幾種茶葉提取物對高脂飲食小鼠肥胖的預防作用

鄭 麗，侯彩云,,*，任發(fā)政

近年，靜態(tài)生活方式和高脂飲食模式使得肥胖癥發(fā)生率在世界范圍內不斷增加。肥胖可引起的糖脂代謝異常，與心腦血管疾病、Ⅱ型糖尿病、骨關節(jié)炎、多種癌癥和哮喘等的發(fā)生密切相關[1-2]，嚴重威脅人類的身體健康。自然界存在多種具有減肥功效的天然植物[3-4]，其中，茶葉含有豐富的活性物質，具有減肥、改善脂代謝的生理活性[5-7]。有關綠茶、紅茶、黑茶和烏龍茶的減肥功效研究較多[8-9]。民間也盛傳白茶具有降壓減脂、解油膩過多和緩解消化功能障礙等保健功能，但沒有足夠科學文獻的支持?；趯Π撞枋欠衲茴A防高脂飲食誘導的肥胖發(fā)生，以及如果白茶具有預防肥胖功效，其與綠茶和紅茶的效果又有何區(qū)別的疑問，本研究選取安吉白茶、白琳工夫和壽眉分別作為白茶、紅茶和綠茶的代表，通過動物實驗，對此3 種茶葉提取物和白茶茶湯的預防肥胖功效及其安全性進行評價和對比。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性C57BL/6J小鼠（許可證號SCXK（京）2012-0001） 北京維通利華實驗動物技術有限公司；小鼠維持飼料、小鼠60 kcal%高脂營養(yǎng)飼料（許可證號SCXK（京）2014-0008） 北京華富康生物科技股份有限公司。

選取市售安吉白茶、壽眉和白琳工夫茶作為白茶、綠茶和紅茶代表，制備茶葉提取物。

異丙醇、氯仿、無水乙醇（分析純） 北京化工廠；DEPC水 北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑 碧云天生物技術研究所；5×All-In-One RT MasterMix試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix-No Dye試劑盒 美國ABM公司；小鼠GAPDH內參引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004分析天平 上海精密科學儀器有限公司；中藥超細粉碎機 溫嶺市邁邦機械設備有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；SHZ-III循環(huán)水真空泵、RE-52AA真空旋轉蒸發(fā)儀上海振捷實驗設備有限公司；Nanodrop 2000核酸蛋白檢測儀 美國Thermo Fisher公司；T-personal梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀德國Biometra公司；LightCycler 96熒光定量PCR儀瑞士Roche公司；54180R低溫超速離心機 德國Eppendorf公司；LX-200掌式離心機 海門市其林貝爾儀器；制冰機 北京天林恒泰科技有限公司；雙人單面超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物與茶湯制備

將茶葉用中藥粉碎機磨碎并過40 目篩備用，精確稱取粉碎茶樣。參考保健食品功能學評價程序與檢驗方法規(guī)范中對動物實驗受試物的制備方法[10]，按照1∶15（V/V）茶水比，95 ℃水浴浸提30 min，過濾，浸提兩次，合并茶湯冷卻至約50～60 ℃后，58 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥36 h得到綠茶提取物（green tea extract，GTE）、紅茶提取物（black tea extract，BTE）和白茶提取物（white tea extract，WTE），密封包裝，－20 ℃保存?zhèn)溆谩＞_稱取茶樣，按照3 g/400 mL加入沸水，沖泡10 min，過濾，冷卻至室溫得到白茶茶湯（white tea infusion，WTI）。WTE、GTE、BTE和WTI主要功效成分見表1。

表1 WTE、GTE、BTE和WTI主要功效成分Table 1 Major bioactive components in WTE, GTE, BTE and WTI

1.3.2 實驗動物分組與飼養(yǎng)

小鼠于標準條件動物房（溫度（23±2）℃、相對濕度（50±5）%、壓差20～50 Pa、12/12 h光暗循環(huán)）適應性喂養(yǎng)7 d后，按照體質量隨機分為6 組：正常對照組（NC）、模型對照組（HC）、GTE干預組（GTE）、BTE干預組（BTE）、WTE干預組（WTE）和WTI干預組（WTI）。NC組給予繁殖飼料，HC組給予60%高脂飼料構建肥胖模型，以最終體質量均值比NC組小鼠高20%為造模成功，其余各組小鼠均給予60%高脂飼料。按照0.2 mL/10 g的灌胃量[11]，HC組和WTI組以蒸餾水灌胃，GTE、BTE和WTE組以相當茶葉劑量的GTE、BTE和WTE灌胃，WTI組以茶湯代替飲水。茶湯每日一換，灌胃時間固定為晚上8：00。

劑量設置：茶葉人體推薦劑量為60 kg標準體質量成人每日9.0 g，即0.15 g/kg[12]。參照保健食品功能學評價程序與檢驗方法規(guī)范，設置人體推薦量的10 倍為小鼠攝入劑量，查黃繼漢等[13]的劑量折算表，得小鼠和人的劑量換算系數(shù)為0.081，按照小鼠日飲水量4～7 mL[14]，得小鼠茶湯攝入質量濃度為3 g/400 mL。

表2 實驗動物分組Table 2 Grouping of experimental animals

1.3.3 樣品采集和檢測

1.3.3.1 常規(guī)指標檢測

每周測量體質量和攝食量，實驗結束后，按照繁殖飼料14.57 kJ/g和高脂飼料21.93 kJ/g計算各組的總能量攝入量。準確稱量附睪脂肪、腎周脂肪及皮下脂肪組織濕質量。

1.3.3.2 組織病理學觀察

切取肝臟同葉組織、皮下脂肪組織各約0.5 cm3，迅速置于組織固定液，固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察肝臟組織的脂肪沉積情況，觀察脂肪細胞形態(tài)及其脂肪積累情況，應用Image-Pro Plus 6.0軟件于200 倍視野下統(tǒng)計皮下脂肪細胞直徑。

1.3.3.3 生化指標檢測

血樣經4 ℃、5 000 r/min離心15 min，分離血清樣本，全自動生化分析儀測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白-膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白-膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平，谷丙轉氨酶（alanine transferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）活力，按試劑盒說明書要求進行測定。

1.3.3.4 實時熒光定量PCR檢測

TRIzol試劑抽提小鼠肝臟總RNA，檢測RNA濃度及質量，反轉錄制備cDNA第一鏈。PCR體系（20 μL）：EvaGreen 2× qPCR MasterMix-No Dye10 μL、cDNA模板1 μL、上游引物（10 nmol/L）0.6 μL、下游引物（10 nmol/L）0.6 μL、ddH2O補充至20 μL。按照梯度程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，循環(huán)35 次。以GAPDH為內參基因，采用delta delta Ct法[15]對各脂代謝相關基因的表達水平進行分析。

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶-A羧化酶1（acetyl-coenzyme A carboxylase 1，ACC1）、肝臟肉毒堿棕櫚?；D移酶-1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferative activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）基因引物由Primer premier 5.0軟件設計，引物序列如表3所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，以 ±s表示；方差分析采用LSD或Tamhane’s T2（M）方法檢測，P＜0.05定義為差異顯著。圖像采用Origin 8.0軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 GTE、BTE、WTE和WTI對小鼠體質量、脂肪組織的影響

圖1 GTE、BTE、WTE與WTI對小鼠體質量和脂肪組織的影響Fig. 1 Effects of GTE, BTE, WTE and WTI on body mass, total energy intake, wet mass of adipose tissue and subcutaneous adipocyte diameter of mice in each experimental group

如圖1A所示，實驗初始，各組小鼠體質量無顯著性差異（P＞0.05）。8 周實驗結束時，HC組小鼠體質量平均值（32.4 g）高出NC組（22.7 g）42.72%，并顯著高于GTE、BTE和WTE干預組小鼠體質量平均值（分別為24.59、27.63、24.85 g），成功建立預肥胖模型。

對小鼠攝食量進行分析發(fā)現(xiàn)，除WTI組外，其余各組小鼠食欲均無顯著性差別（圖未列出），這導致高脂飲食的HC、GTE、BTE和WTE組小鼠的總能量攝入量均顯著高于正常飲食的NC組（P＜0.05）。其中，GTE、BTE和WTE組與HC組無顯著性差異（圖1B）。但由圖1A可知，GTE和WTE組小鼠體質量均顯著低于HC組，與NC組無顯著性差異。BTE組小鼠體質量也低于HC組（P＞0.05）。三者可將高脂飲食引起的體質量增長分別降低22.49%、21.23%和9.03%，GTE和WTE甚至可將高脂飲食小鼠體質量維持在正常水平，BTE雖能抑制高脂飲食小鼠的體質量增長，但效果不顯著。由此可見，GTE、WTE和BTE可能通過抑制機體對高脂飲食中能量的消化吸收，或增加機體能耗、抑制脂肪生成，從而有效預防肥胖的發(fā)生。另外，WTI可顯著提高小鼠的食欲，故該組小鼠總能量攝入量極顯著高于NC組，甚至極顯著高于HC組（P＜0.01）。這也可能是WTI未能有效預防高脂飲食引起的肥胖發(fā)生的根本原因。

為進一步驗證GTE、BTE、WTE和WTI對脂肪組織作用，計算了小鼠皮下脂肪、附睪脂肪和腎周脂肪組織濕質量，并對小鼠皮下脂肪組織進行病理學切片觀察。脂肪濕質量統(tǒng)計結果如圖1C所示，高脂飲食可顯著升高小鼠的脂肪濕質量（P＜0.05），HC組小鼠脂肪濕質量是NC組6.28 倍，GET和WTE可將高脂飲食引起的脂肪濕質量升高分別降低44.01%和51.45%，而BTE組脂肪濕質量不降反升，雖未表現(xiàn)出顯著性差異，但由此可見，BTE不能抑制高脂飲食引起的脂肪組織增長作用。WTI組脂肪濕質量與體質量統(tǒng)計結果一致，小鼠脂肪濕質量顯著高于NC組和HC組（P＜0.05）。

圖2 小鼠皮下脂肪組織病理學變化Fig. 2 Histopathological change of subcutaneous fatty tissues in mice

如圖2所示，NC組脂肪細胞大小均一、形態(tài)規(guī)則、邊界清晰、排列整齊致密。HC組和WTI組脂肪細胞大小不一，絕大多數(shù)細胞出現(xiàn)充脂，體積增大，出現(xiàn)不同程度的分化。GTE和WTE組脂肪細胞與正常對照組相似，BTE組部分脂肪細胞出現(xiàn)充脂和體積增大。皮下脂肪細胞直徑統(tǒng)計結果顯示（圖1D），GTE和WTE組皮下脂肪細胞直徑均極顯著低于HC組（P＜0.01），與NC組無顯著性差異。BTE組脂肪細胞直徑介于NC組和HC組之間（P＞0.05）。WTI組小鼠脂肪細胞直徑與HC無顯著性差異。由此可見，GTE和WTE均能有效抑制脂肪組織中的脂肪積累和脂肪細胞分化，從而有效預防高脂飲食小鼠肥胖的發(fā)生，而在本研究所設劑量條件下，BTE對脂肪細胞分化無顯著的抑制作用，WTI反而能促進脂肪細胞分化。

2.2 GTE、BTE、WTE和WTI對小鼠血脂水平的影響

圖3 GTE、BTE、WTE與WTI對小鼠血脂的影響Fig. 3 Effects of GTE, BTE, WTE and WTI on serum lipid profiles of mice in each experimental group

如圖3所示，與NC組相比，各高脂飲食組小鼠血清TC和LDL-C水平顯著升高，而GTE、BTE、WTE和WTI未對其升高產生顯著抑制作用。另外，除BTE組小鼠血清TG水平顯著高于HC組外，其余各組血清TG水平均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 GTE、BTE、WTE和WTI對小鼠肝臟組織的影響

解剖過程中觀察肝臟形態(tài)和顏色，發(fā)現(xiàn)NC組小鼠肝臟呈有光澤的暗紅色，無油膩感，形態(tài)規(guī)則，邊緣銳利，切面有顆粒感；HC和WTI組小鼠肝臟顏色為黃褐色，切面有油膩感。GTE和WTE組小鼠肝臟與NC組相似。

圖4 小鼠肝臟組織病理學變化Fig. 4 Histopathological change of liver in mice

肝臟病理學切片的蘇木精-伊紅染色結果顯示，NC組肝竇清晰可見，切面肝索排列整齊有序、肝細胞排列整齊、胞漿均勻，細胞核清晰可見，未見脂滴，且無變性壞死。HC組肝竇明顯縮小，甚至消失不見，切面肝索排列混亂無序，部分肝細胞出現(xiàn)腫脹，排列混亂，細胞之間界限模糊，細胞內出現(xiàn)大量脂滴空泡。GTE和WTE組小鼠肝細胞與NC組相似，均處于良好狀態(tài)，而BTE組小鼠肝臟細胞中出現(xiàn)明顯小型脂滴空泡，WTI組小鼠的肝細胞與HC組相似，出現(xiàn)大量的脂滴空泡（圖4）。

可見，高脂飲食可引起小鼠肝細胞脂肪變性。GTE和WTE能有效預防高脂飲食誘導的脂肪肝的發(fā)生。BTE可緩解高脂飲食引起的肝細胞脂肪變性，而WTI不能預防高脂飲食誘導的脂肪肝的發(fā)生。

2.4 GTE、BTE和WTE對小鼠肝臟脂代謝相關基因表達的影響

為探究GTE、BTE和WTE預防肥胖及脂肪肝發(fā)生的機制，本實驗對小鼠肝臟脂代謝相關基因的相對表達進行定量分析。

圖5 GTE、BTE、WTE與WTI對小鼠肝臟脂代謝相關基因表達的影響Fig. 5 Effects of GTE, BTE, WTE and WTI on the expression levels of lipid metabolism-related genes

由圖5A、B可知，高脂飲食導致小鼠肝臟FAS和ACC1表達水平顯著升高，分別是NC組的1.60 倍和1.67 倍，GTE和WTE干預使FAS和ACC1基因表達水平顯著降低（P＜0.05）。與HC組相比，GTE使兩基因表達水平分別降低36.03%和30.89%，WTE使兩基因表達水平分別降低41.43%和38.05%。BTE也能使FAS和ACC1基因表達水平下降（P＞0.05），分別降低25.73%和28.21%。WTI對FAS和ACC1表達水平無顯著影響。

由圖5C、D可知，高脂飲食可抑制肝臟CPT-1的表達（P＞0.05），其表達水平下降18.51%。GTE、BTE和WTE均可顯著提高CPT-1的表達水平（P＜0.05），分別提高242.73%、192.45%和240.21%。高脂飲食可抑制PGC-1α在肝臟中的表達，GTE、BTE和WTE均能提高PGC-1α的表達水平，但均未達到顯著性水平。WTI對CPT-1和PGC-1α表達水平也無顯著影響。

2.5 茶葉提取物的安全性評價

由圖1可知，GTE、BTE和WTE組小鼠體質量均未顯著低于NC組，故本實驗所設劑量的GTE、BTE和WTE對小鼠生長無抑制作用。

另外，由表4可知，GTE、BTE和WTE組小鼠血清AST和ALT水平與NC組小鼠無顯著性差異（P＞0.05），結合圖4可知，3 組小鼠肝臟均處于良好狀態(tài)。故GTE、BTE和WTE組小鼠肝臟未產生毒性反應。綜上所述，在本實驗所設劑量條件下，GTE、BTE和WTE并無生長抑制作用和肝毒性。

3 討 論

肥胖是機體攝入能量超過所需，多余能量以脂肪形式貯存于體內，尤其是下腹部與臀部，達到損害身體健康的程度的疾病[16]。體質量超過標準體質量的10%～19%者為超重，超過20%者則為肥胖?！吨袊扇顺嘏c肥胖癥預防與控制指南》建議，對肥胖癥的干預應堅持以預防為主[17]。本研究模擬高脂飲食結構，以60%高脂飼料飼喂C57BL/6J小鼠，最終誘導HC組小鼠體質量高出NC組42.72%，成功建立預肥胖模型。

高脂飲食可促進脂肪組織中脂肪積累和脂肪細胞分化，GTE和WTE均能有效抑制脂肪組織中的脂肪積累和脂肪細胞分化，從而防止脂肪組織增長，進而有效預防高脂飲食小鼠肥胖的發(fā)生，而BTE對脂肪細胞分化無顯著的抑制作用，這可能也是BTE對小鼠體質量增長無顯著抑制作用的主要原因，而WTI反而能促進脂肪細胞分化。另外，高脂飲食能上調肝臟中FAS和ACC1轉錄水平，F(xiàn)AS和ACC1是脂肪酸從頭合成的關鍵酶，肝臟超表達FAS和ACC1則促進脂肪酸合成和脂肪積累，從而引起脂肪肝變性[18]。高脂飲食還能使CPT-1轉錄水平降低，CPT-1是脂肪酸氧化的限速酶，催化長鏈脂肪酸進入線粒體內部進行β氧化。肝臟CPT-1表達水平下降可導致長鏈脂肪酸β氧化發(fā)生障礙，最終導致大量脂質堆積[19-20]；與之相反，肝臟CPT-1表達量上升可促使脂肪堆積及分泌顯著降低[21]。GTE、BTE和WTE能通過抑制FAS和ACC1表達，促進CPT-1的表達，抑制肝臟脂肪酸合成和脂肪積累，促進脂肪酸氧化，進而有效預防高脂飲食結構下小鼠肥胖和脂肪肝的發(fā)生。BTE也具有預防肥胖發(fā)生的趨勢，但其效果短周期內未表現(xiàn)出顯著性。除CPT-1外，PGC-1α是肝臟中調控脂肪酸氧化的關鍵調節(jié)因子，PGC-1α表達水平下降會導致肝細胞脂肪酸氧化率降低和線粒體呼吸率下降[22]。另外，PGC-1α還可通過PPARα調節(jié)PPAR介導編碼的脂肪代謝相關基因如CPT-1、FAS等的表達[23]。本實驗結果顯示，GTE、BTE和WTE可促進肝臟中PGC-1α轉錄水平升高，但未達到顯著性水平。

值得注意的是，GTE、WTE和BTE預防肥胖作用機制存在差異，BTE主要是通過改善肝臟脂代謝相關基因的表達，而非通過抑制脂肪組織增長來實現(xiàn)的，并且BTE從轉錄水平上對上述基因的調節(jié)作用較小，這也可能是BTE組體質量、脂肪濕質量等指標顯著高于WTE和GTE組，并且小鼠出現(xiàn)輕度脂肪肝趨勢的根本原因。另外，與WTE完全不同，本研究所設濃度條件下，WTI未能預防高脂飲食誘導的肥胖的發(fā)生，反而有一定程度的促進作用。究其原因，WTI顯著增加小鼠食欲，導致其總能量攝入量極顯著高HC組，過剩能量以脂肪形式儲存在脂肪組織，并最終導致小鼠肥胖和脂肪肝的發(fā)生。由此可見，茶葉預防肥胖效果的發(fā)揮，與茶葉種類和攝入方式等都密切相關。

除茶葉種類和攝入方式外，攝入劑量與茶葉預防肥胖效果的發(fā)揮也息息相關。本實驗選取3 g/400 mL的WTI與WTE進行對比，評價茶湯預防肥胖功效。發(fā)現(xiàn)此劑量WTI對高脂飲食誘導的體質量增長、脂肪增長和脂肪肝等均無改善作用。其實，小鼠每日攝入3 g/400 mL的茶湯量相當于標準體質量60 kg的成人每天攝入7.29～12.76 g茶葉。事實上，絕大多數(shù)成人茶葉日攝入量為5～10 g/d，少數(shù)人飲茶量較大，可達20 g/d[24]。初步確定，高脂飲食結構下，按日常飲用量攝入低濃度WTI，短期內不能達到預防肥胖的效果。因此，茶葉攝入量過低不能預防肥胖的發(fā)生。而且，茶葉攝入劑量過高還可能產生毒副作用[25]，最新研究顯示，高劑量的綠茶多酚可造成果蠅發(fā)育遲緩和生殖功能損傷[26]，持續(xù)6 個月攝取800 mg/d茶多酚使受試者產生肝中毒[27]。本實驗小鼠的茶葉攝入劑量為1.5 g/kg，按提取率折算得茶多酚攝入劑量為116～158 mg/kg，相當于標準體質量60 kg的成人每日攝入562～768 mg茶多酚，并且安全性評價也顯示，GTE、BTE和WTE組小鼠體質量增長并未受到抑制，且血轉氨酶水平正常，故本實驗所設GTE、BTE和WTE的劑量為安全劑量，無生長抑制作用和肝毒性。

另外，本研究中GTE、BTE和WTE未能有效控制高脂飲食誘導的血清TC和LDL-C濃度升高。其實C57BL/6J小鼠對高脂飼料極為敏感，容易形成高脂血癥。C57BL/6J小鼠血清TC和LDL-C水平在高脂飲食第3～11周內，穩(wěn)定為正常小鼠的2.4 倍和6.2 倍，停止高脂飲食5 周后，在無任何干預條件下恢復正常水平[28]。另有研究顯示，7 周綠茶干預不能預防高脂飲食誘導的血脂水平升高，而14 周甚至更長周期的綠茶干預可顯著抑制血脂水平升高[29-31]。故本實驗周期較短可能是導致茶葉提取物未能發(fā)揮預防血脂升高作用的原因。另外，高脂飲食導致HDL-C水平顯著升高，初步確認為高脂飲食導致小鼠血膽固醇水平升高，從而引起HDL-C水平代償性升高，以清除血膽固醇，保持循環(huán)系統(tǒng)膽固醇平衡。