原發(fā)性乳腺彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤臨床和病理特征

汪園園 楊喆 鄧元 常紅云 李曉鋒 張冠軍 劉希

原發(fā)性乳腺彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（primary breast diffuse large B-cell lymphoma，PB-DLBCL）是惡性程度較高的淋巴瘤，約占原發(fā)性乳腺惡性腫瘤的0.5%，占非霍奇金淋巴瘤的1%，占結(jié)外淋巴瘤的3%［1］。由于PB-DLBCL進(jìn)展較快，同時(shí)又較為少見，臨床表現(xiàn)不典型，初診時(shí)難以與乳腺癌或炎癥等疾病區(qū)別，因此需重視對(duì)本病的診治研究，避免誤診漏診。盡管近年來證據(jù)表明，MYC基因重排已成為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）預(yù)后判斷的重要指標(biāo)之一［2］，但在PB-DLBCL中MYC重排的情況仍少見報(bào)道。本研究分析西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院8例PB-DLBCL的臨床、病理組織學(xué)及免疫表型特點(diǎn)，采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)EB病毒編碼的小RNA（epstein-Barr virus-encoded RNA，EBER）的表達(dá)，再使用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測(cè)MYC基因遺傳學(xué)改變，探討PB-DLBCL的臨床病理及MYC基因遺傳學(xué)特征，并進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，以加強(qiáng)對(duì)本病的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年1月至2018年4月在病理科確診的8例PB-DLBCL。參照2008年國際結(jié)外淋巴瘤研究小組［3］提出的原發(fā)性乳腺淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)和2016年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）淋巴組織腫瘤分類修訂版［2］，本研究PB-DLBCL的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①患者無乳腺外惡性淋巴瘤的既往史；②乳腺為病變首發(fā)部位，可伴有同時(shí)性或繼發(fā)性的同側(cè)腋窩淋巴結(jié)累及；③鏡下可見乳腺組織與惡性淋巴組織共存，淋巴瘤細(xì)胞浸潤(rùn)乳腺小葉和導(dǎo)管，而乳腺上皮細(xì)胞無惡變；④高年資病理醫(yī)師復(fù)閱病理切片，滿足2016年WHO淋巴組織腫瘤分類修訂版中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合臨床及影像學(xué)檢查結(jié)果，按照Ann Arbor分期系統(tǒng)，對(duì)納入的病例進(jìn)行分期［4］。

8例PB-DLBCL均為女性患者，發(fā)病年齡34～68歲（平均為53.1歲）。均以發(fā)現(xiàn)乳腺腫物為主訴就診，病程1周～30年。7例患者均無皮膚紅腫、潰瘍，無乳頭糜爛及溢液；1例患者腫物進(jìn)行性增大并伴皮膚紅腫，局部疼痛。所有患者均無發(fā)熱、盜汗和體重下降等淋巴瘤的全身表現(xiàn)即B癥狀。6例患者血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）正常，2例升高，分別為258.4 U/L和261.3 U/L。7例患者為單側(cè)乳腺腫物，其中左側(cè)5例，占62.5%，另1例患者為雙側(cè)乳腺腫物伴淋巴結(jié)累及。腫瘤最大直徑1.8～7.4 cm，平均3.3 cm。行腫物穿刺活檢術(shù)4例，占50%；行腫物局部切除活檢術(shù)2例，占25%；行乳腺單純切除術(shù)2例，占25%。根據(jù)Ann Arbor分期，ⅠEA期5例，ⅡEA期2例，ⅣE期1例（表1）。

表1 8例原發(fā)性乳腺彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的臨床特征Table 1 Clinical features of the 8 cases of primary breast diffuse large B-cell lymphoma

1.2 方法

1.2.1 蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、免疫組織化學(xué)染色和判讀

病變組織均由4%中性福爾馬林液固定、石蠟包埋和HE染色。免疫組織化學(xué)染色方法為檸檬酸緩沖液微波修復(fù)抗原，使用BenchMark Ultra Ventana（Roche公司，瑞士）全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀，按照說明書進(jìn)行EnVision兩步法行免疫組織化學(xué)染色。即用型一抗抗體如下：LCA、CD20、CD79α、CD3、CD10、BCL6、MUM1、BCL2、C-MYC、ALK、CD30、Ki-67、CK，抗體購自北京中杉和福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。染色均設(shè)陽性對(duì)照及陰性對(duì)照。CD10、BCL6、MUM1、BCL2和C-MYC的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)采用半定量法，計(jì)算10個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的平均值。陽性細(xì)胞＞30%時(shí)為CD10、BCL6或MUM1（+），陽性細(xì)胞＞50%時(shí)為BCL2（+）［2，5］；陽性細(xì)胞≥40%為C-MYC（+）［6］。根據(jù)Hans分型法，將入組的PB-DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞型（germinal center B-cell，GCB）和非生發(fā)中心B細(xì)胞型（non-GCB）［5］。

1.2.2 EBER原位雜交

使用EBER原位雜交檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)腫瘤石蠟切片EBV的感染情況。主要步驟為切片脫蠟、水化后，室溫下蛋白酶K消化切片5 min；蒸餾水洗滌后滴加雜交液，在ThermoBrite FISH雜交儀（Abbott Molecular公司，美國）中進(jìn)行雜交，過夜。滴加一抗，37℃孵育30 min，PBS洗滌后加二抗，室溫孵育20 min，PBS洗滌后加HRP，室溫10 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。EBER原位雜交陽性信號(hào)位于細(xì)胞核。

1.2.3 FISH檢測(cè)及判讀

使用MYC雙色分離探針（CytoTest Inc公司，美國）對(duì)腫瘤組織的3 μm石蠟切片進(jìn)行FISH染色，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。主要步驟為組織學(xué)切片脫蠟后，于95℃蒸餾水中煮片20 min；室溫晾干，滴加胃蛋白酶消化液，37℃消化25 min；梯度乙醇（70%、90%和無水乙醇）脫水各3 min。室溫晾干切片后，避光滴加MYC雙色分離探針，蓋好蓋玻片并注意避免產(chǎn)生氣泡，使雜交液分布均勻。橡膠水泥封片后于ThermoBrite FISH雜交儀內(nèi)進(jìn)行變性、雜交過夜。切片洗滌后，滴加DAPI復(fù)染劑到雜交區(qū)，蓋上蓋玻片，利用BX41熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（Olympus公司，日本）和FISH圖像分析軟件進(jìn)行熒光圖像的觀察、采集和分析。按試劑盒說明書判讀標(biāo)準(zhǔn)，MYC正常信號(hào)為紅色和綠色熒光融合的2個(gè)黃色信號(hào)，基因易位時(shí)為1黃1紅1綠信號(hào)，基因擴(kuò)增時(shí)為≥3個(gè)黃色信號(hào)。每個(gè)組織樣本觀察200個(gè)間期細(xì)胞核，計(jì)算異常信號(hào)細(xì)胞的百分比。以5例反應(yīng)性增生淋巴結(jié)標(biāo)本的MYCFISH結(jié)果按如下公式計(jì)算建立本實(shí)驗(yàn)室閾值，陽性閾值=假陽性信號(hào)頻率的平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。按照試劑盒說明書及上述方法得到本實(shí)驗(yàn)室的MYC探針基因易位陽性閾值為4%，MYC基因擴(kuò)增陽性閾值為8%。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)形態(tài)結(jié)果

8例病例中，行腫物局部切除活檢術(shù)及乳腺單純切除術(shù)的4例腫物，病理大體檢查顯示，腫物切面灰白、灰黃及灰紅色，實(shí)性，質(zhì)地細(xì)膩或稍硬，腫物周界不清。

光鏡下見腫瘤細(xì)胞彌漫或略呈結(jié)節(jié)狀浸潤(rùn)乳腺組織，致乳腺正常結(jié)構(gòu)消失，可見殘存的乳腺小葉。2例病例可見松散的腫瘤細(xì)胞圍繞殘余乳腺導(dǎo)管略呈同心圓狀排列（圖1A）。腫瘤細(xì)胞呈中等-大的中心母或免疫母細(xì)胞樣形態(tài)，其間可見散在的小淋巴細(xì)胞（圖1B）。腫瘤細(xì)胞核呈圓形、卵圓形或空泡樣，1例病例的腫瘤細(xì)胞核稍不規(guī)則。核膜增厚，中心母樣腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)較細(xì)，可見多個(gè)靠近核膜的小核仁；免疫母樣腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)較粗，可見位于中心的大核仁。腫瘤細(xì)胞胞漿較少至豐富，嗜堿性。核分裂象多見，并可見病理性核分裂象。8例病例均未見壞死，3例病例伴有間質(zhì)輕度纖維化。

2.2 免疫表型結(jié)果

8例病例的腫瘤細(xì)胞均彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)LCA、CD20（圖1C）和CD79α。5例（62.5%）BCL6陽性、7例（87.5%）MUM1陽性、3例（37.5%）BCL2陽性（圖1D）、3例（37.5%）C-MYC陽性（圖1E）、Ki-67陽性率為65%～95%（圖1F）。腫瘤細(xì)胞均呈CD10、CD3、ALK、CD30和CK陰性。殘余的乳腺導(dǎo)管上皮可見CK陽性。根據(jù)Hans分型，本研究8例PB-DLBCL中，non-GCB型7例（87.5%），GCB型1例（12.5%）。根據(jù)C-MYC和BCL2蛋白表達(dá)結(jié)果，1例為C-MYC和BCL2雙表達(dá)淋巴瘤，Hans分型為non-GCB（表2）。

2.3 EBER原位雜交和MYC FISH結(jié)果

8例病例EBER原位雜交均為陰性，無EBV感染（圖1G）。MYC基因FISH染色結(jié)果顯示，＞96%的細(xì)胞具有正常融合的2個(gè)黃色信號(hào)，8例病例基因易位和基因擴(kuò)增均為陰性（圖1H，表2）。

圖1 原發(fā)性乳腺彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的病理學(xué)染色結(jié)果Figure 1 Pathological staining results of primary breast diffuse large B-cell lymphoma

表2 8例原發(fā)性乳腺彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的病理學(xué)特征Table 2 Pathological features of the 8 cases of primary breast diffuse large B-cell lymphoma

3 討論

發(fā)生在乳腺的淋巴瘤分為原發(fā)性和繼發(fā)性。1972年Wiseman等［7］提出原發(fā)性乳腺淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①有足夠的組織標(biāo)本進(jìn)行診斷，經(jīng)病理確診為淋巴瘤；②發(fā)病時(shí)無乳腺外淋巴瘤病史；③乳腺為首發(fā)部位，除區(qū)域淋巴結(jié)（同側(cè)腋窩和鎖骨上淋巴結(jié)）可受累外，無其他部位累及；④乳腺組織與淋巴瘤組織密切相連。2008年國際結(jié)外淋巴瘤研究小組對(duì)該診斷標(biāo)準(zhǔn)更新為，單側(cè)或雙側(cè)乳腺病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，伴/不伴區(qū)域淋巴結(jié)侵犯［2］。而繼發(fā)性乳腺淋巴瘤是指全身性淋巴瘤繼發(fā)累及乳腺。

原發(fā)性乳腺淋巴瘤少見，Taniguchi等［8］、Ryan等［3］和周智俊等［9］的報(bào)道顯示，DLBCL是原發(fā)性乳腺淋巴瘤中的最常見的類型。由于DLBCL的優(yōu)化管理有時(shí)與腫瘤原發(fā)部位相關(guān)，因此，研究起源于特定結(jié)外部位的DLBCL的獨(dú)特的臨床生物學(xué)行為是十分必要的。正如WHO將原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的DLBCL列為一個(gè)獨(dú)立亞型并進(jìn)行特異性的評(píng)價(jià)和治療［2］，由于PB-DLBCL原發(fā)部位的特殊性，Bierman等［10］和國際結(jié)外淋巴瘤研究小組的Ryan等［3］對(duì)PB-DLBCL是否可作為DLBCL的一個(gè)獨(dú)立亞型進(jìn)行了相關(guān)研究。通過該大宗病例分析，發(fā)現(xiàn)PB-DLBCL具有在對(duì)側(cè)乳腺和其他結(jié)外部位復(fù)發(fā)等獨(dú)特的臨床病理特征［3］。因此，研究分析PB-DLBCL的臨床病理特征，可促進(jìn)臨床病理診治水平的進(jìn)一步提高。

PB-DLBCL好發(fā)于中老年女性，大多數(shù)為單側(cè)乳腺發(fā)病，Ryan等［3］的報(bào)道中，發(fā)病部位為右側(cè)乳腺的占51%，左側(cè)乳腺的占43%，雙側(cè)乳腺約占5%。本組研究中左側(cè)的占62.5%，另有1例發(fā)病于雙側(cè)乳腺。需要注意的是，當(dāng)雙側(cè)乳腺受累時(shí)，需仔細(xì)排除繼發(fā)性乳腺淋巴瘤。PB-DLBCL一般表現(xiàn)為無痛性腫物，與皮膚無粘連，皮膚表面無橘皮樣改變，乳頭無凹陷和溢液，B癥狀少見［3，8-9］。部分病例可出現(xiàn)局部紅腫、不適等，臨床上難與乳腺炎癥鑒別。既往報(bào)道和本組病例術(shù)前大多數(shù)診斷為乳腺癌或炎癥［3，9，11］。Ryan等［3］的報(bào)道中約19%的患者LDH升高，本組有2例病例LDH升高，分別為258.4 U/L和261.3 U/L。根據(jù)1972年Wiseman等［7］提出的原發(fā)性乳腺淋巴瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者分期均為早期，即Ann ArborⅠE（僅表現(xiàn)為乳腺腫物）或ⅡE（乳腺腫物并累及區(qū)域淋巴結(jié)）。累及雙側(cè)乳腺的淋巴瘤分期仍有爭(zhēng)議，研究發(fā)現(xiàn)該類病例侵襲性更強(qiáng)，預(yù)后更差，因此建議將其歸為ⅣE期，約占5%［3］。

PB-DLBCL的確診依靠腫物細(xì)針穿刺、腫物局部切除或乳腺切除術(shù)后的病理學(xué)檢查。其組織學(xué)形態(tài)和免疫表型類似于淋巴結(jié)內(nèi)原發(fā)的DLBCL。組織學(xué)形態(tài)上，乳腺原有結(jié)構(gòu)被破壞，可見中-大的異型腫瘤細(xì)胞彌漫性或略呈結(jié)節(jié)狀浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞間可見殘存的乳腺導(dǎo)管和散在的小淋巴細(xì)胞。部分病例腫瘤細(xì)胞粘附性差，呈單個(gè)散在的或單行條索狀浸潤(rùn)于間質(zhì)中或圍繞乳腺導(dǎo)管，類似乳腺小葉癌的列兵樣排列或靶環(huán)樣結(jié)構(gòu)。腫瘤細(xì)胞大多呈中心母或免疫母細(xì)胞樣形態(tài)，核分裂象易見。腫瘤間質(zhì)可有輕度的纖維化。免疫表型上，腫瘤細(xì)胞表達(dá)淋巴細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)CA和B細(xì)胞標(biāo)記物（CD20和CD79α），而不表達(dá)上皮標(biāo)記物CK［2，11］。本組的8例PB-DLBCL均符合上述病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)細(xì)胞起源，通過基因表達(dá)譜（gene expression profile，GEP）可以將彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分型為GCB和活化B細(xì)胞樣（activated B-cell-like，ABC）［2］。這2種亞型在染色體突變、信號(hào)通路和臨床預(yù)后等方面均存在差異，GCB亞型患者總體生存率好于ABC亞型［12］。但由于GEP尚未常規(guī)開展，因此2016年WHO淋巴組織腫瘤分類修訂版推薦基于CD10、BCL6和MUM1的IHC染色的Hans分型法，作為GEP分型的有效替代［2］。既往研究報(bào)道PB-DLBCL中GCB和non-GCB的比例變化范圍較大，GCB比例可從11.1%～39.3%［8-9，11，13-14］。本研究根據(jù)Hans分型［5］，7例（87.5%）為non-GCB，1例（12.5%）為GCB。2種亞型的預(yù)后意義有待積累更多病例進(jìn)行隨訪和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，具有生發(fā)中心B細(xì)胞免疫表型特征的DLBCL發(fā)生于結(jié)外比如乳腺等部位的病理機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步闡明［11］。

近來研究表明，C-MYC作為癌基因參與了DLBCL的發(fā)生發(fā)展過程，MYC的遺傳學(xué)改變已成為DLBCL預(yù)后判斷的重要指標(biāo)之一［2］。MYC轉(zhuǎn)錄因子可起基因擴(kuò)增和通過調(diào)節(jié)P53凋亡通路下調(diào)腫瘤細(xì)胞增殖能力的雙重作用［15］。當(dāng)用FISH檢測(cè)確定淋巴瘤具有MYC重排伴BCL2重排和/或BCL6重排時(shí)，即為“雙打擊”或“三打擊”淋巴瘤。2016年WHO分類已將其定義為“高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤，伴MYC和BCL2和（或）BCL6重排”，預(yù)后較差［2］。如果淋巴瘤免疫表型呈C-MYC（＞40%）和BCL2（＞50%）陽性而基因重排陰性時(shí)，可歸為“雙表達(dá)”淋巴瘤，預(yù)后也不良，但稍好于“雙打擊”或“三打擊”淋巴瘤［2，16-17］。因此在DLBCL中檢測(cè)MYC的遺傳學(xué)改變對(duì)指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。然而，我們注意到，盡管7%～21%的DLBCL可發(fā)生MYC基因重排［15］，在Taniguchi等［8］及本研究的報(bào)道中，PB-DLBCL均呈MYC基因重排FISH檢測(cè)陰性，同時(shí)少數(shù)病例可呈C-MYC免疫表型陽性。目前，由于病例數(shù)有限，仍需累積病例進(jìn)一步分析MYC基因在PB-DLBCL中的重排情況及與預(yù)后的關(guān)系。

綜上，PB-DLBCL是原發(fā)于乳腺的少見的淋巴瘤，臨床表現(xiàn)難與乳腺癌、乳腺炎癥區(qū)別。其確診需依賴病理組織學(xué)和免疫表型分析。組織學(xué)上，PB-DLBCL腫瘤細(xì)胞多表現(xiàn)為中等-大的中心母或免疫母細(xì)胞樣形態(tài)，免疫表型分型大部分為non-GCB。目前研究尚未見PB-DLBCL中MYC基因重排陽性報(bào)道。PB-DLBCL的遺傳性特征仍需積累病例進(jìn)一步分析，特別是MYC基因重排在PB-DLBCL中的發(fā)生比例和意義。