PVS2按體積比40∶60混合）于25℃分別裝載處理0、5、10、15、20、25、30 min。

1.2.4 玻璃化保護液處理

用100% PVS2（含30%甘油、15%乙二醇、15%二甲基亞砜、0.4 mol/L蔗糖的MS溶液），在0℃條件下，分別處理莪術(shù)莖尖15、30、45、60、90 min。

1.2.5 液氮冷凍

將經(jīng)玻璃化保護液處理過的莪術(shù)莖尖迅速投入液氮中冷凍16 h。

1.2.6 水浴解凍及洗滌

取出莪術(shù)莖尖，在40℃水浴中分別解凍1、2、3、5、10 min；于25℃用US溶液（含1.2 mol/L蔗糖的MS溶液）洗滌20 min。

1.2.7 生活力檢測

放入0.1% TTC溶液中，于人工氣候培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)24 h，洗凈后用體視顯微鏡觀察莖尖染色情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗均為單因子試驗，每處理15個帶芽莖尖，3次重復(fù)。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncan法和LSD法進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 莪術(shù)莖尖生活力檢測

由圖1所示，A、B為未進行玻璃化超低溫保存（對照組）莪術(shù)莖尖，C、D為玻璃化超低溫保存后的莪術(shù)莖尖。TTC作為氧化性的氫受體，可被活種子呼吸作用產(chǎn)生的脫氫輔酶還原成紅色的物質(zhì)，即有活性的莖尖會被染成紅色。因此，莖尖染色情況可反映莖尖生活力。

2.2 繼代培養(yǎng)時間對莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

繼代培養(yǎng)能使組織細胞處于相同的生長階段，減少試驗材料個體差異帶來的誤差[15]。由圖2可知，繼代培養(yǎng)60 d，莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力最高；繼代培養(yǎng)45、30 d，二者間超低溫保存生活力差異不顯著；繼代培養(yǎng)15 d，莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力顯著低于其他各處理。

2.3 預(yù)培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基蔗糖濃度及裝載液對莪術(shù)莖尖超低溫保存的影響

預(yù)培養(yǎng)能使莪術(shù)莖尖組織中自由水含量降低，以適應(yīng)超低溫保存的脫水處理，增加細胞膜通透性，使冰凍保護劑快速滲透到細胞內(nèi)。由表1可知，未進行預(yù)培養(yǎng)的莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力為0，可能是由于莖尖中細胞含水量太高，超低溫保存形成大量冰晶造成細胞損傷，導(dǎo)致沒有生活力。當培養(yǎng)基中蔗糖濃度相同時，超低溫保存后生活力隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加而增加，這可能是由于預(yù)培養(yǎng)時間增加，細胞內(nèi)含水量相應(yīng)減少，超低溫保存時形成冰晶越少，細胞損傷越小，生活力越高。預(yù)培養(yǎng)時間為1 d，超低溫保存后生活力隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加先增加后減少。而預(yù)培養(yǎng)時間為3、5、7 d時，超低溫保存后生活力隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加逐漸減少。說明預(yù)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中蔗糖濃度過高，會使莖尖組織失水過多，細胞內(nèi)滲透壓升高，原生質(zhì)體過度收縮，導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡，從而使超低溫保存后生活力反而下降。綜合考慮，莪術(shù)莖尖在蔗糖濃度0.3 mo/ L的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7 d后，用60% PVS2進行裝載處理，超低溫保存后生活力最佳。

2.4 裝載液處理時間對莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

由圖3可知，隨著裝載液（60%PVS2）處理時間的增加，莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力先增加后減少?？赡苁怯捎谘b載液處理莪術(shù)莖尖，使細胞內(nèi)水分減少，增加細胞滲透性。當預(yù)處理時間不夠時，細胞內(nèi)含水量高，在超低溫保存過程中結(jié)冰，不利于莪術(shù)莖尖存活；而預(yù)處理時間太長，細胞過度脫水，超低溫保存前莪術(shù)莖尖就受到了損傷，生活力下降。因此，裝載液處理的最佳時間為10 min。

2.5 玻璃化保護液處理時間對莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

由圖4可知，隨著玻璃化保護液（100% PVS2）處理時間的延長，莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當玻璃化保護液處理30 min時，生活力最高；處理15 min，細胞脫水效果較差，細胞內(nèi)含水量較高，超低溫保存后生活力低；超過30 min，細胞脫水過度，細胞內(nèi)滲透壓升高造成損傷，且隨著處理時間增加，冰凍保護劑乙二醇和二甲基亞砜對細胞毒害作用越明顯，導(dǎo)致超低溫保存后生活力下降?？梢姡ＡЩＷo液對莪術(shù)莖尖的最佳處理時間為30 min。

2.6 40℃水浴解凍時間對莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力的影響

由圖5可知，隨著水浴解凍（40℃）時間的延長，莪術(shù)莖尖超低溫保存生活力先增加后減少，其中解凍時間為2 min時，生活力最高?？赡苁怯捎诖藭r細胞內(nèi)冰晶完全融化，細胞內(nèi)和玻璃化保護液溫度已升至結(jié)冰溫度以上，不會產(chǎn)生二次結(jié)冰的現(xiàn)象或者形成較少冰晶，對莪術(shù)莖尖傷害最小。而解凍時間較短時，玻璃化保護液溫度仍很低，又或細胞內(nèi)冰未完全融化，細胞內(nèi)有可能二次結(jié)冰形成冰晶，細胞受到機械損傷，導(dǎo)致莪術(shù)莖尖超低溫保存后生活力低。而隨著解凍時間的增加，細胞完全解凍，可防止莪術(shù)莖尖在解凍過程中因再次結(jié)冰凍傷，但莖尖在玻璃化保護液中暴露的時間也相應(yīng)增加，冰凍保護劑對莪術(shù)莖尖細胞的毒害作用越明顯，生活力又隨之降低。

3 討論

玻璃化超低溫保存法能長時間保存種質(zhì)資源，且組織材料的生長狀況、脫水程度、迅速冷凍、解凍與超低溫保存后存活率密切相關(guān)。繼代培養(yǎng)能使細胞分裂分化程度保持一致，提高保存的存活率[15]。脫水程度與組織材料預(yù)培養(yǎng)、裝載液和冰凍保護劑處理時間等因素有關(guān)。水浴解凍能使超低溫保存材料連同冰凍保護劑快速越過晶核形成溫度而不形成冰晶或者較少形成冰晶，避免冰晶形成對細胞帶來的機械損傷[17]。

Siliva等[18]對巴西植物Byrsonima莖尖進行15 d繼代培養(yǎng)，玻璃化超低溫保存后再生率最高達90%。王貞等[19]用繼代培養(yǎng)了30 d的圓瓣扶芳藤莖尖進行玻璃化超低溫保存，恢復(fù)培養(yǎng)后成活率為75%。趙艷華等[20]用繼代培養(yǎng)了70 d的蘋果莖尖進行玻璃化超低溫保存，解凍后材料的存活率可穩(wěn)定在60%。用繼代培養(yǎng)了120 d的李試管苗莖尖進行超低溫保存后，存活率在60%以上[21]。本試驗用繼代培養(yǎng)60 d的莪術(shù)組培苗莖尖進行玻璃化法超低溫保存，其生活力最高。

培養(yǎng)基中蔗糖濃度高能降低試驗材料組織細胞的含水量，減少超低溫保存結(jié)冰對細胞膜及細胞器的損傷。Helianthus tuberosus L.莖尖在進行超低溫保存前，用含0.4 mol/L蔗糖的液體MS培養(yǎng)基對莖尖進行3 d預(yù)培養(yǎng)，品種“Shudi”菊芋莖尖存活率和再生率分別高達93%、83%[12]；用含0.3 mol/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基對百合莖尖預(yù)培養(yǎng)1 d，成活率為87.5%[22]；用含0.7 mol/L蔗糖的培養(yǎng)基對李的離體莖尖進行預(yù)培養(yǎng)1 d，存活率達60%以上[21]；用含0.3、0.5、0.7和1.0 mol/L蔗糖的培養(yǎng)基對高山紅景天莖尖預(yù)培養(yǎng)1 d，超低溫保存成活率均接近100%[23]。本試驗用含0.3 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基對莪術(shù)莖尖避光預(yù)培養(yǎng)7 d，再進行玻璃化超低溫保存，生活力最高。

用裝載液和玻璃化保護液處理試驗材料，可使莖尖進一步脫水，有效防止凍害。室溫下用60% PVS1處理懷山藥（Dioscorea opposita Thunb.）帶芽莖尖60 min， 0℃用100% PVS1脫水處理60 min，超低溫保存后成活率為77.14%[24]；25 ℃用LS處理三角葉薯蕷莖尖20 min，0 ℃用100% PVS2脫水90 min，超低溫保存后存活率為83%[25]；用100% PVS2對葡萄莖尖脫水處理30 min，超低溫保存后再生率為57%[26]。本試驗中，25℃用60% PVS2預(yù)處理10 min，0℃用100% PVS2溶液脫水處理30 min，玻璃化超低溫保存的生活力最高。其中，裝載液（60% PVS2）和玻璃化處理液（100%PVS2）均含有冰凍保護劑乙二醇和二甲亞砜，在冷凍時形成玻璃態(tài)，可減少細胞內(nèi)冰晶的形成，防止在冷凍過程中細胞器、細胞膜以及細胞壁凍壞，提高超低溫保存生活力。

解凍方法、解凍時間是影響試驗材料超低溫保存存活率的另一重要因素。生姜玻璃化超低溫保存后，用37～40℃水浴解凍2 min的成活率為57.7%[15]；用38～40℃水浴解凍超低溫保存后秦艽休眠芽的成活率接近100%[27]；王艾平等[28]用25、40、45℃ 3種溫度解凍超低溫保存的紅芽芋莖尖，其中40℃水浴解凍3 min成活率最高，約為80%。李娟[29]對日本小果樹HASKAOP莖尖進行玻璃化超低溫保存研究發(fā)現(xiàn)，40℃水浴解凍60 s，成活率可高達66.67%。本試驗發(fā)現(xiàn)，將玻璃化法超低溫保存后的莪術(shù)莖尖用40℃水浴解凍2 min，生活力最佳。

總之，對莪術(shù)莖尖進行玻璃化超低溫保存是可行的。但該保存法對莪術(shù)的遺傳穩(wěn)定性、藥用成分的表達是否有影響等，還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志委員會. 中國植物志 （第16卷）[M]. 北京：科學出版社，1981.

[2] 王 琰，王慕鄒. 姜黃屬常用中藥的研究進展[J]. 中國藥學雜志，2001，36（2）：80-84.

[3] 王 穎. 中藥郁金姜黃莪術(shù)的化學成分比較研究[D]. 重慶：重慶大學，2014.

[4] Lu J J， Dang Y Y， Huang M， et al. Anti-cancer properties of terpenoids isolated from RhizomaCurcumae--a review[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2012， 43（2）：406-411.

[5] 吳黎明，曾繼吾，彭抒昂，等. 香蕉莖尖的玻璃化法超低溫保存及其植株再生[J]. 園藝學報，2006，33（3）：501-506.

[6] 文 彬. 植物種質(zhì)資源超低溫保存概述[J]. 植物分類與資源學報，2011，33（3）：311-329.

[7] 劉軍民，徐梓勤，徐鴻華，等. 白木香種子的超低溫保存研究[J]. 廣州中醫(yī)藥大學學報，2007，24（5）：414-415.

[8] 曾 琳，何明軍，陳 葵，等. 益智種子超低溫長期保存方法探究[C]//中國作物學會. 中國作物學會作物種子專業(yè)委員會2015年學術(shù)年會會議論文集. 北京：中國作物學會作物種子專業(yè)委員會，2015.

[9] 曾 琳，吳 怡，何明軍，等. 超低溫冷凍對益智種子生理生化特性的影響[J/OL].廣西植物，2017[2017-06-13]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.

1134.Q.20170613.1758.002.html.

[10] 曾 琳，何明軍，陳 葵，等. 高良姜種子超低溫保存研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2014，30（28）：164-168.

[11] 曾 琳，何明軍，顧雅坤，等. 五種豆科藥用植物種子超低溫保存技術(shù)研究[J]. 氨基酸和生物資源，2017，39（1）：42-47.

[12] Zhang J M， Han L， Lu X X， et al. Cryopreservation of Jerusalem artichoke cultivars using an improved droplet-vitrificationmethod[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 2017， 128（3）： 1-11.

[13] Niino T， Sakai A， Yakuwa H， et al. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of apple and pear by vitrification[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 1992， 28（3）： 261-266.

[14] 王艷軍，李錫香，向長萍，等. 大蒜莖尖玻璃化法超低溫保存技術(shù)研究[J]. 園藝學報，2005，32（3）：507-509.

[15] 杜來順，馮建軍，李曉華，等. 生姜玻璃化法超低溫保存技術(shù)[J]. 北方園藝，2014 （13）：123-125.

[16] Chen Q. Study on Cryopreservation Technology of Potato Stem Tip by Vitrification[J]. Heilongjiang Agricultural Sciences， 2014 （8）： 12-17.

[17] 王君暉，黃純農(nóng). 玻璃化法-園藝作物莖尖和分生組織超低溫保存的新途徑-文獻綜述[J]. 園藝學報，1994 （3）：277-282.

[18] Silva L C， Paiva R， Swennen R， et al. Shoot-tip cryopreservation by droplet vitrification of Byrsonimaintermedia A. Juss.： a woody tropical and medicinal plant species from Brazilian cerrado[J]. Cryo Letters， 2013， 34（4）： 338-348.

[19] 王 貞，高健洲，劉 燕. 扶芳藤莖尖的玻璃化法超低溫保存及其植株再生[J]. 植物生理學報，2007，43（2）：303-304.

[20] 趙艷華，周錫明，吳永杰. 蘋果離體莖尖超低溫保存方法的比較[J]. 園藝學報，2003，30（6）：719-721.

[21] 趙艷華，吳雅琴，程和禾，等. 李離體莖尖的超低溫保存[J]. 園藝學報，2008，35（3）：423-426.

[22] Yi J Y， Gian L， Jongwook C， et al. Efficient cryopreservation of Lilium spp. shoot tips using droplet-vitrification[J]. Plant Breeding & Biotechnology， 2013： 131-136.

[23] 劉劍鋒，閻秀峰，程云清，等. 高山紅景天（Rhodiolasachalinensis A.Bor）莖尖包埋-玻璃化法超低溫保存與植株再生[J]. 浙江大學學報，2007，33（3）：265-270.

[24] 李明軍，洪森榮，徐 鑫，等. 懷山藥種質(zhì)資源的玻璃化法超低溫保存[J]. 作物學報，2006，32（2）：288-292.

[25] Mandal B B， Dixit-Sharma S. Cryopreservation of in vitro shoot tips of Dioscoreadeltoidea Wall.， an endangered medicinal plant： effect of cryogenic procedure and storage duration[J]. Cryo Letters， 2007， 28（6）： 460-470.

[26] Ganino T， Silvanini A， Beghé D， et al. Anatomy and osmotic potential of the Vitis rootstock shoot tips recalcitrant to cryopreservation[J]. Biologia Plantarum， 2012， 56（1）： 78-82.

[27] 張延紅. 秦艽和黨參的休眠芽培養(yǎng)與玻璃化超低溫保存研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2013.

[28] 王艾平，尹明華，洪森榮，等. 紅芽芋莖尖的包埋玻璃化法超低溫保存[J]. 植物分類與資源學報，2015，37（6）：801-812.

[29] 李 娟. 日本小果樹HASKAOP離體莖尖玻璃化法超低溫保存的研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2012.